閆寧楊智敏尚立國(guó)戴淑玲戰(zhàn)崳華陸偉林敏燕永亮

（1. 西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽(yáng) 621010；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

非生物脅迫條件下施氏假單胞菌生物膜形成規(guī)律的研究

閆寧1，2楊智敏2尚立國(guó)2戴淑玲1，2戰(zhàn)崳華2陸偉2林敏2燕永亮2

（1. 西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽(yáng) 621010；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

旨在系統(tǒng)研究非生物脅迫因素對(duì)固氮施氏假單胞菌A1501生物膜形成能力的影響，測(cè)定了不同NaCl濃度、pH值、溫度等培養(yǎng)條件下A1501生長(zhǎng)及其生物膜形成能力的變化規(guī)律。結(jié)果顯示，上述3種環(huán)境因素均對(duì)A1501菌的生長(zhǎng)及生物膜形成具有影響，且呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性。NaCl濃度2 mmol/L、pH值6.8、溫度30℃是A1501的最適生長(zhǎng)條件，而在0.6 mol/L的NaCl、pH值6.0及溫度40℃等脅迫條件下，A1501菌的生物膜形成量均達(dá)到最高，分別為最佳生長(zhǎng)條件下的7.8、7.0和2.0倍。在測(cè)試的諸因素中，NaCl濃度對(duì)A1501生物膜形成影響最大。以上結(jié)果表明，生物膜的形成與菌體生長(zhǎng)負(fù)相關(guān)，即高鹽、弱酸、高溫等條件不利于A1501的生長(zhǎng)，但刺激了其生物膜的形成。

施氏假單胞菌A1501；非生物脅迫；生物膜形成；生長(zhǎng)特性；環(huán)境因素

細(xì)菌生物膜（bacterial biofilm）是指細(xì)菌為適應(yīng)自然環(huán)境，在生長(zhǎng)過程中逐漸形成附著于惰性或者活性實(shí)體表面的特殊的功能性結(jié)構(gòu)。自然界中絕大多數(shù)細(xì)菌可以在不同的物體表面形成生物膜［1］。生物膜中除細(xì)菌外，還含有其分泌的胞外大分子多聚物、吸附的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物及細(xì)胞裂解產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂及磷脂等物質(zhì)［2］。生物膜最大的特點(diǎn)是內(nèi)部細(xì)胞功能的異質(zhì)性，不同深度及不同部位的細(xì)菌體現(xiàn)出有差異的基因表達(dá)模式，也發(fā)揮著不同的功能。細(xì)菌生物膜由內(nèi)到外分為里層菌與表層菌，它們的呼吸的強(qiáng)弱及活性、細(xì)菌RNA含量、蛋白質(zhì)的合成途徑均不同。表層菌與浮游菌相似，它們易獲得氧氣與營(yíng)養(yǎng)，故代謝較活躍、分裂快、菌體體積亦較大，并且對(duì)外界環(huán)境更為敏感。里層菌則不同，它們不易獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，代謝率較低，多處于休眠狀態(tài)，一般不進(jìn)行頻繁分裂，菌體體積也較小。

生物膜對(duì)微生物的生存與發(fā)展具有重要功能，它有利于細(xì)胞聚集、成膜，是細(xì)胞的天然保護(hù)屏障，保護(hù)微生物耐受紫外輻射、干旱、pH變化、抗菌劑等影響，可作為細(xì)胞代謝二次能源碳源，供微生物在營(yíng)養(yǎng)匱乏環(huán)境維持生長(zhǎng)。在生物膜中，細(xì)菌個(gè)體聚集在一起可以進(jìn)行協(xié)同代謝，許多遺傳物質(zhì)也可以進(jìn)行橫向傳遞，從而為細(xì)菌群體更快的協(xié)同進(jìn)化提供重要的保障［3］。細(xì)菌形成生物膜不但有抗逆性、抗藥性的重要作用，在協(xié)助細(xì)菌吸附、侵染動(dòng)植物的過程中也發(fā)揮著特殊的功能。例如，銅綠假單胞菌形成生物膜有助于增強(qiáng)其致病性［4］；有益生防菌枯草芽孢桿菌可以在番茄根系形成濃密的生物膜，提高了其定殖能力，防止病原真菌的侵染，其對(duì)番茄青枯病的防治與生物膜形成能力呈正相關(guān)［5］；生物膜的組成成分胞外多糖可以增強(qiáng)根瘤菌向根毛的吸附，而且對(duì)侵染新生表皮的根毛至關(guān)重要，進(jìn)而影響了最終共生固氮體系的建立［6］。

