張毅寧

（杭州市學(xué)軍中學(xué)，浙江杭州 310012）

稻葉提取液促進(jìn)蛋白核小球藻的生長和色素合成

張毅寧

（杭州市學(xué)軍中學(xué)，浙江杭州 310012）

蛋白核小球藻是開發(fā)營養(yǎng)食品和藥物的新材料，本文以新鮮稻葉提取液代替蒸餾水配制BG11培養(yǎng)基，研究了不同濃度稻葉提取液對(duì)蛋白核小球藻生長和葉綠素a含量的影響，采用SDS-PAGE技術(shù)分析了藻細(xì)胞蛋白組分變化。結(jié)果表明，稻葉提取液在0.5%～2.0%的濃度范圍內(nèi)均能大幅促進(jìn)蛋白核小球藻的生長，提高藻細(xì)胞葉綠素a的含量，并改變?cè)寮?xì)胞的蛋白組分。培養(yǎng)8 d后，2.0%稻葉提取液處理組藻細(xì)胞濃度是同期對(duì)照組的3.13倍，與1%處理組結(jié)果相似。培養(yǎng)4 d后，所有處理組藻細(xì)胞葉綠素a的含量達(dá)到最大值，其中2.0%稻葉提取液處理組藻細(xì)胞葉綠素a含量高達(dá)14.91 mg·g-1干重，是對(duì)照組的2.58倍。稻葉提取液培養(yǎng)使蛋白核小球藻細(xì)胞8種主要蛋白組分相對(duì)含量降低，同時(shí)產(chǎn)生了4種新蛋白組分。本文結(jié)果為水稻葉片的開發(fā)應(yīng)用和蛋白核小球藻的生產(chǎn)養(yǎng)殖提供了新思路。

稻葉提取液；蛋白核小球藻；生長；葉綠素a；蛋白組分

蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）屬于綠球藻目小球藻科小球藻屬，營養(yǎng)豐富，細(xì)胞干物質(zhì)中蛋白質(zhì)占50%～65%，油脂占5%～10%，碳水化合物占10%～20%，含有大量具有抗氧化活性的維生素，如維生素C和維生素E，被FAO命名為綠色健康食品［1］。從蛋白核小球藻中還分離出具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抑制腫瘤、降血壓、血球凝集素等功效的生物活性成分［2-4］，因此，蛋白核小球藻已成為開發(fā)營養(yǎng)食品和藥物的新材料，我國于2012年批準(zhǔn)人工養(yǎng)殖的蛋白核小球藻為新型食品資源。此外，小球藻油脂產(chǎn)率約是所有陸生作物品種的10～100倍，是開發(fā)生物柴油的優(yōu)質(zhì)原料［5］。如何促進(jìn)蛋白核小球藻生長、提高其生物量已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，天然植物提取液具有促進(jìn)小球藻生長的效應(yīng)。郭長城等［6］從蘆葦粗提液中分離出能促進(jìn)蛋白核小球藻生長的生物活性物質(zhì)；李慶華等［7］發(fā)現(xiàn)，采用低濃度的柳樹葉浸提液培養(yǎng)7 d可使蛋白核小球藻密度提高16.9%～30.9%。應(yīng)用植物粗提物提高小球藻的生物量具有成本低廉、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)小球藻的生產(chǎn)具有重要價(jià)值。

水稻是我國的主要農(nóng)作物，光合作用效率高，植株生長快，分蘗期葉片產(chǎn)量大。Li等［8］報(bào)道水稻秸稈酶解物能顯著促進(jìn)蛋白核小球藻的生長，培養(yǎng)48 h后，蛋白核小球藻生物量和油脂產(chǎn)率均比對(duì)照提高約2倍。本文以分蘗期的水稻鮮葉為材料，初步研究了稻葉提取液對(duì)蛋白核小球藻生長速率、葉綠素a含量和細(xì)胞蛋白質(zhì)組分的影響，為稻葉的應(yīng)用和蛋白核小球藻的開發(fā)提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻品種日本晴種植于浙江省富陽市中國水稻研究所試驗(yàn)基地，取分蘗盛期葉片，置于60℃烘箱中烘干24 h，然后將水稻葉片粉碎，過40目篩（篩孔徑0.25～0.50 mm）得到稻葉干粉，密封于干燥容器中避光備用。蛋白核小球藻藻種購于武漢水生生物研究所淡水藻種庫。

1.2 方法

1.2.1 稻葉提取液的制備

稱取水稻葉片干粉2.5、5、10 g，分別加500 m L蒸餾水在黑暗中室溫（25℃）浸提48 h，提取液用布氏漏斗經(jīng)普通定性濾紙抽慮，用蒸餾水定容至500 m L，得到質(zhì)量比為0.5%、1.0%、2.0%的稻葉提取液。

