劉 巖，朱 燕，林天寶，陳金娥，計東風，呂志強

（浙江省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑研究所，浙江杭州 310021）

桑樹APX基因的克隆及在擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化研究

劉 巖，朱 燕，林天寶，陳金娥，計東風，呂志強1*

（浙江省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑研究所，浙江杭州 310021）

利用同源克隆、RACE技術(shù)，克隆到桑樹APX全長為1 207 bp，包含867 bp的開放閱讀框，預測其編碼蛋白分子量為31.83 ku，等電點8.08，與APX家族蛋白具有較高同源性；通過進一步構(gòu)建含MaAPX基因的重組農(nóng)桿菌，再轉(zhuǎn)化擬南芥篩選后，獲得了陽性轉(zhuǎn)基因株，為后續(xù)探究桑樹APX基因功能奠定了基礎(chǔ)。

抗壞血酸過氧化物酶；RACE；桑樹

逆境脅迫常常刺激植物產(chǎn)生活性氧物質(zhì)（reactive oxygen species，ROS），包括超氧陰離子（）、羥基自由基（OH-）、H2O2與單線態(tài)氧等。若未能及時清除，這些ROS便會與蛋白質(zhì)、核酸、脂類等反應(yīng)，引起氧化損傷，導致作物產(chǎn)量和品質(zhì)降低，嚴重時甚至造成植物死亡［1］。

在長期的適應(yīng)過程中，植物已形成了一套復雜的抗氧化防御系統(tǒng)，包括抗氧化酶，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、過氧化氫酶（catalase，CAT），以及非酶類復合物分子，如抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）、甜菜堿、脯氨酸等［2］。其中，APX利用AsA為其電子供體，通過將H2O2催化生成H2O，從而實現(xiàn)對植物內(nèi)源H2O2的清除［3-6］。目前，已有從不同物種中克隆到APX的研究報道，包括擬南芥［7］、大麥［8］、棉花［9］、甜菜［10］、橡膠樹［11］等。不同的研究發(fā)現(xiàn)，在鹽、低溫等脅迫下，擬南芥AtAPX（又稱為APX3）轉(zhuǎn)錄上調(diào)［12］；過量表達擬南芥APX發(fā)現(xiàn)能增強轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性［13］。可見APX基因的鑒定和功能研究對植物品種選育及遺傳改良等方面具有重要意義。

桑樹作為我國的一種古老樹種，一直以來都是家蠶的飼料，是蠶絲產(chǎn)業(yè)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的桑樹研究主要圍繞蠶絲產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)而展開。然而近年來的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，桑樹對鹽堿、干旱和貧瘠等逆境的適應(yīng)性也較強，可以作為鹽堿地綠化及防沙、治沙等生態(tài)治理方面的主要經(jīng)濟樹種，在陜西黃土高原水土保持、新疆沙漠治理、重慶市石漠化治理、北京沙地治理、廣西石漠化治理等生態(tài)建設(shè)中都發(fā)揮重要功效［14］。為此，本研究從桑樹中克隆APX家族基因，與其他來源的APX進行生物信息學比對，再將桑樹APX基因借助農(nóng)桿菌系統(tǒng)轉(zhuǎn)化到擬南芥中，篩選陽性轉(zhuǎn)基因株。這深化了人們對APX家族基因的了解，為桑樹抗逆品種的選育提供了候選參考基因。

1 材料與方法

1.1 植物材料

桑樹品種強桑1號具有高產(chǎn)、廣適、耐瘠的優(yōu)良生產(chǎn)性能［15］，由浙江省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑研究所提供。擬南芥（Col-0）由課題組保存。

1.2 M aAPX全長基因的克隆

1.2.1 RNA抽提和cDNA合成

按照Tranzol Plant（北京全式金生物公司）試劑盒方法提取桑樹葉片總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；3’RACE，5’RACE逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)分別參照Clontech Race kit操作說明進行。

1.2.2 引物設(shè)計

根據(jù)NCBI已經(jīng)登錄的擬南芥（AIR登錄號：AT4G35000.1）、煙草（GenBank登錄號：XM-0009806131.1）、水稻（GenBank登錄號：AY382617.1）、番茄（GenBank登錄號：NM_ 001308331.1）、葡萄（GenBank登錄號：EU280159.1）、楊樹（GenBank登錄號：KF309667.1）APX基因的保守區(qū)，設(shè)計引物F1、R1。再根據(jù)擴增獲得的保守區(qū)cDNA序列設(shè)計3’RACE（F2）和5’RACE（R2）引物，最后設(shè)計引物擴增全長ORF（F3，R3）序列。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。

F1：5′-ATGCTYCGHYTVGCRTGGCA-3′，R1：5′-AABGCDTCYTCATCCTTWGCA-3′；F2：5′-TGCT AAACAAGGTGCACCACATC-3′，R2：5′-GCACCTT GTTTAGCATCTGGTAGTCGCC-3′；F3：5′-ATGGCT TTTCCGGTGGTGGACGCTG-3′，R3：5′-CTATTTCT TTCTTTTGCGAACTTCGTAG-3′。其中Y=C/T，H= A/T/C，V=G/A/C，R=A/G，B=G/T/C，D= G/A/T，W=A/T。