生物膜的形成受到多種環(huán)境因素的影響，如營(yíng)養(yǎng)與代謝信號(hào)［7］、無(wú)機(jī)物［7］、群體感應(yīng)信號(hào)［8］、抗菌劑［7］、滲透壓、酒精、pH、溫度、氧氣的濃度［9］等均可以影響生物膜的形成。已有前人研究表明，脅迫環(huán)境可以調(diào)節(jié)惡臭假單胞菌［10，11］、根瘤菌［12］等細(xì)菌生物膜的形成。

施氏假單胞菌A1501（Pseudomonas stutzeri）是一株革蘭氏陰性菌，分離自水稻根際，是假單胞菌屬中發(fā)現(xiàn)的僅有的具有固氮能力的菌株，該菌可定殖在禾本科作物水稻根際進(jìn)行聯(lián)合固氮，促進(jìn)水稻生長(zhǎng)［13］，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要應(yīng)用價(jià)值。將A1501菌開發(fā)成為微生物肥料，應(yīng)用于大田生產(chǎn)，不僅可以降低農(nóng)業(yè)投入，還具有環(huán)境友好、保護(hù)生物多樣性等諸多優(yōu)點(diǎn)。相關(guān)實(shí)驗(yàn)室圍繞A1501菌的固氮基因表達(dá)調(diào)控、環(huán)境適應(yīng)機(jī)制等工作開展了大量的研究［14，15］，但關(guān)于A1501生物膜形成機(jī)制及其在根際定殖相關(guān)的機(jī)制研究未見報(bào)道，相關(guān)環(huán)境因素對(duì)A1501生物膜形成能力的影響有關(guān)研究未曾開展。

我國(guó)土地幅員遼闊，不同地域具有溫度多樣性的環(huán)境。并且，由于自然因素及人為因素的原因，分布有廣大的鹽堿化、酸化土地。這些脅迫環(huán)境會(huì)抑制微生物生長(zhǎng)，降低微生物活性，改變微生物結(jié)構(gòu)，對(duì)微生物具有一定的危害作用。施氏假單胞菌A1501作為一株具有重要應(yīng)用潛力的禾本科固氮菌，其田間應(yīng)用效果易受到這些環(huán)境因素的影響。所以，本實(shí)驗(yàn)欲通過測(cè)定不同濃度NaCl、pH值、溫度等條件對(duì)A1501菌的生長(zhǎng)狀況、生物膜形成的影響，試圖揭示不同因素在生物膜形成過程中的作用，對(duì)A1501高效優(yōu)質(zhì)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的理論參考與實(shí)踐指導(dǎo)意義，為研究A1501的生物膜分子調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基與主要試劑 LB培養(yǎng)基：氯化鈉10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，pH值 調(diào)節(jié)至7。高壓滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌20 min。K培養(yǎng)基：KH2PO40.4 g/L，K2HPO40.1 g/L，NaCl 0.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L，F(xiàn)e（SO4）3·H2O 0.01 g/L，NaMoO4·H2O 0.01 g/L，乳 酸 鈉 6 mL/L、（NH4）2SO40.4 g/L，pH調(diào) 節(jié) 至6.8。高壓滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌30 min。結(jié)晶紫購(gòu)自Aladdin公司，胰蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自O(shè)XOID公司，本實(shí)驗(yàn)所用其他培養(yǎng)基試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將A1501菌株在LB培養(yǎng)基中30℃ 220 r/min培養(yǎng)過夜，在4℃條件下 5 000 r/min離心10 min收集菌體，用液體K培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌懸液的光密度值OD600=1.0，按1∶10的比例轉(zhuǎn)接至新鮮液體K培養(yǎng)基中，體積為20 mL，此時(shí)菌液OD600= 0.1，每個(gè)條件設(shè)置3個(gè)重復(fù)，置30℃搖床中進(jìn)行培養(yǎng)。每2 h測(cè)定一次OD600的值，連續(xù)測(cè)定至12 h。記錄數(shù)據(jù)并分析結(jié)果，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.2 生物膜的培養(yǎng) 將LB固體平板上新鮮活化的A1501菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，30℃ 220 r/min過夜培養(yǎng)。將菌體5 000 r/min離心10 min，棄上清，利用生理鹽水洗滌菌體，再次5 000 r/min離心10 min，棄上清，生理鹽水懸浮菌體調(diào)整OD600值為2。將OD600為2的菌液按1∶10的比例接入新鮮的K培養(yǎng)基中，使初始OD600為0.2。混勻后以150 μL每孔加入96孔聚苯乙烯板中，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置7個(gè)平行，以等量的無(wú)菌培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組。于30℃靜置培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 生物膜形成能力的測(cè)定 收集懸浮細(xì)菌至1.5 mL離心管中，每孔加入140 μL蒸餾水輕柔沖洗殘留浮游細(xì)菌，再加入150 μL 1%結(jié)晶紫染色10 min，倒掉染色液，蒸餾水清洗未結(jié)合的結(jié)晶紫，晾干后溶解于160 μL 30%乙酸，用酶標(biāo)儀測(cè)定溶液在OD560處的吸光值。同時(shí)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定懸浮細(xì)菌OD600處吸光值。

