吳小麗劉盈盈江世杰，3陳云劉小利汪雨舟平淑珍王勁

（1. 西南科技大學生命科學與工程學院，綿陽 621000；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，北京 100081；3. 四川大學生命科學學院，成都 610065；4. 中國人民大學附屬中學，北京 100080）

鐵蛋白DrfE對耐輻射異常球菌抗氧化酶活性的影響

吳小麗1，2劉盈盈2江世杰2，3陳云2劉小利1，2汪雨舟4平淑珍2王勁1，2

（1. 西南科技大學生命科學與工程學院，綿陽 621000；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，北京 100081；3. 四川大學生命科學學院，成都 610065；4. 中國人民大學附屬中學，北京 100080）

為研究耐輻射異常球菌（Deinococcus radiodurans）中drfE編碼的鐵蛋白DrfE的功能，通過基因回補試驗構建drfE基因的回補菌株（pdrfE∷Δ），對野生型WT、突變株ΔdrfE及回補菌株pdrfE∷Δ進行不同濃度H2O2和NaCl脅迫，分別測定野生型WT、突變株ΔdrfE和回補菌株pdrfE∷Δ體內(nèi)Fe2+含量及抗氧化酶類活性。結(jié)果顯示，drfE基因缺失導致菌株對氧化和鹽脅迫敏感，該基因的回補能夠恢復菌株對氧化和鹽脅迫的抗性。drfE基因缺失導致耐輻射異常球菌體內(nèi)Fe2+濃度由232 μmol/L增加至293 μmol/L；80 mmol/L H2O2處理30 min后，突變株ΔdrfE的CAT活性下降32.74%，SOD下降41.3%。以上結(jié)果表明DrfE蛋白可能參與耐輻射異常球菌鐵代謝途徑，并且在細胞抗氧化體系中發(fā)揮重要作用。

耐輻射異常球菌；鐵蛋白DrfE；非生物脅迫；抗氧化酶；鐵離子

干旱、氧化、高鹽、輻射和極端溫度等非生物脅迫產(chǎn)生的大量活性氧分子（ROS）造成細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物和DNA等生物大分子的損傷，嚴重影響生物體正常的代謝進程［1-3］。據(jù)文獻報道，耐輻射異常球菌（Deinococcus radiodurans）可通過其體內(nèi)的抗氧化酶促防御系統(tǒng)清除ROS，從而降低ROS對細胞的毒性，減輕氧化脅迫，其抗氧化酶促防御系統(tǒng)主要包括：過氧化氫酶（Catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和過氧化物酶（Peroxidase，POD）等抗氧化酶［4-6］。鐵是生物體生長發(fā)育所必需的礦物質(zhì)元素，是生物體中眾多反應酶的輔因子和呼吸鏈的重要組成成分［7-9］，并能對生物體抗氧化酶的活性造成不同程度的影響［10］。然而，高濃度的鐵在生物體內(nèi)具有毒性，對生物體的生長具有抑制作用，生物體內(nèi)的Fe2+很容易與過氧化氫等發(fā)生反應產(chǎn)生OH·和

O2

·-等活性氧，對生物體造成氧化損傷［9，11］，在氧化脅迫和鐵代謝相互交織的情況下，CAT、SOD和POD等抗氧化酶的活性受到明顯的抑制，清除ROS的能力下降。

鐵蛋白（Ferritin）廣泛存在于動物、植物和細菌體內(nèi)，具有抗氧化脅迫、調(diào)節(jié)鐵代謝平衡和消除部分重金屬等有毒分子的毒害作用［12-15］，能同時去除過氧化氫脅迫和Fe2+所導致的細胞毒性［16，17］。鐵蛋白是一類由24個4股螺旋束結(jié)構單體亞基組成的高度對稱的球型外殼蛋白，具有鐵氧化還原酶中心，能夠截獲細胞間Fe2+并使其與鐵氧化酶結(jié)合，將其氧化為Fe3+后以水合氧化鐵礦物質(zhì)的形式儲存于蛋白內(nèi)部空腔中［18］，每分子蛋白空腔內(nèi)最多可以貯存4 500個鐵原子，因此能夠保護抗氧化酶類使其活性不受鐵的抑制，并保護細胞免受氧化損傷。目前關于鐵蛋白結(jié)構和功能的研究已有報道，例如，關于耐輻射異常球菌中由二聚體組成的Dps家族鐵蛋白功能的研究等［8］。

