李 燕王新征王俊宏孫 婷康珈寧

（1.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700；2.北京市朝陽區(qū)常營社區(qū)衛(wèi)生服務中心，北京100024；3.河南省南陽市中醫(yī)院，河南 南陽 473003）

·研究報告·

熄風靜寧顆粒對Tourette綜合征模型大鼠腦紋狀體多巴胺D2受體和多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白mRNA表達的影響*

李 燕1王新征2王俊宏1孫 婷1康珈寧3

（1.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700；2.北京市朝陽區(qū)常營社區(qū)衛(wèi)生服務中心，北京100024；3.河南省南陽市中醫(yī)院，河南 南陽 473003）

目的 觀察熄風靜寧顆粒對Tourette綜合征（TS）模型大鼠腦紋狀體多巴胺D2受體（DRD2）和多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白（DAT）mRNA表達的影響。方法 Wistar雄性大鼠36只隨機分為空白對照組、模型組、氟哌啶醇組、熄風靜寧顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組，采用亞氨基二丙腈（IDPN）腹腔注射建立TS大鼠模型，造模后連續(xù)給藥6周，采用RT–PCR法檢測大鼠腦紋狀體中DRD2和DAT mRNA表達的情況。結(jié)果 IDPN誘導的模型大鼠的體質(zhì)量顯著低于正常大鼠（P＜0.01）；給藥前后熄風靜寧顆粒中劑量組TS模型大鼠體質(zhì)量增長與正常大鼠體質(zhì)量的增長無差異；TS模型大鼠腦紋狀體DRD2 mRNA與正常組比較呈現(xiàn)高表達（P＜0.01）；熄風靜寧顆粒中、高劑量組和氟哌啶醇可降低TS模型大鼠腦紋狀體DRD2 mRNA的表達（P＜0.05）；TS模型大鼠腦紋狀體DAT mRNA表達與正常組比較顯著增高（P＜0.01）；中藥顆粒高劑量組能夠降低TS模型大鼠腦紋狀體DAT mRNA的表達，但氟哌啶醇作用更明顯（P＜0.05）。結(jié)論 熄風靜寧顆粒尚具有部分調(diào)節(jié)機體狀態(tài)的作用；Tourette綜合征存在多巴胺功能的亢進，熄風靜寧顆粒能夠通過降DRD2受體的敏感性，抑制多巴系統(tǒng)系統(tǒng)功能的亢進而發(fā)揮藥物治療的作用。

熄風靜寧顆粒 Tourette綜合征 多巴胺D2受體 多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白

Tourette綜合征（TS）又稱多發(fā)性抽動癥，或抽動-穢語綜合征，是一種兒童時期起病，以頭面部、肢體或軀干的多發(fā)性肌肉抽動和（或）發(fā)聲性抽動為特征的精神障礙性疾病。目前TS研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)病機制與多巴胺D2受體（DRD2）密切相關(guān)［1-3］。TS患者存在DA釋放和攝取調(diào)節(jié)的異常［4-5］，而多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白（DAT）是起調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵因素。臨床上熄風靜寧顆粒治療TS具有療效顯著、副作用少的優(yōu)勢。探討熄風靜寧顆粒對TS模型大鼠腦紋狀體DRD2和DAT mRNA的影響，明確其作用機制，對以后的臨床應用具有重要的指導意義?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠36只，清潔級，雄性，4周齡，體質(zhì)量80～100 g。購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2007-0001。分籠喂養(yǎng)，自由攝食飲水，溫度（22±2）℃，濕度50%～70%，通風。

1.2 試藥與儀器 氟哌定喘片，2 mg/片，寧波大紅鷹藥業(yè)股份有限公司，批準文號：國藥準字H33020585，生產(chǎn)批號：131003。熄風靜寧中藥配方顆粒（辛夷花10 g，蒼耳子3 g，元參10 g，板藍根10 g，木瓜10 g，清半夏10 g，伸筋草20 g，鉤藤15 g，菊花15 g，白芍15 g，全蝎3 g，珍珠母30 g，酸棗仁30 g，炙甘草10 g），由北京康仁堂藥業(yè)有限公司制備。亞氨基二丙腈（IDPN）購自美國Sigma公司；超純RNA提取試劑盒，批號CW0581；HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒，批號CW0744；SYBR Green PCR Mixtur，批號 CW0957；Dnase 1，批號CW2090，以上均購自北京康為世紀生物有限公司。熒光定量PCR儀，ABI7500；高速冷凍離心機，Hettich德國；電泳儀，北京六一儀器廠；電泳槽，北京六一儀器廠；凝膠成像儀，Tanon-6600天能公司；分光光度計，UV-2000上海尤尼柯公司；移液器（不同量程），Eppendorf。