1.2.4 培養(yǎng)條件的設(shè)定

1.2.4.1 NaCl濃度的設(shè)定 分別配置NaCl濃度為2 mmol/L，0.3、0.4、0.5、0.6和0.7 mol/L 的K培養(yǎng)基，測(cè)定不同NaCl濃度條件下形成生物膜的OD560值與細(xì)菌生長(zhǎng)量的OD600值。

1.2.4.2 pH的設(shè)定 配置K培養(yǎng)基，分裝后調(diào)整培養(yǎng)基pH分別為5.0、6.0、6.8、8.0、9.0和10.0、測(cè)定不同pH值條件下形成生物膜的OD560值與細(xì)菌生長(zhǎng)量的OD600值。

1.2.4.3 溫度梯度的設(shè)定 將A1501菌置于15、20、25、30、37和40℃靜置培養(yǎng)24 h，測(cè)定不同培養(yǎng)溫度下形成生物膜的OD560值與細(xì)菌生長(zhǎng)量的OD600值。

每批實(shí)驗(yàn)只改變單一因子條件，若無(wú)特殊說(shuō)明，NaCl濃度為2 mmol/L，pH6.8，溫度為30℃。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±SD（x-±s）表示。采用SPSS 24.0軟件，對(duì)細(xì)菌在不同環(huán)境條件下生物膜形成量進(jìn)行LSD多重比較。以P＜0.05為方差有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NaCl濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)及生物膜形成能力的影響

本實(shí)驗(yàn)研究了NaCl濃度對(duì)A1501生長(zhǎng)速度與生物膜形成的影響。不同NaCl濃度對(duì)A1501生長(zhǎng)的影響（圖1）顯示，當(dāng)NaCl濃度為2 mmol/L時(shí)A1501生長(zhǎng)速率最快，并且3個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期區(qū)分非常明顯：0-2 h為調(diào)整期，2-10 h為對(duì)數(shù)期，10 h后進(jìn)入平臺(tái)期。而提高NaCl濃度后，在0.3-0.6 mol/L的范圍內(nèi)，隨著NaCl濃度的不斷升高，調(diào)整期逐漸延長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度逐漸變緩且菌體濃度依次降低，12 h仍未到達(dá)平臺(tái)期。因此，高濃度的NaCl對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)具有抑制作用。

圖1 K培養(yǎng)基添加不同濃度NaCl條件下施氏假單胞菌A1501的生長(zhǎng)曲線

不同NaCl濃度對(duì)A1501生物膜形成的影響（圖2）顯示，成膜量隨著NaCl濃度升高先增加后下降。當(dāng)NaCl濃度為0.6 mol/L時(shí)，生物膜的形成能力最強(qiáng)。在0.002-0.6 mol/L的范圍內(nèi)，隨著NaCl濃度的升高其生物膜形成能力顯著提高（P＜0.05）；超過0.6 mol/L時(shí)，成膜量開始下降（P＜0.05），并且NaCl濃度為0.7 mol/L時(shí)所形成生物膜量與0.5 mol/L無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。所以低濃度的NaCl（2 mmol/L）有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)，在0.3-0.6 mol/L NaCl范圍內(nèi)，A1501生長(zhǎng)速度逐漸降低，而生物膜的形成量依次增加，0.6 mol/L NaCl培養(yǎng)條件下生物膜形成量達(dá)到最大，約為最適生長(zhǎng)條件（2 mmol/L）的7.8倍。由此可見，低濃度NaCl環(huán)境有利于細(xì)菌生長(zhǎng)，但不利于生物膜的形成；隨著NaCl濃度的增加，菌體所受到的鹽脅迫程度逐漸增強(qiáng)，抑制了A1501的生長(zhǎng)，卻促進(jìn)了其生物膜的形成。

