劉妮陸沁劉娟陳航，2

（1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，昆明 650224；2. 國家林業(yè)局資源昆蟲培育與利用重點實驗室，昆明 650224）

CRISPR/Cas系統(tǒng)最新研究進(jìn)展

劉妮1陸沁1劉娟1陳航1，2

（1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，昆明 650224；2. 國家林業(yè)局資源昆蟲培育與利用重點實驗室，昆明 650224）

CRISPR/Cas系統(tǒng)為細(xì)菌與古細(xì)菌中抵御外源病毒和質(zhì)粒DNA入侵的獲得性免疫機(jī)制系統(tǒng)。作為一種新型的基因組編輯技術(shù)，具有設(shè)計簡單、特異性強、效率高等優(yōu)點，為基因組定向改造調(diào)控和應(yīng)用帶來了突破性的革命。就CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究背景、存在類型以及TypeⅡ和TypeⅢ CRISPR系統(tǒng)的基本作用原理和新的研究突破做了較為詳盡的介紹，以便為讀者和相關(guān)領(lǐng)域的研究者提供參考。

基因組編輯技術(shù)；CRISPR/Cas系統(tǒng)；Cas9；scRNA

基因組編輯是指定點改造基因組，得到預(yù)期的生物體基因組序列從而發(fā)生遺傳改變的技術(shù)，主要是進(jìn)行DNA序列的敲除、插入、定點突變和組合編輯等，從而實現(xiàn)基因功能與調(diào)控元件的系統(tǒng)研究［1］?；蚪M編輯技術(shù)日益成為生物學(xué)研究的熱點，目前基因組編輯技術(shù)主要包括巨核酶技術(shù)、鋅指核酸酶技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)及CRISPR相關(guān)核酸酶技術(shù)［2］。它們在基因工程中已經(jīng)得到了諸多成功的應(yīng)用，然而上述傳統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)存在明顯的不足。例如，鋅指核酸梅（zincfinger nucleases，ZFN）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸梅（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）核酸酶技術(shù)原理幾乎是一樣的，而一個新的ZFN和TALEN嵌合蛋白均需改造才能識別靶序列，這就使得兩種基因組編輯技術(shù)的廣泛推廣應(yīng)用受阻，但CRISPR相關(guān)核酸酶技術(shù)只需要一小段引導(dǎo)RNA（guide RNA、gRNA）就能識別特定的DNA［2］，且一個新的位點只需要一個新的gRNA，極大的簡化了基因組編輯的過程，擴(kuò)大靶位點的選擇，具有更大的潛力。CRISPR系統(tǒng)也可以應(yīng)用于靶向基因突變和基因修正，可以實現(xiàn)大片段DNA的缺失以及復(fù)合基因編輯。

本文將針對CRISPR/Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、分類、原理以及目前具有突破性研究并迅速發(fā)展的TypeⅡCRISPR/Cas系統(tǒng)和TypeⅢ CRISPR/Cas系統(tǒng)的突破性研究做較為詳盡的綜述。

1 CRISPR/Cas的基因座結(jié)構(gòu)

CRISPR/Cas的基因座結(jié)構(gòu)相對簡單（圖1），對于一個有效的CRISPR/Cas系統(tǒng)而言，通常包含兩個部分：第一部分是位于基因組中正向重復(fù)序列和來源于外源DNA的間隔序列組成3'端CRISPR基因座，對于重復(fù)序列而言在長度和序列上幾乎一致，在不同的物種之間長度范圍在21-47 bp，平均在32 bp［3，4］；間隔序列在長度上是一致的，長度范圍在20-72 bp，但在序列上表現(xiàn)出多樣性［4，5］。親緣關(guān)系相近的物種具有相似的重復(fù)序列，但是在全部的細(xì)菌和古細(xì)菌序列中間隔序列和重復(fù)序列都表現(xiàn)出極大的差異［6］。第二部分是位于CRISPR基因座5'端成簇的Cas基因，主要包括一些核酸酶、解旋酶、聚合酶和RNA結(jié)合蛋白等，主要參與CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的免疫過程［7］。

圖1 CRISPR/Cas基因座結(jié)構(gòu)

2 CRISPR的分布與分類

目前對于CRISPR/Cas系統(tǒng)而言主要分為3種類型：TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ 三種不同類型［8］，從另一方面也反映出在自然界中CRISPR/Cas系統(tǒng)具有多態(tài)性。

