馬 麗, 紀浩杰, 王 瑩, 趙東欣, 盧 奎,2*

(1. 河南工業(yè)大學 化學化工學院,河南 鄭州 450052; 2. 河南工程學院 材料與工程學院,河南 鄭州 451191)

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多肽BRC4的固相法合成及其與RAD51(231-260)的相互作用

馬 麗1, 紀浩杰1, 王 瑩1, 趙東欣1, 盧 奎1,2*

(1. 河南工業(yè)大學 化學化工學院,河南 鄭州 450052; 2. 河南工程學院 材料與工程學院,河南 鄭州 451191)

采用Fmoc固相合成策略，以Wang樹脂為載體，F(xiàn)moc保護的氨基酸為原料，HOBT/HBTU/DIEA 為縮合劑，經(jīng)RP-HPLC分離純化合成了3條多肽(BRC4, BRC4-1和BRC4-2)，純度>90%，其結(jié)構(gòu)經(jīng)MS(ESI)確證。采用圓二色光譜研究了BRC4, BRC4-1和BRC4-2與蛋白RAD51關(guān)鍵肽段RAD51(231-260)的相互作用。結(jié)果表明：3條多肽與RAD51(231-260)的相互作用強度為BRC4-1>BRC4-2>BRC4。

Fmoc固相合成; 多肽; BRC4; RAD51; 相互作用

從分子角度研究癌癥的致病機理是近年來生物醫(yī)學領(lǐng)域的一個研究熱點[1]。人體內(nèi)天然存在的抑癌基因受到了研究人員的廣泛關(guān)注。BRCA2是與乳腺癌相關(guān)的一種重要抑癌基因，位于人染色體13q12-q13上[2]。它通過調(diào)節(jié)RAD51蛋白，參與DNA同源重組。BRCA2與RAD51的相互作用主要通過其結(jié)構(gòu)中的8個BRC重復基元(BRC1～BRC8)實現(xiàn)。其中BRC4是8個基元中與RAD51結(jié)合作用最強的基元[3-5]。BRC4含有35個氨基酸，數(shù)量較多，常規(guī)方法合成比較困難。固相合成法合成多肽具有合成時間短，成本較低和操作較簡單等優(yōu)點[6]，故本文嘗試以固相合成法直鏈合成35肽。

BRC4的一級結(jié)構(gòu)為KEPTLLGFHTASGKKVKIAKESLDKVKNLFDEKEQ(粗體部分為保守序列)，本文以Pellegrini等[7-10]對DNA重組中BRCA2-RAD51復合物的結(jié)構(gòu)研究為基礎(chǔ)，增加了序列中的芳香性氨基酸，將BRC4中1517-位的Lys突變?yōu)镻he。此外，由于Trp的側(cè)鏈具有疏水性作用，可能會有益于其相互作用，而RAD51中的A4和A5螺旋形成的疏水口袋有足夠的空間可以容納有更大結(jié)構(gòu)的BRC4中1545-位和1546-位氨基酸的殘基，所以我們將1545-位的Leu換成含苯環(huán)的Trp，采用Fmoc固相合成策略和RP-HPLC分離純化，設(shè)計并合成了BRC4及其兩條類肽(BRC4-1和BRC4-2)，純度>90%，其結(jié)構(gòu)經(jīng)MS(ESI)確證[11]。采用圓二色光譜研究了BRC4, BRC4-1和BRC4-2與蛋白RAD51關(guān)鍵肽段RAD51(231-260)的相互作用。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Scientific LCQ Fleet型離子肼質(zhì)譜儀(離子源：EI，檢測模式：正離子，噴霧電壓3.0 kV,毛細管溫度300 ℃，毛細管電壓33 V)； Agilent 1200型高效液相色譜儀[流動相：A相(0.1%TFA/H2O), B相(0.1%TFA/CH3CN)；梯度洗脫：20%～50%B, 0～35 min;液相色譜柱:Agilent Zorbax 300 SB-C18(9.4 mm×250 mm, 5 μm)；柱溫25 ℃；流速1.0 mL·min-1；檢測波長250～280 nm]； Bio-logic MOS-500型圓二色光譜儀；Thermo Scientific Sorvall Legend RT+型臺式離心機；FF 210型多肽固相合成管。