圖2 培養(yǎng)基中添加不同濃度NaCl對(duì)A1501生物膜形成的影響

2.2 pH值對(duì)生物膜形成的影響

本實(shí)驗(yàn)探究了在pH值5.0-10.0的范圍內(nèi)，A1501生長(zhǎng)的變化（圖3）及其對(duì)生物膜形成量的影響（圖4）。pH值為6.8-9.0時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)速度最快，且生長(zhǎng)曲線基本吻合，10 h到達(dá)平臺(tái)期，12 h OD600終濃度達(dá)到1.4（圖3）。pH值增加至10.0時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)速度略變慢，8 h即進(jìn)入平臺(tái)期，12 h OD600終濃度僅為1.2。而pH值為5.0-6.0時(shí)，A1501的生長(zhǎng)被抑制，OD600值始終保持在0.1。結(jié)果表明，A1501適宜生活在偏堿性環(huán)境中，在pH值6.8-9.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)速率最快。

圖3 不同pH值培養(yǎng)條件下A1501的生長(zhǎng)曲線

圖4 不同pH值培養(yǎng)條件下A1501生物膜形成的影響

相同條件下測(cè)定生物膜的形成量，如圖4所示：pH值為6.0時(shí)，A1501的生物膜形成量最多；在培養(yǎng)液pH值為5.0的酸性條件下，A1501僅形成微量的生物膜；pH值為6.0-9.0時(shí)，生物膜形成能力呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)（P＜0.05）；當(dāng)pH值為10.0時(shí)，生物膜形成量與pH值9.0無(wú)顯著差異（P＞0.05）。結(jié)合生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果，A1501較適宜在中性及偏堿性的條件下生長(zhǎng)，在pH值為6.0的酸性條件下A1501生物膜形成的量約為最適生長(zhǎng)條件的7.0倍。由此可得，中性與偏堿性環(huán)境適宜A1501生長(zhǎng)但不利于生物膜的形成；偏酸性的環(huán)境不利于A1501的生長(zhǎng)，但促進(jìn)了菌體生物膜的形成。

2.3 溫度對(duì)生物膜形成的影響

為探究溫度對(duì)A1501生長(zhǎng)與生物膜形成的影響，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了15-40℃范圍內(nèi)A1501的生長(zhǎng)曲線（圖5）與生物膜形成量（圖6）。如圖5所示，隨溫度的變化細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線呈規(guī)律性變化。在20-40℃范圍內(nèi)，隨溫度的升高，細(xì)菌的生長(zhǎng)量逐漸增加，生長(zhǎng)速度逐漸增快。當(dāng)30-40℃培養(yǎng)時(shí)，10 h即達(dá)到平臺(tái)期，而20-25℃培養(yǎng)時(shí)12 h仍未到達(dá)平臺(tái)期，低溫環(huán)境使A1501的生長(zhǎng)受到明顯抑制。但是實(shí)驗(yàn)過程中觀察到，當(dāng)37-40℃培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中出現(xiàn)了細(xì)菌抱團(tuán)的現(xiàn)象，而在30℃時(shí)未觀察到類似現(xiàn)象，是否因?yàn)?7-40℃相對(duì)于A1501為高溫脅迫環(huán)境促使細(xì)菌抱團(tuán)仍需要后續(xù)探索。此外，前人研究表明在N2培養(yǎng)下，A1501的最適溫度為30℃，溫度達(dá)40℃時(shí)固氮活性明顯下降。所以，雖然40℃培養(yǎng)時(shí)生成的細(xì)菌生物量最多，但產(chǎn)生了抱團(tuán)的現(xiàn)象，細(xì)菌的固氮活性也明顯降低，推測(cè)40℃為A1501的高溫脅迫環(huán)境。30℃是施氏假單胞菌A1501固氮與生長(zhǎng)的最適溫度。

