楊 雪，李云亮，王禹程，黃姍芬，馬海樂

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

酶解法制備菜籽多肽的工藝研究

楊 雪，李云亮，王禹程，黃姍芬，馬海樂*

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

本文以菜籽粕為原料，酸處理將菜籽粕脫毒后，采用堿溶酸沉法提純菜籽蛋白，再用堿性蛋白酶酶解菜籽蛋白制備菜籽多肽，采用單因素逐級優(yōu)化試驗設(shè)計，以酶解液中菜籽多肽的含量為指標(biāo)優(yōu)化酶解工藝參數(shù)。結(jié)果表明：酸處理后的硫甙含量下降了84.32%，堿溶酸沉后，蛋白的提取率為76.25%。單因素逐級優(yōu)化試驗的結(jié)果表明：堿性蛋白酶酶解的最適條件為底物濃度4%、加酶量7%（E/S）、溫度50℃、pH 8.5、酶解時間120 min，該條件下多肽含量為（35.4±0.11）mg/mL。

菜籽蛋白；脫毒；多肽；堿性蛋白酶

菜籽粕是菜籽榨油后的副產(chǎn)物，其菜籽蛋白含量約為30%，營養(yǎng)價值與大豆蛋白接近（Fleddermanna等，2013），具有很高的開發(fā)利用價值（付敏等，2013），但是由于菜籽粕中含有一些有毒物質(zhì)，主要為硫甙及其代謝衍生物，只能在飼料中少量添加，因此對菜籽蛋白的合理加工是充分利用其優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的有效途徑。

菜籽粕中的毒性物質(zhì)可通過一定的方法脫除，脫毒后的菜籽蛋白可大量用于飼料或者食品中。常見的脫毒方法包括物理、化學(xué)和生物脫毒法，其中化學(xué)脫毒方法脫毒較徹底。研究表明，采用硫酸溶液脫毒后菜籽粕中硫甙衍生物的脫除率均高于90%，且不影響蛋白質(zhì)和氨基酸的種類（蘭文菊等，2012）。采用酸浸溶法脫毒后的菜籽粕，再經(jīng)過堿溶酸沉方法提取后可獲得優(yōu)質(zhì)的脫毒菜籽蛋白。制備具有多種生物學(xué)活性的多肽是有效利用脫毒菜籽蛋白的途徑之一。

多肽具有多種生物學(xué)活性，研究發(fā)現(xiàn)，菜籽多肽具有降血壓（M?kinen等，2016）、抗氧化（秦曉佩等，2016；張晶等，2016）、抗凝血 （王子偉，2012）、抗腫瘤和增強免疫力（薛照輝等，2007）等功能。制備菜籽多肽的方法主要包括酶解法和發(fā)酵法，發(fā)酵法的耗時較長，因此，本文對酶解法制備菜籽多肽的工藝進(jìn)行了研究，為菜籽多肽作為保健食品開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 菜籽粕，江蘇天琦生物科技有限公司，蛋白質(zhì)含量為31.2%；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器及設(shè)備 TLL-C臺式冷凍離心機，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院試驗儀器廠；PHS-3C精密pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；CARY100紫外掃描分光光度計，美國瓦里安公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菜籽粕的脫毒及蛋白質(zhì)提取 菜籽蛋白的脫毒參考蘭文菊等（2012）的方法略有修改。準(zhǔn)確稱取菜籽粕100 g，加入濃度為4%的硫酸2 L，于60℃下攪拌、浸提90 min，結(jié)束后過濾，濾渣凍干后取部分樣品測定硫甙含量，并與未處理前的菜籽粕進(jìn)行對比，其余部分用于蛋白質(zhì)提取。

蛋白質(zhì)的提取采用堿溶酸沉方法 （高瑀瓏，2014），稱取25 g上述凍干樣品，加入0.2%氫氧化鈉溶液400 mL，堿提60 min后，于5000 r/min條件下離心10 min，收集上清液，用3 mol/LHCl調(diào)節(jié)pH為4，沉淀60 min后，于5000 r/min條件下離心10 min，水洗2次，收集沉淀。將沉淀冷凍干燥后，研磨過篩，即得到提純后的菜籽蛋白，4℃冷藏待用。

1.3.2 脫毒率及蛋白質(zhì)提取率 硫甙含量的測定采用氯化鈀法（魏曉飛等，2009），蛋白質(zhì)含量的測定采用凱氏定氮法。脫毒率及蛋白質(zhì)提取率的計算公式如下：

1.3.3 酶解工藝參數(shù)的確定 采用單因素逐級優(yōu)化試驗設(shè)計，以酶解液中多肽的含量為指標(biāo)篩選工藝參數(shù)。具體操作步驟如下：稱取12 g菜籽蛋白，加入蒸餾水配成相應(yīng)底物濃度的溶液，調(diào)節(jié)pH，控制溫度，加入堿性蛋白酶酶解，酶解過程中不斷加入1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH恒定，酶解結(jié)束后于沸水浴下滅酶10 min，5000 r/min離心10 min，收集上清液，測定上清液中多肽的含量。酶解各因素和水平的設(shè)定見表1。