TypeⅠCRISPR/Cas系統(tǒng)在細(xì)菌和古細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)，包含6種不同的Cas蛋白，其中在干涉反應(yīng)中最重要和最顯著的是Cas3蛋白，它包含一個HD磷酸化水解酶結(jié)構(gòu)域和一個類DExH解旋酶結(jié)構(gòu)域，這兩個結(jié)構(gòu)域在ATP和 Mg2+存在的情況下能夠解開dsDNA（解旋酶結(jié)構(gòu)域）和切割ssDNA（HD核酸結(jié)構(gòu)域）［9］。

TypeⅡ CRISPR/Cas系統(tǒng)僅僅在細(xì)菌的基因組中發(fā)現(xiàn)［9］，其中Cas9是分子量很大的多功能蛋白，參與crRNAs的成熟和隨后的干涉反應(yīng)［10］。Cas9蛋白包含有兩個亞基，在Mg2+存在條件下，其中McrA/HNH切割與crRNA互補的DNA鏈，而類RuvC切割非互補鏈［9］。

TypeⅢ CRISPR/Cas系統(tǒng)主要在古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，包括type III-A和type III-B兩種類型，兩者的差別主要是A型干擾的靶標(biāo)是mRNA，B型干擾的靶標(biāo)是DNA［11］，其中type III-B系統(tǒng)與其他1或2種CRISPR亞單位相結(jié)合［9］。

type III-B系統(tǒng)特征性蛋白是Cas10蛋白，而Cas10蛋白具有RNA活性參與crRNA的成熟和剪切入侵外源DNA［9，10］。

最近幾年，CRISPR/Cas技術(shù)因其相對較為簡單，而得到較為迅速的發(fā)展，如在作物育種、基因治療以及動物建模等領(lǐng)域都已得到廣泛的應(yīng)用［12］。隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組信息被解密，為后續(xù)CRISPR/Cas系統(tǒng)的改造和應(yīng)用提供更加有力的指導(dǎo)。

3 CRISPR/Cas作用機(jī)制

3.1 TypeⅡ CRISPR/Cas系統(tǒng)基本原理

一個簡易的TypeⅡ CRISPR/Cas系統(tǒng)必定要含有Cas9和gRNA，Cas9核酸酶具有改造crRNA和破壞雙鏈DNA的雙重功能［13］，位于gRNA 5'端的20個左右的堿基決定CRISPR/Cas9系統(tǒng)在應(yīng)用時Cas9核酸酶特異性切割的部位，主要負(fù)責(zé)決定CRISPR/ Cas9系統(tǒng)的特異性。

基本原理（圖2）：首先，Cas9蛋白與gRNA形成復(fù)合體；其次，上述復(fù)合體切割與gRNA的spacer互補的基因組DNA序列；隨后造成雙鏈DNA的損傷；最后通過體內(nèi)的NHEJ或HR修復(fù)機(jī)制將引入基因突變［14］。

圖2 Cas9介導(dǎo)的基因組編輯原理［15］

3.2 TypeⅢ CRISPR/Cas系統(tǒng)基本原理

TypeⅢ CRISPR/Cas系統(tǒng)包含的兩種類型中以A型研究較為突出，這里以type III-A 為例。A型干擾的mRNA首先轉(zhuǎn)錄形成DNA，Cas10-Csm核糖核蛋白體，在crRNA的引導(dǎo)下對與crRNA互補的DNA雙鏈或單鏈進(jìn)行切割［16］，從而造成DNA的損傷（圖3）。

圖3 typeIII-A作用原理［16］

4 CRISPR/Cas系統(tǒng)之間的比較

TypeⅡ CRISPR/Cas系統(tǒng)在最近幾年研究火熱，其突出的優(yōu)點在于結(jié)構(gòu)簡單，系統(tǒng)容易設(shè)計，僅需要較短的gRNA和Cas9核酸酶就可以完成對特定靶基因的人工編輯，但是該系統(tǒng)存在較嚴(yán)重的脫靶把效應(yīng)，使其廣泛應(yīng)用受到限制。

TypeⅢ CRISPR/Cas系統(tǒng)與其他兩種類型相比存在自己獨有的亮點：（1）TypeⅢ CRISPR/Cas系統(tǒng)只有在靶DNA轉(zhuǎn)錄的情況下才發(fā)揮功能。（2）Cas10-Csm復(fù)合物不僅具有執(zhí)行引導(dǎo)RNA切割DNA的能力，也具有切割RNA的能力。這些突出的優(yōu)點揭示了一種全能型的CRISPR免疫系統(tǒng)［16］。