據(jù)文獻報道，耐輻射異常球菌（Deinococcus radiodurans）中drB0118基因編碼的蛋白為鐵蛋白，與氧化、高鹽和干燥等脅迫抗性相關［19-22］，我們將其命名為DrfE（Deinococcus radiodurans Ferritin）。劉盈盈等［22］對非生物脅迫條件下drfE基因的功能進行了初步探索，結(jié)果顯示該基因的缺失導致耐輻射異常球菌對高鹽和氧化脅迫敏感。為了驗證并進一步研究DrfE蛋白在非生物脅迫下的抗逆功能及作用機制，本研究構建回補菌株pdrfE∷Δ，驗證drfE在細胞耐受高鹽和氧化脅迫抗性中的作用，分析氧化脅迫下drfE基因的缺失對耐輻射異常球菌體內(nèi)CAT、SOD和POD酶活性的影響，探討DrfE蛋白在抗氧化及耐鹽過程中的作用，旨為進一步研究該菌的非生物脅迫抗性機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株質(zhì)粒和培養(yǎng)條件 野生型耐輻射異常球菌（Deinococcus radiodurans，DR）購自于中國科學院微生物菌種保藏中心；突變株ΔdrfE由本實驗室保存；高頻轉(zhuǎn)化受體菌大腸桿菌Escherichia coli trans 109購自北京全式金生物技術有限公司；pJET1.2/Blunt克隆載體購自Thermo公司；質(zhì)粒pRADZ3由本實驗室保存。大腸桿菌于LB培養(yǎng)基（1% Typtone，0.5% Yeast extract，1% NaCl，pH7.0，固體培養(yǎng)基含1.5%瓊脂）中37℃條件下培養(yǎng)，耐輻射異常球菌于TGY培養(yǎng)基（1% Typtone，0.5 % Yeast extract，0.1% Glucose，固體培養(yǎng)基含1.5%瓊脂）中30℃條件下培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶等購于New England Biolabs公司；細菌基因組提取試劑盒購自北京天根科技有限公司，常規(guī)質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收純化試劑盒購自Magen公司；氨芐青霉素和卡那霉素等試劑購于上海生工生物工程公司；H2O2、愈創(chuàng)木酚、氮藍四唑等抗氧化酶活測定所需試劑購于碧云天生物技術公司；其他生化試劑均為分析純。引物合成和基因測序均由華大基因完成。

1.2 方法

1.2.1 DrfE蛋白的生物信息學分析 從NCBI中獲取耐輻射異常球菌drfE基因序列及其編碼蛋白DrfE的氨基酸序列信息，運用SMART（http://smart.embl. de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1）在線工具對蛋白質(zhì)結(jié)構域進行分析；用BLASTP程序獲得與DrfE具有一定相似度的大腸桿菌（E. coli）等物種的蛋白序列，通過MEGA軟件對其進行序列比對分析。

1.2.2 功能回補菌株pdrfE∷Δ的構建 從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取drfE基因及其上游區(qū)域300 bp的序列（包含預測的啟動子區(qū)），利用Primer Premier 5.0設計引物pdrfE-F：5'-GCTCTAGAGCATCATCGTGCAG GGCCT-3'（劃線序列為Xba I酶切位點），pdrfE-R：5'-CGGGATCCTTACAGGCTGAGAATACTG-3'（劃線序列為BamH I酶切位點），引物由華大基因合成。以D. radiodurans基因組DNA為模板，使用pdrfEF/R引物擴增目的片段pdrfE，擴增產(chǎn)物長度為1 314 bp。PCR反應條件是：95℃預變性10 min；95℃變性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。

