李啟彭，李成楊，祁 岑，沈燕瓊

（1.昭通學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南昭通 657000；2.昭通市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，云南昭通 657000）

昭通葡萄中黃酮提取工藝及含量測定

李啟彭1，李成楊1，祁 岑1，沈燕瓊2*

（1.昭通學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南昭通 657000；2.昭通市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，云南昭通 657000）

分別設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化昭通葡萄中黃酮的提取工藝，并采用紫外分光光度法測定其含量。研究結(jié)果表明，最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比為1：10，提取90 min，提取溫度80℃。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)溶液，在510 nm處測定昭通葡萄的黃酮含量，該方法的回收率為98.6%～110.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1%，可作為葡萄中黃酮的提取工藝及含量測定的新方法。

昭通葡萄；黃酮；提取工藝；含量測定

葡萄（Vitisυinifera L）又稱提子，是落葉木質(zhì)藤本植物，果實(shí)不僅美味可口，而且富含維生素、黃酮和各種氨基酸等營養(yǎng)成分，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值［1-2］。其中，黃酮類化合物對“三高”有一定療效，也具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈和腦血管等功效［3-6］。黃酮的提取方法主要有回流法，超聲波提取法和超臨界萃取法，測定方法主要有紫外分光光度法、高效液相色譜法和比色法等［7-10］。目前，關(guān)于葡萄中黃酮的提取工藝及測定方法的報(bào)道還比較少，需要建立簡單、易重復(fù)和精度高的提取新工藝和測試方法［11-13］。

云南省昭通的地理和氣候等因素，有利于葡萄的生長，果實(shí)品質(zhì)優(yōu)越，深受人們喜愛。由于黃酮具有良好的藥用價(jià)值，探索昭通葡萄中黃酮的高效提取工藝和快速準(zhǔn)確的測定方法，為昭通葡萄的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試葡萄有紅玫瑰葡萄和巨峰葡萄，均為昭通特產(chǎn)，購買自昭通市農(nóng)貿(mào)市場。新鮮葡萄用清水洗凈，然后剝皮，將果皮和果肉分別烘干，粉碎，過40目篩（孔徑0.42 mm）備用。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及測定

稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品25 mg置于燒杯中，用70%的乙醇溶解，然后轉(zhuǎn)移到100 m L容量瓶中，定容到刻度，即得到0.25 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)液［14］。量取0.25 mg·m L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和10.0 mL分別置于25 mL容量瓶中，分別加入5%NaNO2溶液1 m L搖勻，靜置5 m in，加入1%Al（NO3）3溶液1 m L搖勻，靜置5 min，加入4%NaOH溶液10 mL，用70%乙醇定容，放置10 min［14］。用紫外分光光度計(jì)在460～550 nm間測定溶液的吸光度，得到蘆丁的最大吸收波長曲線和標(biāo)準(zhǔn)溶液的工作曲線。

1.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.1 提取溶劑

分別稱取1 g紅玫瑰葡萄皮在3個(gè)圓底燒瓶中，分別加入10 m L甲醇、乙醇和水，80℃回流提取2 h，冷卻后過濾，濾液轉(zhuǎn)移到50 m L容量瓶中，定容到刻度。分別量取2.0 mL提取液于25 m L容量瓶中，然后加入5%NaNO2溶液1 m L，1%Al（NO3）3溶液1 m L，4%NaOH溶液10 m L，定容到刻度，搖勻，然后在510 nm波長測定其吸光度［14］。

1.3.2 脫脂

分別稱取1 g紅玫瑰葡萄皮置于2個(gè)圓底燒瓶中，一個(gè)瓶內(nèi)加入5 mL石油醚，另外一個(gè)為空白對照，進(jìn)行脫脂處理，研究脫脂和不脫脂對黃酮提取效果的影響［14］。

1.4 正交實(shí)驗(yàn)

設(shè)計(jì)乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）和料液比（D）為4個(gè)主要考察因素，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，選用L9（34）表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)［15］，以葡萄中黃酮的得率為考察指標(biāo)，獲得最佳的提取工藝（表1）。3個(gè)水平1、2、3，分別對應(yīng)A乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%，B提取時(shí)間60、90、120 min，C提取溫度60、70、80℃，D料液比1：10、1：20、1：30 g·m L-1。

1.5 昭通葡萄中黃酮含量的測定及加標(biāo)回收率

在最佳提取工藝條件下，分別稱取1 g（紅玫瑰和巨峰）的果皮和果肉進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，在波長為510 nm下測定其吸光度。按照上述方法重復(fù)3次，并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差［15］。此外，分別在果皮樣品中加入20 mg，葡萄果肉樣品中加入5 mg的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品，在相同條件下進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的選擇及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

隨著掃描波長增加，吸光度逐漸增加，在510 nm波長處出現(xiàn)最大吸收峰；再增加掃描波長，吸光度開始下降，故確定510 nm為蘆丁的最大吸收波長［15］。此外，取510 nm處的吸光度，根據(jù)濃度和吸光度可得回歸方程為：A=10.113 3 C+ 0.033 13，R2=0.999 84，表明濃度為0.017～0.103 mg·m L-1時(shí)，蘆丁濃度和吸光度之間呈線性關(guān)系。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取溶劑

