王正想(綜述)，劉思源(審校)

(1.河北省滄州市中心醫(yī)院皮膚科，河北 滄州 061001；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院骨與軟組織腫瘤科，河北 石家莊 050051)

·綜 述·

基因沉默治療惡性腫瘤的研究進(jìn)展

王正想1(綜述)，劉思源2*(審校)

(1.河北省滄州市中心醫(yī)院皮膚科，河北 滄州 061001；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院骨與軟組織腫瘤科，河北 石家莊 050051)

基因沉默；腫瘤，繼發(fā)原發(fā)性；綜述文獻(xiàn)

早在1985年,吳曼院士就提出了惡性腫瘤是基因治療的重要目標(biāo)，隨著醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步，人們逐漸發(fā)現(xiàn)所有的惡性腫瘤都是基因病，都存在一個(gè)或幾個(gè)不同基因的異常表達(dá)，所以從基因水平治療惡性腫瘤一直是醫(yī)學(xué)界不斷追求的方向，而且近年來也取得了巨大的進(jìn)展，如直腸癌可以用HLA-B7治療，肺癌可以用p16基因治療，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤可用自殺基因治療，轉(zhuǎn)移性乳腺癌可以用IL-2治療等，部分腫瘤基因治療的臨床試驗(yàn)已取得了一定效果。但針對(duì)單個(gè)基因的治療一般不能取得好的效果, 因?yàn)樗心[瘤都屬于多基因疾病。RNA干擾(RNA interference RNAi)技術(shù)恰恰可以彌補(bǔ)單基因治療的不足，該方法能抑制多個(gè)基因的表達(dá)，能夠針對(duì)信號(hào)通路的多個(gè)基因或者基因族的共同序列同時(shí)進(jìn)行抑制，從而更有效地控制腫瘤生長(zhǎng)。RNAi產(chǎn)生的基因沉默是由一種雙鏈RNA(double-standed RNA,dsRNA)所誘發(fā)的。在此過程中，因?yàn)榻到饬伺cdsRNA有同源序列的信使RNA(mRNA)，因此該基因的表達(dá)受到了抑制。因RNAi所致的基因沉默發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后，所以被稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post transeriptional gene silencing，PTGS)。RNAi是一項(xiàng)新興基因表達(dá)阻斷技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是可以簡(jiǎn)單、快速地封閉目的基因，制備特定基因缺失的表型，以研究基因功能[1-3]。

1 基因沉默的發(fā)現(xiàn)

1995年，美國康奈爾大學(xué)的Guo等[4]在利用RNA反義技術(shù)研究秀麗線蟲(C.elegans)的par-1基因功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，將與目的基因mRNA互補(bǔ)的反義RNA導(dǎo)入線蟲細(xì)胞，引起目的基因沉默。后將與mRNA序列相同的正義RNA導(dǎo)入細(xì)胞，出現(xiàn)相同的結(jié)果。1998年線蟲基因組計(jì)劃完成之后，馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Mello和卡耐基研究院的Fire[5]發(fā)現(xiàn)Guo遇到的正義RNA抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象，以及過去的反義RNA技術(shù)對(duì)基因表達(dá)的阻斷，是由于體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA中污染了微量的dsDNA造成的,首次在秀麗線蟲中證明上述現(xiàn)象屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。他們首先將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA(single-standed RNA,ssRNA)純化，然后注射到線蟲體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)基因抑制效應(yīng)變的微弱。與之相反的是，經(jīng)過純化的dsRNA能夠高效特異性阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)，且抑制基因表達(dá)的效率較純化前的反義RNA至少提高了2個(gè)數(shù)量級(jí)。該小組將這一現(xiàn)象稱為RNA干涉，從此誕生了新的基因功能研究領(lǐng)域。