通過PCR產(chǎn)物回收完整的drfE基因，連接pJET1.2/Blunt克隆載體，構建pJET-drfE重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E. coli trans 109，挑取陽性轉(zhuǎn)化子測序。提取測序正確的重組pJET-drfE質(zhì)粒，用BamH I和Xba I酶切，同時用Xba I和BamH I酶切穿梭質(zhì)粒pRADZ3，純化回收1 214 bp的drfE基因片段和6 kb的Z3載體，并將回收的基因片段與pRADZ3載體連接，轉(zhuǎn)化E. coli trans 109，在含有50 μg/mL Amp的LB平板上篩選，獲得陽性轉(zhuǎn)化子。重組質(zhì)粒Z3-drfE進行菌落PCR驗證和Xba I和BamH I酶切驗證并測序。提取測序正確的重組質(zhì)粒Z3-drfE，線性轉(zhuǎn)化至突變株ΔdrfE中獲得回補菌株pdrfE∷Δ。

1.2.3 不同濃度H2O2和NaCl對菌株的沖擊實驗將活化的野生型WT、突變株ΔdrfE和回補菌株pdrfE∷Δ轉(zhuǎn)接于20 mL TGY液體培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min培養(yǎng)至對數(shù)初期（OD600=0.6-0.8）。分別取1 mL 野生型WT、突變株ΔdrfE和回補菌株pdrfE∷Δ菌液于1.5 mL EP管中。對于H2O2沖擊實驗，加入30% H2O2母液使其終濃度分別為0、60、80 mmol/L，混勻后30℃、220 r/min暗處理30 min。對于NaCl沖擊實驗，5 000 r/min離心5 min收集菌體，菌體分別用1 mL 4 mol/L NaCl和1 mL 5 mol/L NaCl重懸，對照組用無菌水重懸，30℃，220 r/min處理6 h。立即用無菌水進行梯度稀釋，每個梯度各取10 μL點在TGY固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)1-2 d后觀察菌落形成情況。實驗進行3次重復。

1.2.4 細胞內(nèi)鐵離子含量的測定 培養(yǎng)野生型WT、突變株ΔdrfE和回補菌株pdrfE∷Δ菌株至對數(shù)生長初期（OD600=0.6-0.8），收集1 L菌量，用PBS清洗2次（1 mmol/L EDTA，pH7.4），菌體烘干后采用ICP-MS的方法測定總Fe2+的含量［23］。測定之前將緩沖液作為對照，收集菌體的過程中所有器皿均用10%以上的硝酸浸泡過夜。

1.2.5 體內(nèi)抗氧化酶活的測定 培養(yǎng)野生型WT、突變株ΔdrfE和回補菌株pdrfE∷Δ菌株至對數(shù)生長初期（OD600=0.6-0.8），加入終濃度分別為0、60和80 mmol/L的H2O2溶液，在30℃、220 r/min分別處理15 min、30 min，然后分別于4℃、8 000 r/min離心收集菌體，200 mmol/L PBS（pH7.0）緩沖液清洗2次，PBS重懸后于冰上超聲破碎，4℃、12 000 r/min離心10 min收集蛋白上清液，并以相同生長期未經(jīng)H2O2處理的菌體蛋白作對照。蛋白濃度測定采用常規(guī)的Branford法。SOD活性的檢測采用王愛國等［24］的方法，以抑制氮藍四唑（NBT）光氧化還原50%的酶量為1個活力單位（U，U/mg·protein表示）；CAT活性的檢測采用曾韶西等［25］的方法，以1 min內(nèi)A240減少0.1的酶量為一個酶活單位（U）；POD活性的檢測采用愈創(chuàng)木酚法［26］，以1 min每毫克蛋白質(zhì)催化的470 nm下OD值變化0.01為一個酶活單位（U）。