5 CRISPR/Cas系統(tǒng)最新突破性研究

隨著生物學(xué)研究的迅猛發(fā)展，CRISPR/Cas系統(tǒng)也出現(xiàn)令人難以置信的新突破，為基因組編輯技術(shù)的廣泛應(yīng)用開辟了更為廣闊的道路。

5.1 技術(shù)創(chuàng)新

真核細(xì)胞具有較為復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)，基因組中不同的位點采用不同的調(diào)控方式，利用這一原則，通過延長引導(dǎo)RNA使其包含效應(yīng)蛋白的結(jié)合位點，從而開發(fā)了一種CRISPR支架RNA（scRNA），利用scRNA能夠開發(fā)多基因轉(zhuǎn)錄程序，在控制一部分基因激活的同時又抑制了另一部分基因［17］。這一突破為基因表達(dá)程序的構(gòu)建提供了強有力的技術(shù)支撐，也為細(xì)胞重組和研究代謝途徑等開辟新的道路。

在TypeⅡ CRISPR/Cas系統(tǒng)中Cas9具有重要的作用，初始的Cas9大多都是來源于釀膿鏈球菌即SpCas9，但是在金黃色釀膿葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)了一種新的Cas9即SaCas9，在相關(guān)實驗發(fā)現(xiàn)體內(nèi)調(diào)節(jié)基因組編輯效率方面SaCas9要比SpCas9高出很多［18］。一種高效的Cas9核酸酶的發(fā)現(xiàn)攻克了基因組編輯面臨的一大挑戰(zhàn)，在東京大學(xué)相關(guān)研究設(shè)計了一種光激活的Cas9，能夠光控CRISPR/Cas9基因組編輯，在空間和時間上更好地控制RNA引導(dǎo)的核酸酶的活性［19］；Sato實驗室也相繼推出了光活化系統(tǒng)來切割目標(biāo)DNA序列，進(jìn)行光活化的基因組修飾，他們采用每個Cas9片段與一個二聚化的結(jié)構(gòu)域相融合，創(chuàng)建了光活化的Cas9工具；Alexander Deiters的實驗室利用遺傳編碼的光照技術(shù)，在Cas9蛋白中插入硝基苯籠罩的賴氨酸，最終發(fā)現(xiàn)這種新型的Cas9系統(tǒng)能夠讓內(nèi)源的基因表達(dá)沉默。這些技術(shù)的革新使人們能夠更好的了解復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)，也能很好的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)方面。

5.2 疾病研究

基因組編輯技術(shù)在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用也越來越多，如進(jìn)行基因治療和構(gòu)建疾病模型等。

5.2.1 構(gòu)建疾病模型 骨髓瘤是一種進(jìn)行性腫瘤性疾病，目前對它的致病機(jī)理還不是很清楚，因此構(gòu)建該疾病的模型，對于研究其致病機(jī)理和藥物篩選有重要的作用。

小鼠的骨髓瘤疾病模型已被構(gòu)建，研究小組將gRNA和表達(dá)Cas9蛋白的慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建出簡易的TypeⅡ CRISPR/Cas系統(tǒng)，然后將表達(dá)5種微小gRNA慢性病毒載體組合在一起，導(dǎo)入小鼠的造血干細(xì)胞中，從而形成惡性腫瘤的單克隆；最后，將細(xì)胞注射到小鼠體內(nèi)，結(jié)果表明CRISPR/Cas系統(tǒng)在多基因作用的模型建立上是有效的，能夠較好的反應(yīng)人類的疾病［20］。

最近，Broad研究所和麻省理工學(xué)院David H.Koch綜合癌癥研究所的諸多科學(xué)家們利用Cas9核酸酶技術(shù)在構(gòu)建的癌癥動物模型中系統(tǒng)地“敲除”（關(guān)閉）了整個基因組的所有基因，從而揭示出與腫瘤進(jìn)化和轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)的部分基因，同時也表明Cas9核酸酶篩選技術(shù)也成為在體內(nèi)系統(tǒng)分析腫瘤進(jìn)化過程中基因表型的可靠技術(shù)［21］。為醫(yī)學(xué)研究和臨床治療腫瘤，提供了新的思路和技術(shù)。