2 基因沉默的機(jī)制

RNAi引起的轉(zhuǎn)錄后基因沉默分為起始階段和效應(yīng)階段：起始階段是長(zhǎng)鏈dsRNA被切割為21～23 bp長(zhǎng)的小分子干擾RNA片段(small interfering RNA,sRNA)的過程；效應(yīng)階段是與siRNA互補(bǔ)的mRNA降解的過程。

2.1 起始階段 由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因、病毒轉(zhuǎn)染等途徑引入的雙鏈RNA，被Dicer酶(Dicer酶是RNaseⅢ家族的成員，廣泛存在于各種生物體內(nèi)。)降解為21～23bp的雙鏈sRNA，這些sRNA具有3羥基末端、5磷酸及有2 bp的3突出端，與所作用的靶mRNA序列具有同源性，從而在RNAi調(diào)控途徑中起著關(guān)鍵的作用。

2.2 效應(yīng)階段 在解旋酶的作用下, siRNA可解鏈成為正義鏈和反義鏈,其中的反義鏈可指導(dǎo)形成一種核蛋白體復(fù)合物,稱之為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC是一種核糖蛋白,包含有蛋白成分和RNA,其中的RNA即是siRNA。核酸內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶及同源RNA鏈等組成其蛋白成分[6]。在線蟲體內(nèi),僅少量的dsRNA分子就可以引起大量mRNA的降解,并能向鄰近的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)展,這表明某個(gè)信號(hào)擴(kuò)散傳遞的現(xiàn)象可能存在于該過程,這種現(xiàn)象被稱為傳遞RNAi。但傳遞RNAi現(xiàn)象的機(jī)制人們一直在研究?？赡軅鬟fRNAi現(xiàn)象RNA是利用原來的siRNA作為引物重新合成dsRNA,此過程需要一個(gè)RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)作用,然后再通過Dicer作用成為次級(jí)siRNA,形成新的siRNA又進(jìn)入上述的循環(huán),進(jìn)一步作用于靶向mRNA,這一過程也被稱為隨機(jī)降解性聚合酶鏈反應(yīng)[7]。

3 基因沉默的優(yōu)點(diǎn)

基因沉默技術(shù)具有特異性、高效性、靶點(diǎn)的多樣性與選擇性、效應(yīng)的可遺傳性、放大效應(yīng)等特點(diǎn)，因而在臨床中有廣闊的應(yīng)用空間，有望給腫瘤的治療帶來革命性的進(jìn)展。

4 基因沉默干擾在各種腫瘤中的應(yīng)用

4.1 基因沉默干擾在鼻咽癌治療中的應(yīng)用 皰疹病毒是導(dǎo)致鼻咽癌發(fā)生的重要因素，由EBV編碼的LMP-1(latent membrane protein-1)與癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有研究顯示以腺病毒相關(guān)病毒為載體，包裝合成表達(dá)針對(duì)LMP-1的siRNA，并對(duì)EBV陽性的人類鼻咽癌C666-1細(xì)胞系感染，感染前后觀察細(xì)胞存活率和跨膜侵襲能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率及跨膜侵襲能力在感染后明顯下降[8]。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移少，腫瘤轉(zhuǎn)移率降低，但腫瘤大小差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不能表明抑制LMP-1后腫瘤生長(zhǎng)受影響。RNAi可以抑制病毒癌基因的表達(dá)，能夠抑制鼻咽癌癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，甚至使鼻咽癌癌細(xì)胞凋亡，從而降低鼻咽癌的侵襲能力，降低鼻咽癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生率。

4.2 基因沉默在肺癌治療中的應(yīng)用 隨著工業(yè)化的飛速發(fā)展，環(huán)境污染也進(jìn)一步加重，尤其是汽車尾氣的排放，使肺癌的發(fā)病率逐漸上升，目前手術(shù)仍然是治療肺癌的主要方法，研究肺癌的基因治療是醫(yī)學(xué)界的熱點(diǎn)問題。Ras蛋白[9]是一種由ras基因編碼的GTP結(jié)合蛋白，該蛋白具有GTP酶活性，是一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。人類肺癌的發(fā)生與K-ras V12突變基因的表達(dá)密切相關(guān)。有研究人員用針對(duì)K-ras V12表達(dá)的siRNA對(duì)肺癌細(xì)胞系H441進(jìn)行感染，結(jié)果降低了K-ras的mRNA表達(dá)量，ras蛋白表達(dá)水平也降低，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞較對(duì)照組的細(xì)胞增殖速度降低，細(xì)胞凋亡的數(shù)目增高。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)也可受到siRNA的影響而被抑制。