圖5 不同溫度培養(yǎng)下A1501的生長(zhǎng)曲線

溫度變化對(duì)A1501的生物膜形成的影響（圖6）顯示，40℃時(shí)A1501生物膜形成量最多，顯著高于其他溫度組（P＜0.005）。當(dāng)15-25℃培養(yǎng)時(shí)，隨著溫度的升高，成膜量顯著增多（P＜0.005）。相比較25℃，30、37與20℃培養(yǎng)時(shí)成膜量顯著下降，但三者之間無(wú)顯著性差異（P＞0.005）。經(jīng)計(jì)算，40℃培養(yǎng)時(shí)所形成生物膜量為最適生長(zhǎng)溫度的2倍。由此可得，15-25℃時(shí)A1501生長(zhǎng)速率加快，生物膜形成也逐漸增強(qiáng)。30℃為A1501的最適生長(zhǎng)溫度，但不利于生物膜的形成，40℃不利于A1501的生長(zhǎng)，但促進(jìn)了生物膜的形成。

圖6 溫度對(duì)A1501生物膜形成的影響

3 討論

施氏假單胞菌A1501是一株聯(lián)合固氮菌，可附著、侵入禾本科植物的根際，具有較強(qiáng)的固氮能力，將固氮產(chǎn)物分泌到土壤中供植物吸收利用，是一株具有極大應(yīng)用潛力的微生物菌肥。相比較化學(xué)肥料，該菌對(duì)減少環(huán)境污染，改善土壤理化性質(zhì)，提高土壤肥力水平具有深刻長(zhǎng)遠(yuǎn)的應(yīng)用價(jià)值。生物膜的形成可能對(duì)A1501定殖于植物根際并發(fā)揮固氮功能具有重要意義。由于外界環(huán)境的復(fù)雜多變會(huì)影響A1501的生長(zhǎng)與生物膜形成，因此本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定NaCl、pH、溫度3個(gè)因素對(duì)A1501生長(zhǎng)與生物膜形成的影響，發(fā)現(xiàn)二者呈現(xiàn)出一定的規(guī)律：環(huán)境條件適于A1501生長(zhǎng)時(shí)，細(xì)菌傾向于快速生長(zhǎng)，只形成少量的生物膜；A1501面臨逆境脅迫時(shí)，細(xì)菌傾向于形成大量的生物膜，生長(zhǎng)速率顯著降低。生物膜的形成與生長(zhǎng)負(fù)相關(guān)，說(shuō)明A1501形成生物膜是一種應(yīng)對(duì)外界脅迫環(huán)境的生存策略，該結(jié)果可為未來(lái)的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

高濃度的NaCl抑制了施氏假單胞菌A1501的生長(zhǎng)，說(shuō)明A1501適宜在低濃度NaCl的環(huán)境中生長(zhǎng)。0.6 mol/L NaCl刺激了A1501生物膜的形成，類似現(xiàn)象還有0.27 mol/L NaCl促進(jìn)金黃色葡萄球菌生物膜形成［16］，0.12 mol/L NaCl的環(huán)境下惡臭假單胞菌胞外大分子物質(zhì)（碳水化合物、胞外蛋白、胞外DNA）的分泌量都顯著增加，其中以胞外蛋白的增加最為明顯［17］。不同的是，利用PVC材料檢測(cè)基本培養(yǎng)基NaCl濃度由0增加至0.4 mol/L時(shí)熒光假單胞菌的生物膜形成，發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度為0.2 mol/L或更高時(shí)，生物膜量降低了4倍［18］。生物膜對(duì)NaCl響應(yīng)多樣性可能是調(diào)控機(jī)制與細(xì)菌為適應(yīng)環(huán)境共同作用的結(jié)果。環(huán)境中鹽濃度較低時(shí)，A1501傾向于生長(zhǎng)繁殖，但鹽濃度上升不利于其生長(zhǎng)時(shí)，A1501傾向于合成生物膜以應(yīng)對(duì)脅迫環(huán)境。推測(cè)由于生物膜具有親水性，合成更多的胞外多聚物有利助于保持含水環(huán)境，從而維持膜內(nèi)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。