5.2.2 基因治療 目前對于HIV-1型艾滋病的治療尚不存在顯著的治療手段。Ebina等［22］嘗試?yán)肅RISPR/Cas9技術(shù)對HIV-1感染的T細(xì)胞的LTR區(qū)進(jìn)行打靶，結(jié)果顯示它能有效降低細(xì)胞內(nèi)前病毒的水平；韓英倫等［23］利用CRISPR/Cas9技術(shù)對哺乳動物的造血干細(xì)胞進(jìn)行改造，成功遏制了HIV-1病毒的感染作用，與此同時發(fā)現(xiàn)，它還能作用HIV-1原病毒的LTR區(qū)徹底清除原病毒，對CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行改造實驗發(fā)現(xiàn)它可以識別并激活HIV-1原病毒，如果結(jié)合HAART藥物，結(jié)果能夠徹底清除體內(nèi)的HIV-1原病毒。

EB病毒感染能夠引起腫瘤和非腫瘤性疾病，嚴(yán)重危害人類健康，Wang等［24］利用CRISPR/Cas9技術(shù)體處理EB病毒潛伏感染的人類淋巴瘤細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有25%感染的細(xì)胞被清除，50%的細(xì)胞中，EB病毒負(fù)荷明顯減少。由此可以預(yù)測，從人類感染的細(xì)胞中完全除去EB病毒，用于治療相關(guān)疾病指日可待。

CRISPR/Cas9技術(shù)除了上述在病毒感染疾病基因治療中取得顯著成效以外，對一些遺傳性疾病，例如：白內(nèi)障、地中海貧血、囊性纖維病等基因突變引起的相關(guān)疾病研究中也已取得顯著成果。

5.3 植物學(xué)研究

從基因組的角度出發(fā)對植物基因進(jìn)行人工改造從而培育優(yōu)良品種具有非常重要的意義，由于外源DNA與基因組靶基因發(fā)生同源重組效率很低，因此對植物基因組進(jìn)行人工改造就顯得異常困難。受序列的限制以往的CRISPR載體往往是兩個載體，也即表達(dá)gRNA和Cas9元件位于不同的載體，共轉(zhuǎn)化效率較低，為了克服這一困難，我們可以試想利用同源重組技術(shù)和改進(jìn)后的定點突變技術(shù)將基因特異的靶序列構(gòu)建到通用載體中得到表達(dá)特異基因gRNA的入門載體，將其與目標(biāo)載體同源重組從而構(gòu)造特異的基因表達(dá)載體。

CRISPR/Cas系統(tǒng)在植物學(xué)方向的研究很多，但大多局限于研究去修飾和改造一個或多個靶位點。最近，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)研究人員利用PCR技術(shù)擴(kuò)增形成多重gRNA表達(dá)帶，再將其組裝到CRISPR/Cas9表達(dá)載體上，從而發(fā)現(xiàn)一種適合于單子葉和雙子葉植物，高效且方便的多重基因組編輯的強大的CRISPR/Cas9系統(tǒng)［25］，為后續(xù)進(jìn)行植物基因組改造、整合和培育新的品種提供技術(shù)支撐。

5.4 昆蟲學(xué)研究

在昆蟲方向的研究大多局限于采用CRISPR/ Cas9基因編輯技術(shù)，目前已經(jīng)在果蠅、家蠶、埃及伊蚊體內(nèi)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)進(jìn)行基因敲除和插入研究，為進(jìn)一步研究基因功能提供新的思路和技術(shù)手段。

2014年，Liu等［26］在家蠶細(xì)胞中利用CRISPR/ Cas9系統(tǒng)進(jìn)行6個基因的敲除，在敲除Bm702基因的同時實現(xiàn)外源基因在該位點的成功插入；2015年，辛虎虎［27］在家蠶絲腺相關(guān)基因Bmsage的研究中采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因的敲除和功能分析取得良好效果；2015年，Kistler等［28］在埃及伊蚊產(chǎn)卵后的3 h內(nèi)注射gRNA與Cas9，敲除Wtrw基因并插入包含stop位點的ssODN供體片段，采用Cas9核酸酶系統(tǒng)對目的DNA進(jìn)行切割和HR修復(fù)，在埃及伊蚊內(nèi)插入ECFP閱讀框，子代可在熒光顯微鏡下顯示特殊的藍(lán)色，便于形態(tài)學(xué)觀察。利用CRISPR/Cas 系統(tǒng)對昆蟲基因功能的研究和注釋，為人類了解和探究大自然產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。