4.3 基因沉默在卵巢癌治療研究中的應(yīng)用 卵巢的惡性腫瘤是女性生殖器三大惡性腫瘤之一。卵巢癌具有臨床發(fā)現(xiàn)晚、轉(zhuǎn)移早、治療效果差等特點(diǎn)，素有“沉默殺手”之稱，多數(shù)患者就診時(shí)已處于疾病的晚期階段，預(yù)后不良，卵巢惡性腫瘤的5年存活率僅15%左右。至今缺乏有效的早期診斷方法[10]。目前治療卵巢癌的主要手段是手術(shù)治療聯(lián)合化療，但其預(yù)后差，不良反應(yīng)大。張國強(qiáng)等[11]利用基因重組技術(shù)，將PPO基因的cDNA裝入pcDNA/His載體，然后對(duì)NIH/3T3細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染，篩選出具有增殖活性并能穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞株，然后用PPO的RNA干擾此細(xì)胞株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCNA的表達(dá)降低，p-MEK表達(dá)量減少。對(duì)卵巢癌細(xì)胞株OVK18和OVCAR-3進(jìn)行RNAi后，注入裸鼠體內(nèi)進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組腫瘤的大小差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明卵巢癌細(xì)胞在活體上的生長(zhǎng)受到抑制。目前RNAi對(duì)卵巢癌治療的研究尚處在基礎(chǔ)研究階段，各種基因?qū)β殉舶┌l(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的影響，以及作用的具體途徑和機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究，從基礎(chǔ)研究階段過渡到臨床應(yīng)用階段，更需各專業(yè)學(xué)者的不斷探索。

4.4 基因沉默在肝癌治療中的應(yīng)用 我國肝炎的發(fā)病率遠(yuǎn)高于其他國家。肝炎的發(fā)病率高，傳播性強(qiáng)，而大多數(shù)肝癌都是由肝炎、肝硬化進(jìn)展而形成的，因此我國肝癌的患病率居高不下。目前治療肝癌的手段仍停留在外科手術(shù)和放療、化療階段。手術(shù)切除僅限于早期，放療和化療不良反應(yīng)大，大量科研工作者正在為尋找有效治療肝癌的方法進(jìn)行不斷的探索。研究顯示采用選擇性COX-2抑制劑NS-398作用于肝癌細(xì)胞，RT-PCR及Western blot檢測(cè)COX-2表達(dá)降低后，肝癌細(xì)胞增殖明顯受到抑制[12]。有研究表明利用陽離子脂質(zhì)體將COX-2 siRNA轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞，MTT法觀察HepG2細(xì)胞系增殖特性的變化，結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞增殖被明顯抑制，尤其以轉(zhuǎn)染后24 h最為顯著[13]。從人肝細(xì)胞癌細(xì)胞中NF-κB p65的cDNA序列中選擇3個(gè)位點(diǎn)作為RNAi的靶位點(diǎn)，以螢光素酶基因siRNA作為對(duì)照，分別轉(zhuǎn)染Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄半定量PCR方法檢測(cè)各組RNA的表達(dá)，結(jié)果表明在2個(gè)細(xì)胞株中，3條siRNA都能夠抑制p65基因的表達(dá)，其中抑制作用最顯著的是第2和第3條siRNA[14]。