1.2.3 擴增反應(yīng)條件

保守區(qū)段的PCR程序為：94℃變性4 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 m in。3′RACE和5′RACE參照Clontech公司試劑盒說明進行。

1.2.4 序列測定、分析

瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增產(chǎn)物，割膠回收，與pEASY-T1載體鏈接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，挑選克隆，送由上海生工生物工程技術(shù)公司進行測序。

獲得序列用Blast比較，分析MaAPX的基因結(jié)構(gòu)信息。再用ORF finder（http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/gorf/orFig.cgi）預測基因編碼框，以及在線軟件（http：//isoelectric.ovh.org/）分析蛋白分子量和等電點，并通過TMHMM server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預測分析MaAPX蛋白的二級結(jié)構(gòu)。利用軟件DNAMAN 5.2來分析APX蛋白間的進化同源性。

1.3 定量PCR

200 mmol·L-1NaCl每日澆灌，脅迫處理盆栽的強桑1號苗1周后，分別采集脅迫處理組、正常對照組葉片，同上方法抽提RNA進行反轉(zhuǎn)錄后，設(shè)計引物F4（5′ACTCTCACGGCTCCAACAATG 3′）、R4（5′AGATGTCCCTAAGATGTGGTGC 3′）用于定量擴增MaAPX（產(chǎn)物237 bp）、引物F5（5′TTCCTATCTACGAGGGTTATGC 3′）、R5（5′GT CAAGAGCAATGTAAGCCAAT 3′）和F6（5′CCCTG CTATGTATGTGGCTAT 3′）、R6（5′GCTGTGGTGG TGAAAGAGTAA 3′）分別擴增Maactin基因179 bp和Atactin基因225 bp片段作為內(nèi)參。擴增結(jié)果按2-ΔΔCt方法進行統(tǒng)計分析［16］。

1.4 重組載體的構(gòu)建

在引物F3、R3的5′端分別添加XhoⅠ和Bam HⅠ位點，經(jīng)擴增反應(yīng)后，膠回收產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ/Bam HⅠ雙酶切后，亞克隆至FGC-5941載體中，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，涂布含卡那霉素和鏈霉素的雙抗YEP培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48 h后，挑取菌斑進行PCR鑒定。鑒定引物選用特異性的F3、R3引物對，針對菌斑進行菌落PCR鑒定，陽性菌落送測序做進一步的鑒定。

1.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的轉(zhuǎn)化及鑒定

挑取經(jīng)過菌落PCR驗證、含有重組質(zhì)粒的陽性GV3101克隆，加到含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，待D600為0.6時，收集菌體；用5%蔗糖溶液、稀釋重懸菌體，浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，收取轉(zhuǎn)化植株的種子，在含10μg·mL-1BASTA除草劑的MS培養(yǎng)基上篩選陽性苗，并利用定量PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因株的MaAPX轉(zhuǎn)錄表達水平。

1.6 統(tǒng)計分析

利用Excel和SPSS19 version進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，試驗數(shù)據(jù)為3次重復的平均值±標準誤，采用單因素方差分析和最小顯著差異法分析不同數(shù)據(jù)組間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 全長M aAPX cDNA的獲得

利用簡并引物對桑葉cDNA樣品擴增，克隆獲得584 bp長度產(chǎn)物（圖1中A），測序結(jié)果證實該段序列與NCBI登錄的APX家族基因具有高度同源性。據(jù)此序列進行3′和5′RACE擴增，進一步獲得822 bp和429 bp片段。經(jīng)拼接得到全長的MaAPX cDNA序列（圖1中B），序列全長1 207 bp，含一個完整的開放閱讀框867 bp，編碼288個氨基酸，編碼蛋白包含植物過氧化酶結(jié)構(gòu)域（圖1中C），其分子量為31.83 ku；等電點p I 8.08。C端包含一個“AVGVAVAA”典型的富含纈氨酸和丙氨酸的過氧化酶體導肽序列（圖1中B），同時，TMHMM的分析顯示其包含一個跨膜域（圖1中D）。

2.2 桑樹APX的進化比較分析

桑樹MaAPX蛋白與同類蛋白同源性較高，在分析序列中平均高達75.92%。其中，與陸地棉（Gossypium hirsute，GenBank：NP_001314208.1）來源的APX蛋白同源性最高，達86.8%；其次是煙草（GenBank：XP_009804433.1）、番茄（GenBank：NP_001295260.1），分別高達86.4%和85.4%。相比之下，MaAPX與葡萄（GenBank：EU280159.1）、橡膠樹（GenBank：AAO14118.1）、楊樹（GenBank：KF309667.1）同源性相對較低，只有64.3%～65.9%。根據(jù)APX蛋白在不同物種間的保守性差異，繪制出進化樹（圖2）。