6 結(jié)語

目前，CRISPR/Cas系統(tǒng)相關(guān)的基因組編輯技術(shù)已在多個研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，盡管其中潛在著許多待解決的問題，如TypeⅡ CRISPR/Cas系統(tǒng)中DNA解旋是本身具有解旋能力還是由于DNA復(fù)制或轉(zhuǎn)錄的過程引發(fā)DNA解旋［11］，如何確保臨床應(yīng)用中的安全性和有效性等；作為RNA編輯的TypeⅢCRISPR/Cas系統(tǒng)目前仍有分子機(jī)制尚不明確。但作為第三代基因組編輯技術(shù)工具無論是從方法上還是實驗成本上都是傳統(tǒng)基因修飾和第二代基因組編輯技術(shù)無法取代的。

基因組編輯技術(shù)普遍存在細(xì)胞毒性和脫靶效應(yīng)兩大問題，由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)自身存在脫靶效應(yīng)，也使其在推廣研究應(yīng)用中受到或多或少的限制，對于降低TypeⅡ CRISPR/Cas系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)，可以考慮以下幾個方面：（1）適當(dāng)減少Cas9蛋白和gRNA的遞送量。（2）對打靶位點進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)?shù)暮Y選和過濾。（3）Cas9n和gRNA配對使用，形成5'端突出的末端。（4）精確設(shè)計和控制gRNA的長度以此降低gRNA和非目標(biāo)序列的結(jié)合率。

CRISPR/Cas系統(tǒng)目前多數(shù)還處于基礎(chǔ)研究，有些深層次的技術(shù)還有待于開發(fā)和應(yīng)用，例如TypeⅠCRISPR/Cas系統(tǒng)還未見報道，2015年TypeⅢ CRISPR/Cas系統(tǒng)在Cell上發(fā)布有突破性進(jìn)展，但隨著基礎(chǔ)學(xué)科的不斷深入，CRISPR/Cas系統(tǒng)也會得到更為廣闊的發(fā)展和應(yīng)用前景。CRISPR/Cas系統(tǒng)的不斷優(yōu)化和提升，對未來醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：醫(yī)學(xué)研究與醫(yī)學(xué)臨床治療、藥物開發(fā)、耐受藥物細(xì)胞模型的建立與篩選、人源化器官的克隆移植；分子標(biāo)記領(lǐng)域：藥物靶向追蹤、活細(xì)胞中特定結(jié)構(gòu)基因構(gòu)象分析；基因組學(xué)領(lǐng)域：功能基因研究、高通量功能基因鑒定與篩選、基因組改造與整合，CRISPR/Cas系統(tǒng)都已表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力和研究開發(fā)價值。

［1］謝科, 饒力群. 基因組編輯技術(shù)在植物中的研究進(jìn)展與應(yīng)用前景［J］. 中國生物工程雜志, 2013, 33（6）：99-104.

［2］Gaj T, Gersbach CA, Barbas CF 3rd. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering［J］. Trends Biotechnol, 2013, 31（7）：397-405.

［3］Godde JS, Bickerton A. The repetitive DNA elements called CRISPRs and their associated genes：evidence of horizontal transfer among prokaryotes［J］. Mol Evol, 2006, 62：718-729.

［4］Grissa I, Vergnaud G, Pourcel C. The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats［J］. BMC Bioinformatics, 2007, 8：172.

［5］Mojica FJ, Diez-Villasenor C, Soria E, Juez G. Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria［J］. Mol Microbiol, 2000, 36：244-246.

［6］Kunin V, Sorek R, Hugenholtz P. Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats［J］. Genome Biol, 2007, 8：R61.

［7］常振義, 嚴(yán)維, 劉東風(fēng), 等. CRISPR/Cas技術(shù)研究進(jìn)展［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 2015, 23（9）：1196-1206.

［8］張瑞. 對CRISPR-Cas系統(tǒng)的簡單介紹［J］. 農(nóng)業(yè)與技術(shù), 2015, 35（2）：16-17.

［9］Richter H, Randau L, Plagen A. Exploiting CRISPR/Cas：Interference mechanisms and applications［J］. Int J Mol Sci, 2013, 14：14518-14531.