Fmoc-Gln(Trt)-Wang Resin(擔載量0.32 mmol·g-1), RAD51(231～260),純度95%, Fmoc保護的氨基酸, 1-羥基苯并三唑(HOBT), 苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU),上海吉爾生化公司；哌啶,N,N-二異丙基乙胺(DIPEA),國藥化學試劑有限公司；苯甲硫醚,乙二硫醇,三氟乙酸(TFA)，薩恩化學有限公司；其余所用試劑均為分析純。

1.2 BRC4～BRC4-2的合成(以BRC4為例)

(1) 樹酯溶脹

在多肽合成管中加入Fmoc-Gln(Trt)-Wang Resin 1.5 g和DMF 10 mL，通氮排氧，攪拌30 min使樹脂充分溶脹，抽濾得溶脹的樹脂A。

(2) 脫除氨基保護基

在固相合成管中加入20%哌啶的DMF(10 mL)溶液和A，通氮排氧，攪拌30 min使A脫除氨基保護基，抽濾，濾餅用DMF(4×10 mL)洗滌1 min得脫除氨基保護基的樹脂B。

(3) 茚三酮檢測

在裝有5%茚三酮的EtOH(2 mL)溶液的試管中加入B，煮沸3 min[若B變色則說明脫除完全，否則需重復(2)中步驟]。

(4) 偶聯(lián)

在反應(yīng)瓶中加入Fmoc-Glu(OBut)-OH 0.816 g, HOBT 0.259 g, HBTU 0.728 g和DMF 10 mL,攪拌使其溶解；于室溫活化10 min，加入DIPEA 334 μL，混合均勻后加入固相合成管中，加入B，通氮排氧，避光攪拌4 h。依次用DMF(2×10 mL)，甲醇(2×10 mL)，和DMF(2×10 mL)洗滌1 min得偶聯(lián)樹脂C。

(5) 茚三酮檢測

取少量C加入裝有茚三酮的試管中，煮沸3 min[若樹脂不變色則說明偶聯(lián)成功，否則需重復(4)中步驟]。

(6) 樹脂切割

在圓底燒瓶中加入用氮氣吹干的復合物，按樹脂1 g/切割試劑10 mL的比例加入切割試劑[V(TFA) ∶V(苯甲硫醚) ∶V(乙二硫醇) ∶V(水) ∶V(苯酚)=82.5 ∶5 ∶2.5 ∶5 ∶2.5]15 mL，于室溫攪拌4 h。抽濾，濾液倒入冰乙醚中，放置冰箱過夜，離心，收集沉淀，吹干后經(jīng)RP-HPLC純化得白色固體BRC4。

用類似的方法合成白色固體BRC4-1和BRC4-2粗肽。

BRC4: 收率69%，純度90%; MS(ESI)m/z: 1 320.00{[M+3H]3+}, 989.21{[M+4H]4+}, 791.32{ [M+5H]5+}, 660.12{[M+6H]6+}。

BRC4-1: 收率71%，純度91%; MS(ESI)m/z: 1 326.00{[M+3H]3+}, 994.92{[M+4H]4+}, 796.25{ [M+5H]5+}, 663.67{[M+6H]6+}。

BRC4-2: 收率71%，純度91%; MS(ESI)m/z: 1 344.48{[M+3H]3+}, 1 008.61{[M+4H]4+}, 807.01{ [M+5H]5+}, 672.74{[M+6H]6+}。

1.3 BRC4～BRC4-2與RAD51(231～260)的相互作用測定

(1) 在兩個3 mL比色皿中分別加入2.85×10-6mol·L-1靶肽溶液和0.01 mol·L-1Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.4)2.5 mL，以Tris-HCl作參比，測定圓二色光譜。

(2) 在(1)中的兩個比色皿中分別滴加5.05×10-4mol·L-1BRC4～BRC4-2溶液15 μL直至CD信號穩(wěn)定，靜置60 min，測定圓二色譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 相互作用的二級結(jié)構(gòu)變化[12-13]