A1501可以在pH值6.8-10.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)，pH為酸性時(shí)抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)，但刺激了生物膜的形成。相似的現(xiàn)象，惡臭假單胞菌CZ1的適宜生長(zhǎng)pH值為7.0-8.5，pH值5.5-6.5時(shí)胞外多聚物顯著增加［17］。推測(cè)胞外多聚物是一種帶電荷的大分子物質(zhì)，可以為膜內(nèi)細(xì)胞提供一道緩沖屏障，維持細(xì)胞內(nèi)的pH平衡，從而保護(hù)細(xì)菌在酸性環(huán)境下生存。Wolters［19］認(rèn)為土壤酸堿度可以決定微生物種類的分布，一般來(lái)說(shuō)，細(xì)菌、放線菌喜好中性偏堿的土壤并且生長(zhǎng)較好，真菌一般較耐酸。巧合的是，施氏假單胞菌A1501與惡臭假單胞菌CZ1都分離自土壤，且在中性偏堿性的條件下長(zhǎng)勢(shì)較好，面臨偏酸性的環(huán)境時(shí)生物膜形成量最多，可以推測(cè)土壤細(xì)菌的生存環(huán)境由中性轉(zhuǎn)變?yōu)樗嵝圆焕谄渖L(zhǎng)時(shí)，傾向于形成大量生物膜渡過酸性脅迫環(huán)境。不同的情況是表皮葡萄球菌［20］與金黃葡萄球菌［21］最適生長(zhǎng)pH為7.0，均在pH值為7.0時(shí)生物膜形成能力最強(qiáng)。推測(cè)二者均寄生在人體，在pH7.0的穩(wěn)定條件下快速生長(zhǎng)，但為了抵御免疫系統(tǒng)的傷害與藥物的作用，同時(shí)形成大量的生物膜以維持其生存。生物膜對(duì)pH響應(yīng)的多樣性是細(xì)菌對(duì)生存環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果。

A1501的最適生長(zhǎng)溫度為30℃，當(dāng)40℃培養(yǎng)時(shí)生物膜形成能力最強(qiáng)。在惡臭假單胞菌中發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，28℃是惡臭假單胞菌CZ1的最適生長(zhǎng)溫度，生物膜胞外大分子物質(zhì)（碳水化合物、胞外蛋白、胞外DNA）隨溫度的升高（15-35℃）都呈上升趨勢(shì)，至35℃時(shí)分泌量最大，其中的主要增長(zhǎng)組分為胞外蛋白［17］。推測(cè)土壤環(huán)境中，高溫不利于水分的持留，胞外多聚物分泌有利于形成一系列的含水微環(huán)境，從而保護(hù)細(xì)胞免于干燥而死亡。不同的情況是金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌最適生長(zhǎng)溫度為37℃，在20-37℃培養(yǎng)時(shí)，隨著溫度的升高（20-37℃），二者形成生物膜的量均逐漸升高［22］。37℃形成生物膜能力最強(qiáng)可能是為了抵御人體免疫系統(tǒng)的傷害及增強(qiáng)其耐藥性。

通過比較3種環(huán)境因素對(duì)A1501生長(zhǎng)速率的影響可以發(fā)現(xiàn)，A1501對(duì)pH值的變化最敏感：當(dāng)pH值由7.0降至6.0時(shí)，A1501由最快生長(zhǎng)速率降低為停止生長(zhǎng)，說(shuō)明pH由中性變?yōu)樗嵝詴r(shí)顯著降低了A1501的生長(zhǎng)速率。而隨著NaCl濃度逐漸升高、溫度逐漸降低，A1501長(zhǎng)勢(shì)逐漸變緩，至0.6 mol/L NaCl、20℃仍可緩慢生長(zhǎng)，說(shuō)明A1501對(duì)NaCl濃度與溫度變化有一定的適應(yīng)能力。由于pH值可以影響微生物細(xì)胞膜的通透性與穩(wěn)定性，改變細(xì)胞內(nèi)大分子電荷的屬性與數(shù)量，改變外界可利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶解程度［23］。推測(cè)H+對(duì)A1501細(xì)胞膜、胞內(nèi)大分子傷害較大或外界營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的可利用率下降。通過比較環(huán)境對(duì)A1501生物膜形成的影響可以發(fā)現(xiàn)：0.6 mol/L NaCl、pH值6.0、40℃條件時(shí)生物膜形成量依次為最適生長(zhǎng)條件的7.8、7.0和2.0倍。3種環(huán)境刺激強(qiáng)弱依次為NaCl濃度＞pH＞溫度，說(shuō)明NaCl濃度的變化對(duì)A1501生物膜的刺激效果最強(qiáng)。高鹽引起的高滲環(huán)境會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的不平衡，導(dǎo)致細(xì)胞脫水從而干擾細(xì)菌的正常生理代謝水平。推測(cè)面臨高濃度Na+或胞外滲透壓升高的不利環(huán)境時(shí)，A1501生物膜的合成效率最快。