［10］方銳, 暢飛, 孫照霖, 等. CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組定點編輯技術(shù)［J］. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2013, 40（8）：691-702.

［11］劉志國. CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)基因組編輯的研究進(jìn)展［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 2014, 45（10）：1567-1583.

［12］鄭小梅, 張曉立, 于建東, 等. CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)的研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)進(jìn)展, 2015, 5（1）：1-9.

［13］Fu Y, Foden JA, Khayter C, et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR- Cas nucleases in humancells［J］. Nat Biotechnol, 2013, 31（9）：822-826.

［14］Wieden heft B, Sternberg SH, Doudna JA. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea［J］. Nature, 2012, 482（7385）：331-338.

［15］翟禮嘉, 郭東姝, 張金喆, 等. CRISPR/Cas系統(tǒng)在植物基因組編輯中的應(yīng)用［J］. 生命科學(xué), 2015, 27（1）：64-70.

［16］Samai P, Pyenson N, Jiang WY, et al. Co-transcriptional DNA and RNA Cleavage during TypeIII CRISPR-Cas Immunity［J］. Cell, 2015, 161：1164-1174.

［17］Zalatan JG, Lee ME, Almeida R, et al. Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds［J］. Cell, 2015, 160：339-350.

［18］Ann Ran F, Cong L, Zhang F, et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9［J］. Nature, 2015, 520（7546）：186-191.

［19］Nihongak Y, Kawano F, Nakajima T, et al. Photoactivatable CRISPR-Cas9 for optogenetic genome editing［J］. Nature Biotechnology, 2015：1-7.

［20］Heckl D, Kowalczyk MS, Yudovich D, et al. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing［J］. Nat Biotechnol, 2014, 32（9）：941-946.

［21］Chen SD, Sanjana NE, Zheng KJ, et al. Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis［J］. Cell, 2015, 160：1246-1260.

［22］ Ebina H, Misawa N, Kanemura Y, et al. Harnessing the CRISPR/ Cas9 system to disrupt latent HIV-1 provirus［J］. Sci Rep, 2013, 3（2510）： 1-7.

［23］韓英倫, 李慶偉. CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)在HIV-1感染治療中的應(yīng)用進(jìn)展［J］. 遺傳, 2016, 38（1）：9-16.

［24］ Wang J, Quake S R. RNA-guided endonuclease provides a therapeutic strategy to cure latent herpesviridae infection［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111（36）：13157-13162.

［25］Ma XL, Zhang QY, Zhu QL, et al. A robust CRISPR/Cas9 system for convenient, high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants［J］. Mol Plant, 2015：8（8）：1274-1284.

［26］Liu Y, Ma S, Wang X, et al. Highiy efficient muitiplex targeted mutagenesis and genomic stucture variation in Bombyx mori cells using CRISPR/Cas9［J］. Insect Biochem Mol Biol, 2014, 49：35-42.

［27］辛虎虎. CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)在家蠶基因功能研究中的應(yīng)用［D］. 杭州：浙江大學(xué), 2015.

［28］Kistler KE, Vosshall LB, Matthews BJ. Genomeengineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti［J］. Cell Rep, 2015, 11（1）：51-60.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Latest Research Progress on CRISPR/Cas System

LIU Ni1LU Qin1LIU Juan1CHEN Hang1，2
（1. The Research Institute of Resources Insects，the Chinese Academy of Forestry，Kunming 650224；2. Key Laboratory of Cultivation and Utilization of Resource Insects，State Forestry Administration，Kunming 650224）

The CRISPR/Cas is a system of immune mechanism for bacteria and archaea against exogenous virus and plasmid DNA invasion. As a novel genome editing technology，it possesses the advantages of a simple design，strong specificity，and high efficiency，bringing revolutionary breakthrough for genome directional modification，regulation and application. We introduce the research background，the existence type of the CRISPR/Cas system，and basic action mechanism of Type II and Type III CRISPR system and new research breakthrough in detailed，for providing the reference for readers and researchers in related fields.

genome editing technology；CRISPR/Cas system；Cas9；scRNA

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.008

2016-05-13

國家林業(yè)局948項目（2014-4-66），云南省科技計劃面上項目（2013FB087）

劉妮，女，碩士研究生，研究方向：資源昆蟲分子生態(tài)與進(jìn)化；E-mail：liuni0918@163.com

陳航，男，博士，副研究員，研究方向：資源昆蟲生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：stuchen6481@gmail.com