采用乙醇、甲醇、水做提取溶劑，樣品在510 nm處的吸光度分別為0.425、0.208、0.367，故采用乙醇提取效果最好，水次之，甲醇效果最差?？赡芤?yàn)橐掖挤悬c(diǎn)較低且容易揮發(fā)，因此最佳提取溶劑是乙醇［14］。

2.2.2 樣品脫脂

用石油醚進(jìn)行脫脂后，樣品的吸光度為0.481，比不脫脂處理的吸光度（0.243）大，可能因?yàn)樘崛∪軇┠苋芙庵愇镔|(zhì)，降低對黃酮類物質(zhì)的溶解。若對樣品進(jìn)行脫脂處理，可以提高黃酮的得率［14］。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4個(gè)因素對黃酮提取率的影響為D＞B＞C＞A。以得率作為昭通葡萄中黃酮提取的考察指標(biāo)，可以得最優(yōu)提取工藝組合為A2B2C3D1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，提取時(shí)間為90 m in，提取溫度為80℃和料液比為1：10，此時(shí)得率為3.55%（表1）。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.4 葡萄中黃酮含量的測定及加標(biāo)回收率

采用上述最佳提取工藝，提取昭通特色葡萄中的黃酮，并在最佳吸收波長510 nm處，測定提取樣品溶液的吸光度，由回歸方程求出2種葡萄中黃酮的含量。紅玫瑰果皮含量最高為3.52%，巨峰果皮為3.49%，紅玫瑰果肉為0.59%，巨峰果肉為0.49%（表2），表明2種葡萄中果皮黃酮含量比果肉的高，本研究所得數(shù)值比文獻(xiàn)［11-13］稍微偏低。

表2 葡萄樣品中黃酮的含量及加標(biāo)回收率（n=3）

3 小結(jié)

設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取昭通葡萄中的黃酮，并用紫外分光光度法測定其含量。該方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，易重復(fù)且適用于基層實(shí)驗(yàn)室，可作為昭通葡萄中黃酮的提取工藝及含量測定的新方法，為昭通葡萄的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

［1］ 張縱圓，彭秧.葡萄葉中總黃酮的提取工藝研究［J］.生物技術(shù)，2007，17（6）：58-60.

［2］ BRAD K，LIUW，ZHANG Y.Optimization of the extraction of flavonoids from grape leaves by response surfacemethodology［J］.Journal-Chemical Society of Pakistan，2013，35（4）：1103-1105.

［3］ YE L，WANG H，DUNCAN S E，et al.Antioxidant activities of Vine Tea（Ampelopsis g rosseden tata）extract and its major component dihydromyricetin in soybean oil and cooked ground beef［J］.Food Chem istry，2015，172：416-422.

［4］ YING Z，HAN X，LI J.Ultrasound-assisted extraction of polysaccharides from mulberry leaves［J］.Food Chemistry，2011，127（3）：1273-1279.

［5］ 古麗巴哈爾·阿巴拜克力.新疆瑣瑣葡萄葉總黃酮提取工藝及抗氧化活性［J］.食品科學(xué)，2013，34（12）：104-108.

［6］ 庫爾班江·巴拉提，周兆祥.葡萄葉總黃酮的提取及體外抑菌活性研究［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，37（1）：58-62.

［7］ ZHAO S，KWOK K C，LIANG H.Investigation on ultrasound assisted extraction of saikosaponins from Radix Bupleuri［J］. Separation&Purification Technology，2007，55（3）：307-312.

［8］ 魏鳳華，倪艷，宋強(qiáng)，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化葛根總黃酮的提取工藝研究［J］.世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2015，17（1）：261-266.

［9］ 朱德艷.葛根黃酮不同提取方法比較［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（5）：265-267.

［10］ 邊梅娜，李松澤，白紅進(jìn)，等.響應(yīng)面法優(yōu)化赤霞珠葡萄葉總黃酮的提取工藝［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，50（11）：2037-2045.

［11］ 鄭朝華，陳建秋.葡萄皮總黃酮的提取及其對羥基自由基清除作用的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（29）：14486-14487.

［12］ ZHONG G，CHEN Z，MIN Y.Major flavonoids and their antioxidant capacity in grape seeds and skins［J］.Journal of Southwest Agricultural University，2005.

［13］ 尚永輝，孫家娟，劉彬，等.三波長分光光度法測定葡萄籽中總黃酮含量［J］.分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2013，29（5）：706-708.

［14］ 祖麗皮亞·玉努斯.瑣瑣葡萄果實(shí)總黃酮提取工藝［J］.食品科學(xué)，2010，31（24）：159-162.

［15］ 沈燕瓊，李啟彭.會(huì)澤葛根中黃酮提取的優(yōu)化工藝及含量測定［J］.食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2016，7（2）：741-745.

（責(zé)任編輯：侯春曉）

S663.1；TQ463

B

0528-9017（2017）01-0126-02

文獻(xiàn)著錄格式：李啟彭，李成楊，祁岑，等.昭通葡萄中黃酮提取工藝及含量測定［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58（1）：126-128.

10.16178/j.issn.0528-9017.20170140

2016-08-18

昭通學(xué)院校級課題（2016xj35）

李啟彭（1987-），男，云南會(huì)澤人，講師，博士，研究方向?yàn)闊o機(jī)及分析化學(xué)，E-mail：83064313@qq.com。

沈燕瓊，E-mail：184696105@qq.com。