1.2.2 培養(yǎng)方法

采用BG11基本培養(yǎng)基，處理組以稻葉提取液代替蒸餾水配制BG11培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌后，分裝至100 m L三角瓶中，每瓶50 m L培養(yǎng)基，在無菌條件下分別接入處于對(duì)數(shù)生長期的蛋白核小球藻藻種，細(xì)胞初始接種濃度為2×106個(gè)·mL-1。在溫度為26℃、光照/黑暗為16 h/8 h的光周期條件下培養(yǎng)，早上與晚上各搖瓶1次。于培養(yǎng)的第0、2、4、6、8天進(jìn)行細(xì)胞生長量和葉綠素a含量測定，每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.2.3 小球藻生長量和細(xì)胞葉綠素a含量測定

蛋白核小球藻的生長量測定采用血球板計(jì)數(shù)法和細(xì)胞干重法。30 m L藻細(xì)胞培養(yǎng)液8 000 r· m in-1離心10 min后去上清，在60℃烘箱中干燥至恒重，稱取對(duì)應(yīng)的藻細(xì)胞干重（W）。藻細(xì)胞葉綠素a的提取和含量的測定方法參照文獻(xiàn)［9］。取5 m L藻液，8 000 r·min-1離心10 min，棄上清；將藻細(xì)胞沉淀重懸于5 mL甲醇中，置于4℃冰箱中過夜提取小球藻葉綠素a，次日離心取上清。以甲醇為參比，在波長665 nm處測定吸光度值（D665）。應(yīng)用以下公式計(jì)算細(xì)胞葉綠素a含量：

葉綠素a/（mg·g-1）=13.9×D665/W。

1.2.4 蛋白核小球藻蛋白質(zhì)組分的SDS-PAGE電泳分析

以添加1%稻葉提取液培養(yǎng)至第8天的藻細(xì)胞為材料，蛋白核小球藻蛋白提取根據(jù)王偉等［10］方法略加修改。取30 m L藻培養(yǎng)液于8 000 r·m in-1離心10 min收集藻細(xì)胞，加入300μL SDS樣品提取緩沖液（64 mmol·L-1Tris-HCl，2%SDS，10%甘油，5%巰基乙醇，pH 6.8），通過4次加熱（95℃，2 min）/冷凍（-20℃，5 min）循環(huán)破碎小球藻細(xì)胞，置室溫下浸提0.5 h，然后離心（12 000 r·min-1，5 min）除去不溶物，上清即為蛋白提取液。應(yīng)用文獻(xiàn)［11］的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定，根據(jù)樣品提取液的蛋白濃度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，保證每泳道蛋白上樣量一致，均為30μg。

蛋白組分的SDS-PAGE電泳參照Laemm li方法［12］。分離膠濃度為10%，濃縮膠為5%，電泳后的凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色液染色1 h，再采用脫色液（10%乙醇和10%乙酸）脫色約4 h至條帶清晰，拍照記錄結(jié)果，并根據(jù)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)物遷移率計(jì)算蛋白組分的相對(duì)分子量。蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)物購于Takala公司。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)蛋白核小球藻生長的影響

圖1表明，稻葉提取液在8 d培養(yǎng)期內(nèi)均能促進(jìn)蛋白核小球藻的生長。對(duì)照組小球藻在前2 d增殖緩慢，至第4天增殖開始加速，第8天培養(yǎng)液藻細(xì)胞濃度達(dá)到2.98×107個(gè)·m L-1，較初始接種藻細(xì)胞濃度增加了14.9倍。稻葉提取液在0.5%～2.0%能使小球藻的生長速率明顯加快，第2天時(shí)，3個(gè)處理組藻濃度與對(duì)照組相比顯著增高，說明在培養(yǎng)初期就有促進(jìn)效果。前2 d內(nèi)，0.5%和2.0%稻葉提取液對(duì)小球藻的生長促進(jìn)幅度相近，均低于1.0%添加濃度；第2～4天內(nèi)，小球藻生長速率與稻葉提取液濃度表現(xiàn)為正相關(guān)；此后，1.0%和2.0%稻葉提取液對(duì)小球藻的生長促進(jìn)效應(yīng)相近，顯著高于0.5%稻葉提取液處理組；第8天時(shí)，1.0%和2.0%稻葉浸提物的處理組藻濃度分別達(dá)到9.51×107和9.33×107個(gè)·m L-1，是同期對(duì)照組的3.19和3.13倍。而0.5%低濃度處理組到第6天時(shí)，對(duì)小球藻生長的促進(jìn)效果最大，藻濃度比同期對(duì)照增加了1.42倍，之后趨于平緩。