表1 酶解各因素水平

1.3.4 菜籽多肽的含量測定 菜籽多肽的含量測定采用雙縮脲法（杜冬梅，2012）。取5 mL酶解液加入5 mL 10%三氯乙酸水溶液，混合均勻后靜置10 min，5000 r/min離心10 min，取1 mL上述溶液加蒸餾水稀釋10倍，取稀釋后的溶液6 mL，加入雙縮脲試劑4 mL，混合后靜置10 min，于540 nm波長下測定其OD值。同時以酪蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品中多肽的質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 16.0軟件單因素方差分析各因素、水平之間的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜籽粕的脫毒率及蛋白質(zhì)提取率 以處理前后硫甙的含量來衡量菜籽粕的脫毒率，以菜籽粕提取前和提取后蛋白質(zhì)量的比值作為蛋白質(zhì)的提取率，具體數(shù)據(jù)見表2、3。

表2 菜籽粕脫毒率

表3 菜籽蛋白提取率

2.2 酶解參數(shù)對酶解產(chǎn)物中多肽含量的影響

2.2.1 底物濃度對酶解產(chǎn)物中多肽含量的影響由圖1可知，酶解產(chǎn)物中多肽的含量隨底物濃度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在底物濃度為3%時多肽的含量最高，3%和4%的底物濃度酶解產(chǎn)物中的多肽含量無顯著差異（P＞0.05），原因可能是因為底物濃度為2%時，因加水量過多，導(dǎo)致酶和底物碰撞的幾率降低，當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥?%時酶與底物的碰撞幾率達(dá)到最大值，當(dāng)?shù)孜餄舛仍俅卧龃髸r，因濃度過高，產(chǎn)生了產(chǎn)物抑制，因此會出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。

4%底物濃度可大量減少酶解過程中水的用量，且與3%底物濃度的結(jié)果之間無顯著差異，因此選用底物濃度為4%做后續(xù)的單因素試驗。

圖1 底物濃度對酶解產(chǎn)物中多肽含量的影響

2.2.2 加酶量對酶解產(chǎn)物中多肽含量的影響 由圖2可知，酶解產(chǎn)物中多肽的含量隨加酶量的升高呈現(xiàn)升高的趨勢，在加酶量為7%（E/S）時，酶解液中多肽的含量趨于平緩，且7%與8%加酶量的酶解產(chǎn)物中多肽含量無顯著差異（P＞0.05），說明當(dāng)加酶量為7%時，酶相對于底物來說處于過量狀態(tài)，因此，為了降低成本選用加酶量為7%（E/S）。

圖2 加酶量對酶解產(chǎn)物中多肽含量的影響

2.2.3 溫度對酶解產(chǎn)物中多肽含量的影響 由圖3可知，多肽含量在酶解溫度50℃時最高，且與55℃的結(jié)果之間無顯著差異（P＞0.05），因此，選擇酶解溫度為50℃進(jìn)行后續(xù)單因素試驗。

圖3 溫度對酶解產(chǎn)物中多肽含量的影響

2.2.4 pH對酶解產(chǎn)物中多肽含量的影響 由圖4可知，pH對酶解特性的影響與溫度類似。呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在pH 8.5時，其酶解產(chǎn)物中多肽含量最高，因此，選用pH 8.5做后續(xù)試驗。

圖4 pH對酶解產(chǎn)物中多肽含量的影響

2.2.5 酶解時間對酶解產(chǎn)物中多肽含量的影響由圖5可知，酶解液中的多肽含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并且在120 min時達(dá)到最大值。原因是酶解時間過長，導(dǎo)致蛋白質(zhì)過度降解，生成大量的氨基酸，使酶解物中多肽的含量降低。因此設(shè)定酶解時間為120 min。

圖5 酶解時間對酶解產(chǎn)物中多肽含量的影響

3 結(jié)論與討論

本文對菜籽粕的脫毒、菜籽蛋白質(zhì)的提取以及菜籽多肽的制備工藝進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：（1）采用酸處理脫毒，硫甙的脫毒率為84.32%；（2）堿溶酸沉法提取的菜籽蛋白質(zhì)，其提取率為76.25%；（3）制備菜籽多肽的最佳酶解工藝為：底物濃度4%、加酶量7%（E/S）、溫度50℃、pH 8.5、酶解時間120 min，在此條件下酶解后上清液中的多肽含量為（35.4±0.11）mg/mL。

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In this paper，rapeseed meal as raw material was treated by acid to detoxification.Detoxified rapeseed meal was dissolved by alkaliand participated by acid to prepare rapeseed protein，which was en扎ymoly扎ed by alkaline protease for preparation peptides.Single-factor stepwise optimi扎ation experimental design was used，content as an index to optimi扎e en扎ymatic process parameters.The results showed that glucosinolate content after acid treatment decreased by 84.32%，after the alkali-extration and acid-precipitation，protein extraction rate was 76.25%.Single factor optimi扎ation test results showed that：the optimal conditions for alcalase were substrate concentration of 4%，en扎yme dosage of 7%（E/S），temperature of 50℃，pH 8.5，hydrolysis time 120 min，peptide content reached（35.4±0.11）%under this condition.

rapeseed protein；detoxification；peptide；alcalase

S816.7

A

1004-3314（2017）02-0019-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170205

國家863計劃“高生物利用度蛋白制備關(guān)鍵技術(shù)研究與開發(fā)”（2013AA102203）；江蘇大學(xué)高級人才科研啟動基金（16JDG049）

*通訊作者