生物膜結(jié)構(gòu)由諸多生物大分子組成，如胞外蛋白質(zhì)、胞外多糖、eDNA等，關(guān)于環(huán)境對(duì)生物膜組分的調(diào)控途徑已有大量研究，其中胞外多糖報(bào)道最多。例如，選取20、30和37℃培養(yǎng)銅綠假單胞菌生物膜，測(cè)定溫度對(duì)藻酸鹽合成基因algD轉(zhuǎn)錄水平的影響，發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高，algD轉(zhuǎn)錄水平顯著升高［22］，溫度的升高可以刺激大腸桿菌聚-N-乙酰葡萄糖胺（PNAG）合成基因的表達(dá)水平［24］，滲透壓環(huán)境可以調(diào)節(jié)中華根瘤菌的胞外多糖的合成［25］。說(shuō)明胞外多糖的合成與脅迫環(huán)境有著密切的聯(lián)系，一定程度揭示了脅迫環(huán)境對(duì)細(xì)菌生物膜的調(diào)控機(jī)制。通過同源比對(duì)分析，預(yù)測(cè)出A1501基因組中也有大量生物膜相關(guān)基因，如纖維素合成基因、脂多糖合成基因、鞭毛菌毛合成基因。這些基因與相關(guān)途徑在0.6 mol/L NaCl、pH6、40℃等脅迫條件下如何調(diào)控或參與了A1501生物膜的形成仍需要后續(xù)研究。

4 結(jié)論

本研究選取NaCl濃度、pH、溫度3個(gè)環(huán)境因素，測(cè)定它們對(duì)施氏假單胞菌A1501生長(zhǎng)速率及生物膜形成的影響，結(jié)果顯示NaCl濃度為2 mmol/L、pH值6.8、溫度30℃的培養(yǎng)條件最適于A1501的生長(zhǎng)，但不適于生物膜的形成；在NaCl濃度為0.6 mol/L，pH值6.0，溫度40℃的脅迫條件不利于A1501的生長(zhǎng)但刺激了生物膜的形成。說(shuō)明生物膜的形成與菌體生長(zhǎng)負(fù)相關(guān)。外界環(huán)境適宜時(shí)，A1501快速生長(zhǎng)而形成少量的生物膜，面臨非生物脅迫時(shí)，A1501生長(zhǎng)受到抑制，促進(jìn)了其生物膜的形成。

［1］Costerton JW. Introduction to biofilm［J］. International Journal ofAntimicrobial Agents, 1999, 11（3）：217-221.

［2］Steinberger RE, Holden PA. Macromolecular composition of unsaturated Pseudomonas aeruginosa biofilms with time and carbon source［J］. Biofilms, 2004, 1（1）：37-47.

［3］Jefferson KK. What drives bacteria to produce a biofilm?［J］. FEMS Microbiology Letters, 2004, 236（2）：163-173.

［4］Wang Y, Dai Y, Zhang Y, et al. Effects of quorum sensing autoinducer degradation gene on virulence and biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa［J］. Science in China Series C：Life Sciences, 2007, 50（3）：385-391.

［5］Chen Y, Yan F, Chai Y, et al. Biocontrol of tomato wilt disease by Bacillus subtilis isolates from natural environments depends on conserved genes mediating biofilm formation［J］. Environmental Microbiology, 2013, 15（3）：848-864.

［6］Smit G, Swart S, Lugtenberg BJJ, et al. Molecular mechanisms of attachment of Rhizobium bacteria to plant roots［J］. Molecular Microbiology, 1992, 6（20）：2897-2903.

［7］Karatan E, Watnick P. Signals, regulatory networks, and materials that build and break bacterial biofilms［J］. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2009, 73（2）：310-347.

［8］Lee J, Zhang L. The hierarchy quorum sensing network in Pseudomonas aeruginosa［J］. Protein & Cell, 2015, 6（1）：26-41.

［9］G?tz F. Staphylococcus and biofilms［J］. Molecular Microbiology, 2002, 43（6）：1367-1378.

［10］Lin H, Chen G, Long D, et al. Responses of unsaturated Pseudomonas putida CZ1 biofilms to environmental stresses in relation to the EPS composition and surface morphology［J］. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2014, 30（12）：3081-3090.

［11］Nielsen L. Novel components of Pseudomonas putida biofilm exopolymeric matrix and a transcriptome analysis of the effects of osmotic and matric stress［M］. 2010.

［12］Rinaudi LV, Giordano W. An integrated view of biofilm formation in rhizobia［J］. FEMS Microbiology Letters, 2010, 304（1）：1-11.