圖1 稻葉提取液對(duì)蛋白核小球藻藻細(xì)胞生長的影響

2.2 對(duì)蛋白核小球藻葉綠素a含量的影響

8 d培養(yǎng)期內(nèi)稻葉提取液對(duì)蛋白核小球藻細(xì)胞葉綠素a含量的影響結(jié)果如圖2。

圖2 稻葉提取液對(duì)蛋白核小球藻葉綠素a含量的影響

圖2顯示，對(duì)照組蛋白核小球藻在0～8 d生長期內(nèi)，葉綠素a含量在5.26～5.96 mg·g-1變動(dòng)，相對(duì)穩(wěn)定。除0.5%稻葉提取液處理6～8 d對(duì)小球藻葉綠素a含量的影響不明顯之外，其他處理組藻細(xì)胞葉綠素a的含量均有較大幅度提升。前2 d以1.0%稻葉提取液對(duì)藻細(xì)胞葉綠素a含量的促進(jìn)效果最佳，這和小球藻的生長表現(xiàn)一致。第4天，幾乎所有處理組藻細(xì)胞葉綠素a的含量達(dá)到最大峰值，2.0%稻葉提取液處理組藻細(xì)胞葉綠素a含量高達(dá)14.91 mg·g-1干重，同比分別是1.0%和0.5%處理組的1.34和2.09倍，是對(duì)照組的2.58倍。6 d后，1.0%和2.0%稻葉提取液處理組藻細(xì)胞葉綠素a含量增幅開始下降，至8 d時(shí)，仍顯著高于對(duì)照，同比分別是對(duì)照的1.64和2.18倍。

2.3 對(duì)蛋白核小球藻蛋白質(zhì)組分的影響

蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物，與藻類細(xì)胞的生長環(huán)境和生理狀態(tài)密切相關(guān)，培養(yǎng)基中的有效成分可能通過影響細(xì)胞蛋白組分而發(fā)揮功能。以培養(yǎng)至第8天的藻細(xì)胞為材料，應(yīng)用SDS-PAGE技術(shù)分析1%稻葉提取液對(duì)蛋白核小球藻細(xì)胞蛋白組分的影響，結(jié)果如圖3。由于對(duì)照組和處理組電泳時(shí)上樣量均為30μg蛋白，因此電泳圖譜上條帶數(shù)目和顏色深淺的差異能直接反映藻細(xì)胞蛋白組分和相對(duì)含量的變化。

圖3 稻葉提取液對(duì)蛋白核小球藻蛋白質(zhì)組分的影響

從圖3可知，對(duì)照組藻細(xì)胞含有豐富的蛋白質(zhì)組分，分子量分布范圍從14.3～110.5 ku（樣品a）。相比對(duì)照組，經(jīng)稻葉提取液處理的藻細(xì)胞蛋白組分發(fā)生了明顯變化（樣品b），主要表現(xiàn)為分子量大于100.7 ku的條帶和分子量為77.5、63.7、61.2、38.4、19.9、18.4和14.3 ku的變淡或消失，說明這些組分蛋白質(zhì)相對(duì)含量降低；另一方面，稻葉提取液處理組的蛋白核小球藻細(xì)胞46.5 ku蛋白條帶顏色變濃，相對(duì)含量增加，還出現(xiàn)了分子量分別為100.1、98.2、27.3和17.7 ku的4種新蛋白組分。

3 小結(jié)與討論

天然植物提取液中既含有抑制蛋白核小球藻生長的生物活性物質(zhì)，也含有促進(jìn)蛋白核小球藻生長的活性物質(zhì)［6-7］。本文研究發(fā)現(xiàn)，鮮稻葉提取液對(duì)蛋白核小球藻的生長具有顯著的促進(jìn)作用。第8天時(shí)，1.0%和2.0%稻葉浸提物的處理組藻濃度分別達(dá)到同期對(duì)照組的3.19和3.13倍，促進(jìn)效果優(yōu)于前人報(bào)道的蘆葦活性組分（2.79倍）［6］、柳樹葉浸提液（1.31倍）［7］和水稻秸稈酶解液（2.00倍）［8］。稻葉提取液促進(jìn)蛋白核小球藻生長的原因一方面可能是其中的糖類、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)提供了優(yōu)質(zhì)碳源和/或氮源；另一方面稻葉提取液可能含有內(nèi)源激素或其他生物活性成分，這些成分改變了蛋白核小球藻的基因表達(dá)模式，從而加速了細(xì)胞生長和分裂。本研究發(fā)現(xiàn)添加稻葉提取液后，蛋白核小球藻細(xì)胞的蛋白組分確實(shí)發(fā)生了明顯改變，說明稻葉提取液中存在改變?cè)寮?xì)胞基因表達(dá)模式的生物活性物質(zhì)。