2 結(jié)果

2.1 DrfE生物信息學分析

用SMART在線軟件進行功能結(jié)構域分析，結(jié)果顯示DrfE蛋白在61-237氨基酸位置存在Ferritin類似的保守結(jié)構域（圖1-A）。運用BLASTP在線軟件獲得來源于不同物種與DrfE序列相似的蛋白，包括Deinococcus deserti、Chitinophaga pinensis、Verticillium alfalfae及Gramella forsetii，對其進行序列比對分析。結(jié)果（圖1-B）顯示，DrfE蛋白與其他物種相似蛋白的序列一致性較低，但其在132、191和224位的谷氨酸Glu（E）非常保守；此外，His135、His227及Lys214位點也非常保守。根據(jù)已有研究推測，由這幾個保守位點組成的蛋白亞基可能具有鐵氧化酶（ferroxidase）的功能，能催化Fe2+轉(zhuǎn)變成Fe3+［27］。

2.2 回補菌株pdrfE∷Δ構建及驗證

回補菌株pdrfE∷Δ構建及驗證如圖2所示，重組質(zhì)粒Z3-pdrfE通過PCR、酶切及測序驗證（圖2-A）。將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化突變株ΔdrfE，經(jīng)含卡那霉素和氯霉素雙抗性的TGY平板篩選，獲得回補菌株pdrfE∷Δ，提取基因組進行PCR驗證。結(jié)果（圖2-B）顯示，以回補菌株pdrfE∷Δ基因組DNA為模板能擴增出1 314 bp的條帶，而以突變株ΔdrfE基因組DNA為模板，沒有擴增出條帶，表明所獲得的回補菌株pdrfE∷Δ完全正確。

圖1 DrfE蛋白結(jié)構域預測及序列比對

圖2 回補菌株pdrfE∷Δ的構建及驗證

2.3 drfE的缺失導致菌株對氧化和高鹽敏感

氧化和鹽脅迫會造成細胞損傷，導致細胞死亡。本實驗分別測定了野生型WT、突變株ΔdrfE和回補株pdrfE∷Δ在不同濃度H2O2沖擊下的生長情況。結(jié)果（圖3）顯示，正常培養(yǎng)條件下3種菌株的生存能力沒有顯著差異，60 mmol/L H2O2沖擊30 min后，突變株ΔdrfE對H2O2的敏感性顯著高于野生型WT和回補株pdrfE∷Δ，而80 mmol/L H2O2沖擊30 min后，突變株ΔdrfE幾乎不能生長。鹽脅迫表型與氧化脅迫類似，4 mol/L NaCl處理4 h后，突變株ΔdrfE對鹽的敏感性顯著高于野生型WT和回補菌株pdrfE∷Δ，5 mol/L NaCl處理4 h后，突變株ΔdrfE對鹽沖擊更加敏感（圖3）。以上結(jié)果說明，drfE基因缺失導致耐輻射異常球菌對H2O2和NaCl敏感，并且drfE基因的回補能夠恢復突變株在脅迫條件下的表型缺陷，表明DrfE蛋白在細胞抗氧化和耐鹽過程中發(fā)揮重要作用。

圖3 不同濃度H2O2和NaCl處理對野生型WT、突變株ΔdrfE和回補菌株pdrfE::Δ菌株生長的影響

2.4 DrfE對細胞內(nèi)鐵含量的影響

Fe是動植物和微生物生長發(fā)育必不可少的營養(yǎng)元素，低濃度的Fe在生物體正常的生理代謝中起著非常重要的作用，但高濃度的Fe對生物體的生長具有抑制和毒害作用。為了研究耐輻射異常球菌drfE基因的缺失對胞內(nèi)Fe2+含量的影響，本實驗測定了正常培養(yǎng)條件下野生型WT、突變株ΔdrfE和回補菌株pdrfE∷Δ細胞內(nèi)鐵離子的含量。結(jié)果（圖4）顯示，突變株ΔdrfE胞內(nèi)Fe2+含量高于野生型菌株WT和回補菌株pdrfE∷Δ，說明drfE的缺失會導致耐輻射異常球菌細胞內(nèi)Fe2+含量的增加，DrfE蛋白可能參與了耐輻射異常球菌體內(nèi)鐵代謝途徑。