1.3 分組與造模 大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字法分為空白對照組、模型組、氟哌啶醇組、熄風靜寧顆粒低、中、高劑量組，每組6只。除空白對照組外，其余5組小鼠腹腔注射IDPN，150 mg/kg，空白對照組腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液，每日1次，連續(xù)7 d。注射IDPN及干預治療15 min后開始觀察大鼠行為活動，包括：嗅、咬、舔（不包含理毛）、迅速移位、挖洞、急速跳躍等。由熟練掌握大鼠刻板行為并能準確評分但不熟悉組別的實驗人員每天觀察動物行為并評分。評分≥1分可判定造模成功。評分標準參考Napier and Istre報道［6］。

1.4 干預措施 造模7 d后，正常對照組與模型組灌胃蒸餾水10 mL/kg，熄風靜寧顆粒顆粒低、中、高劑量組分別按1.2、2.4、4.8 g/kg體質(zhì)量給予熄風靜寧顆?；鞈乙?，氟哌啶醇組按0.5 mg/kg體質(zhì)量給予氟哌啶醇混懸液，每天1次，各組均連續(xù)灌胃6周。

1.5 標本采集與檢測 1）體質(zhì)量測定。于實驗開始第1天，及以后每7天為1個周期，測定大鼠的體質(zhì)量并記錄。2）標本采集。處死前1天禁食，不禁水。末次給藥60 min后，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，快速斷頭取腦，冰上剝離紋狀體，液氮速凍后迅速轉(zhuǎn)移至于-80℃冰箱凍存 （參照Paxinos和Watson鼠腦立體定位圖譜及李耀宇成年大鼠紋狀體三維結(jié)構(gòu)定位紋狀體）［7-8］。3）樣本檢測。引物設(shè)計：按NCBI primerblast和primer5.0進行設(shè)計。目的基因RT-PCR檢測引物，引物序列見表1?？俁NA提取：用超純RNA提取試劑盒提取腦組織樣本中總RNA，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行，并進行濃度測定，總RNA-80℃保存，防止降解。反轉(zhuǎn)錄：每樣本抽取2 μg的總RNA，用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行，合成的cDNA于-80℃冰箱保存。使用SYBR Green PCR Mixtur試劑盒，應用ABI7500型實時檢測擴增儀，通過兩步法PCR反應程序?qū)崿F(xiàn)對mRNA的定量表達。反應條件為：95℃預變性10 min，59℃復性和延伸60 s，95℃變性10 s，共45個循環(huán)。確認溶解曲線和擴增曲線，記錄每個基因的Ct值。運用2-△△ct方法進行相對定量分析，ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct管家基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct管家基因）對照組。實驗至少重復3次。

表1 實時熒光定量PCR檢測中DAT、DRD2引物序列

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS18.0軟件包，計量資料以（）表示，正態(tài)分布。組間比較，采用單因素方差分析，方差齊，LSD檢驗；方差不齊，Games-Howell檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠不同時期的體質(zhì)量比較 見表2。造模后初期與后期，各組TS模型大鼠體質(zhì)量與正常大鼠體質(zhì)量存在顯著差異（P＜0.01），隨著時間的推移這種現(xiàn)象不變。熄風靜寧顆粒中劑量組大鼠體質(zhì)量的增長與正常組體質(zhì)量的增長差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠不同時期的體質(zhì)量及增長值比較（g，）

表2 各組大鼠不同時期的體質(zhì)量及增長值比較（g，）

與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組別 n正常組 6模型組 6氟哌啶醇組 6初始 造模后 給藥6周后 體質(zhì)量增長值113.00±9.63 175.33±13.11 394.00±42.09 218.67±31.23 118.00±6.57 137.00±9.96**324.33±24.37**187.33±26.39*124.17±5.85 129.83±8.70**312.50±22.65**182.67±20.10*熄風靜寧顆粒低劑量組 6 120.33±2.88 131.00±14.94**320.00±30.36**189.00±16.16*熄風靜寧顆粒中劑量組 6 125.17±3.76 133.33±8.55**327.83±33.21**194.50±26.88熄風靜寧顆粒高劑量組 6 117.00±6.66 117.17±8.09**303.17±19.04**186.00±20.22*