圖1為BRC4～BRC4-2與RAD51(231-260)相互作用的圓二色譜圖。表1為經(jīng)CDPro計算，BRC4～BRC4-2與RAD51(231～260)相互作用后的二級結(jié)構(gòu)變化。

λ/nm圖1 BRC4～BRC4-2與RAD51(231-260)相互作用的 圓二色譜圖Figure 1 The circular dichroism spectra of BRC4～ BRC4-2 interaction with RAD51(231-260)表1 BRC4～BRC4-2與RAD51(231～260) 相互作用后的二級結(jié)構(gòu)變化Table 1 The secondary structure of BRC4～ BRC4-2 interaction with RAD51(231～260)

Compα-helix/%β-shee/%β-turn/%其他/%BRC4-RAD51(231-260)55.95.417.424.3(BRC4-1)-RAD51(231-260)56.15.817.422.8(BRC4-2)-RAD51(231-260)56.05.617.922.2

由圖1可以看出，BRC4-1和BRC4-2與RAD51(231～260)相互作用后，190 nm處的正吸收峰和230 nm處的負吸收峰均比BRC4與RAD51(231～260)相互作用后的吸收峰顯著增強，其中BRC4-1增強最為顯著。

由表1可以看出，BRC4-1和BRC4-2與RAD51(231-260)的α螺旋、β折疊的比例均比BRC4略有增加，其中BRC4-1增加最明顯。α螺旋、β折疊增加表明復合物結(jié)構(gòu)有序性增加，相互作用增強，說明BRC4中的 Lys和Leu 被 Phe和Trp 替代后，與 RAD51(231～260)之間的作用均增強。BRC4-1與RAD51(231～260)相互作用最強的可能原因為： BRC4-1中的Phe取代了BRC4中的Lys后，產(chǎn)生了π-π堆積作用，BRC4-2中的Trp取代了BRC4中的Leu， Trp的側(cè)鏈和 RAD51(231～260)中 Phe與Tyr 雖然也產(chǎn)生了π-π堆積作用，但可能因為取代位置位于肽段尾部，相互作用較弱。此外，Trp的殘基中含有苯環(huán)，與Phe殘基中的苯環(huán)形成位阻效應(yīng)，導致RAD51(231～260)的A4和A5形成的疏水口袋結(jié)合得不夠緊密。

采用Fmoc固相合成策略，合成了3條多肽(BRC4, BRC4-1和BRC4-2)，純度>90%。采用圓二色光譜研究了BRC4, BRC4-1和BRC4-2與蛋白RAD51關(guān)鍵肽段RAD51(231-260)的相互作用。結(jié)果表明：3條多肽與RAD51(231-260)的相互作用強度為BRC4-1>BRC4-2>BRC4。該結(jié)果對多肽類藥物的設(shè)計與合成有一定借鑒意義。

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Solid-phase Synthesis of Polypeptides BRC4 and Their Interaction with RAD51(231-260)

MA Li1, JI Hao-jie1, WANG Ying1, ZHAO Dong-xin1, LU Kui1，2*

(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Henan University of Technology, Zhengzhou 450052, China;2. School of Materials and Engineering, Henan Institute of Engineering, Zhengzhou 451191, China)

Three polypeptides(BRC4, BRC4-1 and BRC4-2), with over 90% purity, were synthesized by the Fmoc solid synthesis strategy then separation and purification by RP-HPLC, using Wang resin as carrier, Fmoc protected amino acid as material and HOBT/HBTU/DIEA as coupling reagents. The structures were confirmed by MS(ESI). The interactions of BRC4, BRC4-1 and BRC4-2 with RAD51 were investigated by circular dichroism. The circular dichroism results showed that the sequence of interaction strength with RAD51(236-260) was BRC4-1>BRC4-2>BRC-4.

Fmoc solid phase synthesis; polypeptide; BRC4; RAD51; interaction

2016-08-25;

2017-01-10

國家自然科學基金資助項目(21172054, 21572046); 河南省教育廳自然科學基金資助項目(14A150017)

馬麗(1975-)，女，漢族，河南鄭州人，博士，副教授，主要從事化學生物學的研究。 E-mail: mamarry@haut.edu.cn

盧奎，教授， E-mail: luckyluke@haut.edu.cn

O621.3

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.02.16216