圖4 野生型WT、突變株ΔdrfE和回補菌株pdrfE∷Δ菌株胞內(nèi)Fe2+的含量

2.5 不同濃度H2O2沖擊條件下drfE的缺失對耐輻射異常球菌抗氧化酶活性的影響

抗氧化酶是耐輻射異常球菌抗氧化體系的重要成員，主要參與細胞體內(nèi)的抗氧化反應。為了研究drfE缺失對抗氧化酶活性的影響，本研究分別測定了終濃度為60 mmol/L和80 mmol/L H2O2分別處理15和30 min條件下，野生型WT、突變株ΔdrfE和回補菌株pdrfE∷Δ體內(nèi)CAT、SOD和POD活性，并設置未經(jīng)H2O2處理的菌株為對照。結(jié)果（圖5-A）顯示，在未經(jīng)H2O2處理條件下，突變株ΔdrfE的CAT和SOD活性低于野生型WT和回補菌株pdrfE∷Δ，60 mmol/L H2O2處理15 min后，突變株ΔdrfE的CAT和SOD活性顯著低于野生型WT和回補菌株pdrfE∷Δ，經(jīng)80 mmol/L H2O2處理15 min后，CAT和SOD活性下降更加明顯。同樣的，用濃度為60、80 mmol/L H2O2處理30 min后，突變株ΔdrfE的CAT和SOD活性顯著低于野生型WT和回補菌株pdrfE∷Δ（圖5-B）。在正常培養(yǎng)條件和H2O2沖擊條件下，野生型菌株WT、突變株ΔdrfE和回補菌株pdrfE∷Δ體內(nèi)POD活性均無顯著變化（圖5）。由此得出，drfE基因的缺失會引起耐輻射異常球菌體內(nèi)CAT、SOD等抗氧化酶活性的下降，從而影響耐輻射異常球菌清除ROS的能力，表明drfE基因能夠通過影響耐輻射異常球菌體內(nèi)抗氧化酶的活性，參與細胞體內(nèi)的抗氧化反應。

圖5 H2O2處理對野生型WT、突變株ΔdrfE和回補菌株pdrfE∷Δ菌株體內(nèi)抗氧化酶活性的影響

3 討論

生物體遭受非生物脅迫會產(chǎn)生大量的活性氧自由基，從而導致細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物和DNA等嚴重損傷。細胞內(nèi)CAT、SOD、POD等多種抗氧化酶在清除氧自由基系統(tǒng)中發(fā)揮主要作用，其中SOD是一種非常重要的抗氧化酶，能夠催化O2·-轉(zhuǎn)化為H2O2和O2［24，28］，CAT和POD能夠?qū)2O2轉(zhuǎn)化為H2O，降低H2O2對細胞膜組分造成的氧化損傷［22］。氧化和高鹽脅迫條件下，drfE的突變導致耐輻射異常球菌生存能力顯著下降，可能是由于細胞內(nèi)CAT、SOD、POD活性發(fā)生改變，造成細胞抗氧化系統(tǒng)紊亂所造成。據(jù)文獻報道，不同的生物體對氧化脅迫的敏感性有很大的差異，抗氧化酶活性高的生物體，其抗氧化能力也能夠維持在較高的水平［29-32］。