藻體中葉綠素a含量往往與藻細(xì)胞生長狀態(tài)和光合作用密切相關(guān)，是藻類生長的特征參數(shù)［6］。本文以藻細(xì)胞干重的葉綠素a含量為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞生長量與細(xì)胞葉綠素a含量的增加趨勢并不完全一致。如在培養(yǎng)的2～4 d，對(duì)照組和稻葉提取液1.0%處理組，藻細(xì)胞仍在增殖，但葉綠素a含量維持恒定；在培養(yǎng)4～8 d，藻細(xì)胞生長量仍在增加，但葉綠素a含量維持恒定之后下降或直接下降，說明稻葉提取液對(duì)藻細(xì)胞分裂速度、細(xì)胞干物質(zhì)積累量和細(xì)胞葉綠素合成的影響并不完全同步。但總體上，稻葉提取液處理能使藻細(xì)胞葉綠素a的含量明顯提高，如第4天，2.0%稻葉提取液處理組藻細(xì)胞葉綠素a含量高達(dá)14.91 mg·g-1，干重同比達(dá)到對(duì)照組的2.58倍，至8 d時(shí)，同比為對(duì)照的2.18倍，效果極為顯著。

本研究表明，稻葉提取液能顯著促進(jìn)蛋白核小球藻的生長，提高其生物量和葉綠素a含量。我國是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國，農(nóng)作物種植面積大，葉片易收獲，將農(nóng)作物葉片提取液應(yīng)用于培養(yǎng)營養(yǎng)物質(zhì)豐富的蛋白核小球藻，這為蛋白核小球藻的生產(chǎn)養(yǎng)殖提供了新思路。

［1］ HU Q，PAN B，XU J，et al.Effects of super critical carbon dioxide extraction conditions on yields and antioxidant activity of Chlorella pyrenoidosa extracts［J］.Journal of Food Engineering，2007，80（4）：997-1001.

［2］ 汪炬，蒲含林，洪岸，等.蛋白核小球藻提取物的抑瘤作用及對(duì)免疫功能的影響［J］.營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2004，26（2）：136-138.

［3］ YANG S C，YANG H Y，YANC Y C，et al.Chlorella pyrenoidosa ameliorated L-NAME-induced hypertension and cardiorenal remodeling in rats［J］.European Journal of Nutrition，2013，52（2）：601-608.

［4］ CHU C Y，HUANG R，LING L P.Purification and characterization of a novel haemagglutinin from Chlorella pyrenoidosa［J］.Journal of Industrial M icrobiology and Biotechnology，2006，33（11）：967-973.

［5］ TATE J J，GUTIERREZ-W ING M T，RUSCH K A，et al. The effects of p lant growth substances and mixed cultures on growth and metabolite production of green algae Chlorella sp.：a review［J］.Journal of Plant Growth Regulation，2012：1-12.

［6］ 郭長城，李鑫，胡洪營.蘆葦生物活性組分對(duì)小球藻生長的促進(jìn)效應(yīng)［J］.中國環(huán)境科學(xué)，2009，29（11）：1186-1189.

［7］ 李慶華，郭沛涌，田美燕，等.柳樹葉浸提液對(duì)蛋白核小球藻的化感作用［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2009，28（5）：884-888.

［8］ LIP，M IAO X，LIR，et al.In situ biodiesel p roduction from fast-growing and high oil con tent Chlorella pyrenoidosa in rice straw hyd rolysate［J］.Journal of Biomedicine and Biotechnology，2011.doi：10.1155/2011/141207.

［9］ LICH IENTHALER H K.Chlorophylls and carotenoids：Pigmenis of photosynthetic biomembranes［J］.Methods in Enzymology，1987，148（1）：350-382.

［10］ 王偉，林均民，王偉崗.不同光質(zhì)下中華盒形藻蛋白質(zhì)合成的SDS-PAGE初步分析［J］.臺(tái)灣海峽，1999，18（1）：67-70.

［11］ BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quan titation of microgram quantities of protein u tilizing the principle of protein-dye binding［J］.Analytical Biochemistry，1976，72（1）：248-254.

［12］ LAEMMLI U K.Cleavage of structural p roteins during the assembly of the head of bacteriophage T4［J］.Natu re，1970，227（5259）：680-685.

（責(zé)任編輯：張瑞麟）

S963

A

0528-9017（2017）01-0176-04

文獻(xiàn)著錄格式：張毅寧.稻葉提取液促進(jìn)蛋白核小球藻的生長和色素合成［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58（1）：176-179.

10.16178/j.issn.0528-9017.20170155

2016-08-30

張毅寧（1999-），男，浙江杭州人，在校學(xué)生，進(jìn)行小球藻應(yīng)用研究科技實(shí)踐活動(dòng)，E-mail：815975625@qq.com。

注：中國水稻研究所國家水稻生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室為本研究提供了水稻材料，杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院于彥春教授在實(shí)驗(yàn)操作和論文寫作方面給予了指導(dǎo)，特此表示感謝！