4.5 基因沉默在喉癌治療中的應(yīng)用 有研究利用基因重組技術(shù)，構(gòu)建蛋白激酶CKZα靶向siRNA表達(dá)質(zhì)粒psiRNA-hHlneo-CKZ的脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞，觀察其對(duì)人喉癌細(xì)胞系Hep-2的侵襲是否有抑制作用，結(jié)果顯示Hep-2細(xì)胞蛋白激酶CKZα的表達(dá)能被蛋白激酶CKZα靶向siRNA表達(dá)載體抑制， Hep-2細(xì)胞侵襲力降低[15]。實(shí)驗(yàn)根據(jù)hTERTcDNA序列構(gòu)建特異性表達(dá)hTERTmRNA，有熒光素基因的shRNA，真核表達(dá)質(zhì)粒PshRNAi，隨機(jī)選取一段與人類基因無同源性的堿基序列，構(gòu)建表達(dá)shRNA的含熒光素基因質(zhì)粒PshRNAZ作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組(質(zhì)粒PshRNAI)、對(duì)照組(PshRNAZ)、空白對(duì)照組(空白培養(yǎng)液)，各組分別轉(zhuǎn)染喉癌Hep-2細(xì)胞，觀察RNA干擾抑制端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telome raserevese transcriptase，hTERT)能否影響喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡、p53及caspase-3蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明RNAi抑制hTERT基因表達(dá)后喉癌細(xì)胞增殖率降低，細(xì)胞凋亡增加，可能p53及caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)后誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡[16]。目前放射治療也是喉癌的主要治療手段，但由于個(gè)體差異和腫瘤大小、生長(zhǎng)部位、腫瘤分期不同，不同患者對(duì)放療的敏感性也不同。RNAi技術(shù)應(yīng)用于喉癌中可以提高癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性[17]。

4.6 基因沉默在乳腺癌治療中的應(yīng)用 Gu等[18]完成針對(duì)人VEGF-C基因的siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建后,轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-43細(xì)胞，利用RNAi技術(shù)沉默VEGF-C基因。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后VEGF-C基因及蛋白水平表達(dá)量明顯減少,COX-2和Bcl-2的表達(dá)水平降低,細(xì)胞體外生長(zhǎng)狀態(tài)不佳,細(xì)胞凋亡明顯增多，轉(zhuǎn)染72 h后凋亡率達(dá)到60%,乳腺癌MDA-MB-43細(xì)胞的凋亡率顯著高于對(duì)照組。在完成針對(duì)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因[19]的RNAi表達(dá)載體后,利用RNAi技術(shù)沉默hTERT基因，轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細(xì)胞,結(jié)果顯示hTERT基因的表達(dá)降低，進(jìn)而抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞體外生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞凋亡率明顯增加。有學(xué)者設(shè)計(jì)兩對(duì)針對(duì)C35編碼區(qū)的siRNA,并合成構(gòu)建到轉(zhuǎn)錄載體pTZU6+1上,形成重組質(zhì)粒siRNA-C35,通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株T47D,結(jié)果顯示質(zhì)粒pTZU6+1、pshRNA-C35-1和pshRNA-C35-2組的相對(duì)表達(dá)率分別是脂質(zhì)體對(duì)照組的95.3%、40.0%和28.4%[20]。siRNA轉(zhuǎn)錄載體轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株能有效抑制乳腺癌細(xì)胞中C35基因的表達(dá)。

4.7 基因沉默在骨肉瘤中的應(yīng)用 骨肉瘤發(fā)病率高，惡性程度大，預(yù)后極差，手術(shù)聯(lián)合化療雖然在一定程度上提高了患者的5年生存率[21]，但化療不良反應(yīng)大，且損傷人體各臟器，因此臨床上迫切需要尋找骨肉瘤治療的新方法。有研究報(bào)道，survivin基因與骨肉瘤細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系，應(yīng)用siRNA技術(shù)沉默survivin基因啟動(dòng)子可明顯促進(jìn)骨腫瘤細(xì)胞的凋亡[22]。Fossey 等[23]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活化子3是骨腫瘤細(xì)胞凋亡過程中的重要細(xì)胞因子，應(yīng)用siRNA技術(shù)沉默轉(zhuǎn)錄活化子3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)骨腫瘤細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞增殖和活力受到抑制。同時(shí)可以下調(diào)survivin、VEGF、MMP-2等相關(guān)基因的表達(dá)。有研究報(bào)道用siRNA技術(shù)進(jìn)行基因沉默cyclin基因，進(jìn)行骨肉瘤細(xì)胞體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)基因沉默對(duì)骨腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定的抑制作用[24-25]。