鐵是生物體生長發(fā)育過程中所必需的礦質(zhì)元素，但高濃度的Fe對生物體產(chǎn)生毒害作用，影響生物體的生長［7-10］。細胞內(nèi)過量的Fe2+能與H2O2反應形成羥自由基（OH·），羥自由基是具有超強氧化能力的ROS，會對細胞造成氧化脅迫［1］。此外，生物體內(nèi)Fe2+的含量過高可能會使細胞內(nèi)CAT、SOD和POD等抗氧化酶類的活性受到不同程度的抑制。據(jù)報道，鐵蛋白能催化Fe2+生成Fe3+并以水合氧化鐵礦物質(zhì)的形式儲存鐵，同時能夠降低H2O2脅迫和過量Fe2+所產(chǎn)生的危害［16，17］。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)DrfE屬于鐵蛋白2超家族（Ferritin _2 superfamily），是一類鐵蛋白。本研究結(jié)果表明，drfE的缺失造成耐輻射異常球菌體內(nèi)鐵離子含量的升高，并導致脅迫條件下細胞內(nèi)CAT和SOD等抗氧化酶類活性的顯著下降，致使耐輻射異常球菌抗氧化能力的下降。由此推斷DrfE蛋白能夠阻止Fenton反應產(chǎn)生具有超強活性的OH·，并且可能保護抗氧化酶使其保持較高的活性，從而保護細胞免受過量H2O2和體內(nèi)鐵代謝所引起的氧化損傷。drfE缺失會導致細胞內(nèi)CAT、SOD活性顯著下降，而對POD活性并無顯著的影響?？赡苁怯捎赟OD與O2·-反應所產(chǎn)生的H2O2主要被CAT利用，因此CAT和SOD這兩種酶被大量消耗，故這兩種酶活性下降，而POD較少參與到H2O2的清除反應中，故其POD變化不明顯［33］。

本研究初步證實，耐輻射異常球菌中鐵蛋白DrfE在調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Fe2+含量，增強CAT和SOD等抗氧化酶活性途徑中發(fā)揮重要作用，從而保護細胞免受非生物脅迫產(chǎn)生的ROS的損傷，對Fe2+與抗氧化酶類之間的關系仍需深入研究。同時，耐輻射異常球菌所特有的類胡蘿卜素是其有效的非酶類抗氧化劑，因此，DrfE蛋白可能參與類胡蘿卜素合成途徑，其作用機制有待于進一步研究。

4 結(jié)論

耐輻射異常球菌drfE基因的缺失導致體內(nèi)Fe2+濃度增加，同時導致過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶活性的顯著下降，從而使耐輻射異常球菌清除ROS的能力下降，使耐輻射異常球菌對過氧化氫和鹽脅迫敏感。因此，DrfE蛋白增強了耐輻射異常球菌對非生物脅迫的抵抗能力。

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（責任編輯 馬鑫）

Effect of Ferritin DrfE on Antioxidant Enzyme Activity in Deinococcus radiodurans

WU Xiao-li1，2LIU Ying-ying2JIANG Shi-jie2，3CHEN Yun2LIU Xiao-li1，2WANG Yu-zhou4PING Shuzhen2WANG Jin1，2
（1. College of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621000；2. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081；3. College of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610065；4. The High School Affiliated to Renmin University of China，Beijing 100080）

To investigate the function of the ferritin DrfE encoded by gene drfE in Deinococcus radiodurans，we constructed the complemented strain pdrfE∷Δ，and compared the stress resistances of the wild-type WT，mutant ΔdrfE and complemented strain pdrfE∷Δ under different doses of hydrogen peroxide（H2O2）and NaCl. Also，the Fe2+concentration and antioxidant enzyme activities of three strains were measured under oxidative stress. The results showed that the deletion of gene drfE led the strain to be more sensitive to oxidative and highsalt stresses and the complementation of gene drfE restored the resistance of the strain to oxidative and salt stress. Furthermore，the deletion of drfE resulted in the Fe2+concentration in D. radiodurans cell increased from 232 μmol/L to 293 μmol/L in vivo. After treated with 80 mmol/L H2O2for 30 min，the CAT and SOD activities of the mutant ΔdrfE decreased by 32.74% and 41.3%，respectively，than that of wild-type. The above findings implied that the ferritin DrfE might be involved in iron metabolic pathway of D. radiodurans and played a key role in antioxidant system.

Deinococcus radiodurans；ferritin DrfE；abiotic stress；antioxidant enzyme；iron ion

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.024

2016-11-07

國家重點基礎研究發(fā)展計劃（“973計劃”）（2013CB733903）

吳小麗，女，碩士研究生，研究方向：特殊環(huán)境微生物功能基因資源利用；E-mail：wuxiaoli513@126.com

王勁，女，博士，研究員，研究方向：微生物分子遺傳學；E-mail：wjdsz@vip.sina.com