［13］ 丘元盛, 周淑萍, 莫小真, 等. 稻根聯(lián)合固氮細(xì)菌的研究——Ⅰ. 菌種的分離和鑒定［J］. 微生物學(xué)報(bào), 1981, 4：468-472.

［14］Zhan Y, Yan Y, et al. The novel regulatory ncRNA, NfiS, optimizes nitrogen fixation via base pairing with the nitrogenase gene nifK mRNA in Pseudomonas stutzeri A1501［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2016：201604514.

［15］Yan Y, Yang J, Dou Y, et al. Nitrogen fixation island and rhizosphere competence traits in the genome of root-associated Pseudomonas stutzeri A1501［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2008, 105（21）：7564-7569. .

［16］Lim Y, Jana M, Luong TT, et al. Control of glucose-and NaClinduced biofilm formation by rbf in Staphylococcus aureus［J］. Journal of Bacteriology, 2004, 186（3）：722-729.

［17］陳光村. 惡臭假單胞菌CZ1非飽和生物膜耐受和累積重金屬的分子機(jī)制［D］. 杭州：浙江大學(xué), 2011.

［18］O’Toole GA, Kolter R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways：a genetic analysis［J］. Molecular Microbiology, 1998, 28（3）：449-461.

［19］Wolters V, Joergensen RG. Microbial carbon turnover in beech forest soils at different stages of acidification［J］. Soil Biology and Biochemistry, 1991, 23（9）：897-902.

［20］Chaieb K, Chehab O, et al. In vitro effect of pH and ethanol on biofilm formation by clinical ica-positive Staphylococcus epidermidis strains［J］. Annals of Microbiology, 2007, 57（3）：431-437.

［21］Zmantar T, Kouidhi B, Miladi H, et al. A microtiter plate assay for Staphylococcus aureus biofilm quantification at various pH levels and hydrogen peroxide supplementation［J］. The New Microbiologica, 2010, 33（2）：137.

［22］Abdallah M, Khelissa O, Ibrahim A, et al. Impact of growth temperature and surface type on the resistance of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus biofilms to disinfectants［J］. International Journal of Food Microbiology, 2015, 214：38-47.

［23］陳燕飛. pH對(duì)微生物的影響［J］. 太原師范學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2009, 3：121-124, 131.

［24］Cerca N, Jefferson KK. Effect of growth conditions on poly-N-acetyl glucosamine expression and biofilm formation in Escherichia coli［J］. FEMS Microbiology Letters, 2008, 283（1）：36-41.

［25］Breedveld MW, Zevenhuizen L, Zehnder AJB. Osmotically induced oligo-and polysaccharide synthesis by Rhizobium meliloti SU-47［J］. Microbiology, 1990, 136（12）：2511-2519.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Patterns of Biofilm Formation in Pseudomonas stutzei Under Abiotic Stresses

YAN Ning1，2YANG Zhi-min2SHANG Li-guo2DAI Shu-ling1，2ZHAN Yu-hua2LU Wei2LIN Min2YAN Yong-liang2
（1. School of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010；2. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

In order to systematically investigate the effects of abiotic stress factors on the growth and biofilm formation of Pseudomonas stutzeri A1501，we measured the variation patterns of growth and biofilm formation of A1501 under different NaCl concentrations，pH and temperature. The results revealed that above 3 environmental factors did influence the growth and the biofilm formation of A1501 strain with certain extent of regularity. The optimal growth condition of A1501 with those factors was 2 mmol/L NaCl，pH6.8，and 30℃，respectively. However，the biofilm formation reached the maximum in the stress condition of 0.6 mol/L NaCl，pH6.0，and 40℃ with 7.8-，7.0- or 2.0-fold increment compared to the optimal growth condition，respectively. Among the three factors，NaCl showed the most significant effect on the biofilm formation of A1501. In a conclusion，under the tested conditions，the biofilm formation of A1501 strain was negatively correlated with the growth of strain，i.e.，high salt，weak acid and high temperature were adverse to the growth of A1501，however，it stimulated the biofilm formation.

Pseudomonas stutzei A1501；abiotic stress；biofilm formation；growth characteristics；environmental factor

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.025

2016-11-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31470174，31570081，31470205），廣東省引進(jìn)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目（2013S033）

閆寧，男，碩士研究生，研究方向：固氮微生物學(xué)；E-mail：15701232990@163.com

燕永亮，男，博士，研究方向：固氮微生物分子生物學(xué)及基因工程；E-mail：yanyongliang@caas.cn