4.8 基因沉默在皮膚惡性腫瘤中的應(yīng)用 皮膚的惡性腫瘤主要包括三類：基底細(xì)胞癌(basalcell carcinoma,BCC)、鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)和皮膚惡性黑色素瘤(cutaneous maligant melanoma,CMM)。隨著醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步，細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、分子遺傳學(xué)迅猛發(fā)展，對(duì)皮膚癌的治療方法也不斷改進(jìn)，由最早的單純手術(shù)和激光方法，逐漸發(fā)展到化學(xué)治療、生物治療、放射治療、光動(dòng)力學(xué)療法、基因治療。而RNAi是基因治療的重要方法之一，這種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是可以特異性地下調(diào)致病基因，達(dá)到治療腫瘤的目的，與其他治療惡性腫瘤方法比較有顯著的優(yōu)點(diǎn)。凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein, IAP)是一類重要的抗細(xì)胞凋亡因子。Livin基因是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)IAP家族成員,有2種異構(gòu)體分別是α和β,在體內(nèi)作用機(jī)制復(fù)雜[26-29],在多種腫瘤組織都有特異的分布[30-34]。

采用RT-PCR方法檢測(cè)A375細(xì)胞等35種黑素瘤細(xì)胞株,發(fā)現(xiàn) livin mRNA在各種黑素瘤細(xì)胞中都存在高表達(dá)[35]。王琳琳等[36]構(gòu)建2個(gè)針對(duì)人源的siRNA的表達(dá)質(zhì)粒，用脂質(zhì)體介導(dǎo)，體外轉(zhuǎn)染人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞株，使人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞凋亡增加，結(jié)果表明siRNA-2表達(dá)沉默Livin基因后人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞周期出現(xiàn)G0/G1期的細(xì)胞增多，進(jìn)入S期的細(xì)胞減少，A375細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，細(xì)胞增殖受到抑制，腫瘤細(xì)胞凋亡增加。

總之，RNAi能對(duì)特定基因復(fù)制表達(dá)進(jìn)行高效的抑制，而對(duì)其他無關(guān)基因沒有影響，因此這種方法針對(duì)性強(qiáng)，有很好的靶向性，不良反應(yīng)小，在人類惡性腫瘤治療方面有廣闊的治療前景。但是RNAi技術(shù)不能使所有致病基因的沉默都能達(dá)到理想效果，如何提高基因沉默的效果對(duì)該種治療方法的有效性和可行性顯得尤為重要。而且在RNAi導(dǎo)入后其在人體內(nèi)的穩(wěn)定性和作用的長(zhǎng)期性仍需進(jìn)一步完善。目前的RNAi實(shí)驗(yàn)大多數(shù)是在細(xì)胞和動(dòng)物水平，關(guān)于人類的RNAi的臨床研究還很少，因此還缺乏對(duì)其不良反應(yīng)的認(rèn)識(shí)和研究。但是，相信在不久的將來，關(guān)于RNAi的諸多問題會(huì)逐步得到解決，RNAi將會(huì)廣泛地應(yīng)用于臨床工作中，以挽救廣大惡性腫瘤患者的生命。

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(本文編輯：劉斯靜)

2016-10-27；

2017-03-11

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30440086)

王正想(1982-)，男，河北滄州人，河北滄州市中心醫(yī)院皮膚科主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事皮膚疾病診治研究。

R394

A

1007-3205(2017)08-0988-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.08.031

*通訊作者