圖1 MaAPX的擴增及序列特點

2.3 鹽脅迫下桑樹MaAPX的轉(zhuǎn)錄表達分析

200 mmol·L-1鹽脅迫處理后，檢測MaAPX在盆栽桑樹苗葉片中的轉(zhuǎn)錄表達水平發(fā)現(xiàn)，與正常未脅迫的對照組桑苗相比，脅迫后葉片中MaAPX的轉(zhuǎn)錄表達水平明顯上調(diào)（P＜0.05，圖3），證實MaAPX響應(yīng)鹽脅迫的刺激，參與脅迫條件下的植物適應(yīng)性反應(yīng)。

2.4 重組載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

利用PCR和基因重組技術(shù)，將MaAPX片段構(gòu)建入pFGC5941的Xho I和Bam H I限制性內(nèi)切酶位點之間，經(jīng)酶切和測序鑒定后，成功構(gòu)建獲得重組表達載體pFGC-MaAPX（圖4中A）。轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌，涂布含卡那霉素（50μg·m L-1）和鏈霉素（50μg·m L-1）的抗性平板篩選，利用引物F3、R3，針對生長的農(nóng)桿菌菌落進行PCR檢測，結(jié)果挑選克隆均擴增到特異的MaAPX產(chǎn)物條帶（圖4中B）。

2.5 不同轉(zhuǎn)基因擬南芥株系間的表達豐度檢測

在Basta（10μg·m L-1）抗性的MS培養(yǎng)平板上，轉(zhuǎn)基因植株能正常生長，而未轉(zhuǎn)入基因的植株不能正常萌發(fā)。選擇抗性篩選下長勢良好的幼苗經(jīng)PCR檢測確定陽性后，將獲得株系MaAPX移栽入營養(yǎng)土盆缽中。分別單株收轉(zhuǎn)基因株系種子，重復以上抗性篩選過程，獲得純化轉(zhuǎn)基因株系。利用熒光定量PCR檢測了MaAPX在轉(zhuǎn)基因株系中的轉(zhuǎn)錄表達量（圖5）。

圖2 桑樹MaAPX與幾種已報道APX蛋白的同源性及進化比較

圖3 脅迫后MaAPX在桑葉中的轉(zhuǎn)錄表達

圖4 重組pFGCc-MaAPX的構(gòu)建及在轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌中的PCR檢測

圖5 不同擬南芥轉(zhuǎn)基因株系中的MaAPX表達豐度

3 討論

本研究從目前生產(chǎn)廣泛應(yīng)用的強桑品種中克隆到MaAPX基因，對其進行了一系列的生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)MaAPX具有保守的植物過氧化物酶體結(jié)構(gòu)域（圖1），氨基酸組成上與APX家族蛋白同源性較高（圖2）。MaAPX的C段包含序列“AVGVAVAA”即為典型的富含纈氨酸和丙氨酸的過氧化酶體導肽，Mullen等［17］報道含有這種過氧化物酶體定位導肽的酶錨定在過氧化酶體，蛋白分子向外暴露于胞質(zhì)。推測MaAPX可能也是定位于過氧化酶體的同工酶，與毛白楊相似［18］。雖然同為過氧化酶體定位的APX，桑樹APX與陸地棉、煙草等同源性卻遠高于與毛白楊APX（圖2），由于植物體內(nèi)執(zhí)行過氧化物酶功能的有一大類家族蛋白，不同APX基因在不同物種間可能表現(xiàn)出不同的作用模式。

H2O2是一種重要的活性氧基團，在植物體內(nèi)可由多種刺激（如脅迫、激素等）誘導產(chǎn)生。高濃度的H2O2對細胞具有較強的損傷能力，能夠氧化細胞內(nèi)多種重要的酶分子，甚至損傷DNA，對植物細胞造成不可逆的傷害。鑒于APX可以清除逆境產(chǎn)生的自由基，近年來植物耐逆性研究中的一個熱點就是向植物中導入APX基因，提高植物體內(nèi)的APX蛋白活性［19］。Wang等［20］在番茄中過量表達APX證實轉(zhuǎn)基因番茄的抗寒和抗鹽能力得到顯著提高；Sarowar等［21］將一個辣椒APX基因轉(zhuǎn)入煙草，同樣提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗氧化脅迫與抗真菌能力，而許傳俊等［22］從蝴蝶蘭中克隆了APX基因，研究其在蝴蝶蘭體內(nèi)的時空表達情況及對機械傷害和高鹽脅迫的響應(yīng)。本研究為后續(xù)開展桑樹APX生理功能及其相關(guān)的抗氧化機理研究提供了基礎(chǔ)。

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（責任編輯：張 韻）

S888

A

0528-9017（2017）01-0155-05

文獻著錄格式：劉巖，朱燕，林天寶，等.桑樹APX基因的克隆及在擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學，2017，58（1）：155-159.

10.16178/j.issn.0528-9017.20170149

2016-08-23

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（蠶桑）（CARS-22-ZJ0105）；浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項

劉 巖（1976-），女，河南焦作人，副研究員，從事桑蠶分子生物學研究工作，E-mail：lymorus@gmail.com。

呂志強（1965-），研究員，從事桑樹育種學研究工作，E-mail：1398131715@139.com。