2.2 各組大鼠腦紋狀體DRD2 mRNA表達比較 見表3。模型組大鼠腦紋狀體DRD2 mRNA較正常組表達顯著增加（P＜0.01）；熄風靜寧顆粒中、高劑量，和氟哌啶醇可降低DRD2 mRNA的表達，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。

表3 各組大鼠腦紋狀體DRD2 mRNA表達水平比較（）

表3 各組大鼠腦紋狀體DRD2 mRNA表達水平比較（）

與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。與氟哌啶醇組比較，▲P＜0.05。

組別 n正常組 6模型組 6氟哌啶醇組 6 DRD2 mRNA DAT mRNA 0.93±0.05 0.83±0.11 1.28±0.11**2.30±0.33**1.08±0.08△1.25±0.12**△△熄風靜寧顆粒低劑量組 6 1.25±0.17*2.50±0.69**熄風靜寧顆粒中劑量組 6 1.08±0.10△1.79±0.25**熄風靜寧顆粒高劑量組 6 1.07±0.26△1.67±0.18**△▲

2.3 各組大鼠腦紋狀體DAT mRNA表達的影響 見表3。造模后各組TS模型大鼠DAT mRNA表達均較正常組增高（均P＜0.01）。熄風靜寧顆粒高劑量組能夠降低TS模型大鼠腦紋狀體DAT mRNA的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但氟哌啶醇作用更明顯（P＜0.01），兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討 論

TS是兒童期常見的一種神經(jīng)精神障礙性疾病，男女發(fā)病比例為5∶1，國外學者報道［9］患病率為0.05%～3.0%不等。近年來，研究顯示TS有增多的趨勢，長時間的抽動發(fā)作可給患兒帶來嚴重的壓力及疲勞感，影響患兒的學習及生活，且部分患兒的病情可延續(xù)至成年，甚者還有部分患者抽動癥狀可以持續(xù)一生，嚴重影響患者就業(yè)、生存等社會行為。TS發(fā)病機制研究普遍認為與多巴胺系統(tǒng)的過度活躍有關(guān)，但是其確切的機制尚不清楚。

熄風靜寧顆粒是我國著名中醫(yī)兒科專家劉弼臣教授治療TS的經(jīng)驗方，主要由辛夷花、蒼耳子、玄參、板藍根、木瓜、法半夏、伸筋草、天麻、鉤藤、白芍、蟬蛻、僵蠶、全蝎等藥物組成。前期研究證實其具有改善TS模型大鼠刻板行為活動及調(diào)節(jié)腦紋狀體多巴胺DA含量的作用。本實驗在對大鼠體質(zhì)量觀察中發(fā)現(xiàn)，IDPN作為神經(jīng)毒素，可以影響大鼠體質(zhì)量的增長。但是熄風靜寧顆粒（中劑量）在發(fā)揮治療作用的同時，可以對抗這種毒副作用。這與前期研究，熄風靜寧顆粒具有免疫調(diào)節(jié)的藥效學具有一致性［10］，推測熄風靜寧顆粒尚具有部分調(diào)節(jié)機體的狀態(tài)的作用，有利于疾病的治療。這需要以后更深入的研究證實。

TS患者紋狀體內(nèi)多巴胺神經(jīng)過度支配或突觸后DRD2超敏感是目前公認的TS發(fā)病的神經(jīng)生物化學因素。DA分別與紋狀體內(nèi)神經(jīng)元上的DRD1和DRD2結(jié)合，最終使大腦皮質(zhì)運動區(qū)興奮或去抑制，而產(chǎn)生運動［11］。目前多項研究證實TS患者腦內(nèi)DRD2受體的表達較正常人增高，如Yoon等［12］通過研究發(fā)現(xiàn)TS患兒額部大腦皮層DRD2密度分布較正常兒童增高，Minzer等［13］也發(fā)現(xiàn)TS患者的前額皮質(zhì)DRD2的分布密度增加是正常對照組的1.4倍。本實驗結(jié)果顯示，IDPN誘導TS模型大鼠腦紋狀體DRD2 mRNA表達較正常組顯著增加，與上述研究結(jié)論一致，提示TS模型大鼠腦內(nèi)存在DRD2數(shù)目上調(diào)，呈現(xiàn)DRD2超敏感狀態(tài)，與目前認為的TS病理生理改變一致。IDPN是一種中樞神經(jīng)毒素，抽動的造模機制主要是通過破壞了錐體外系的DA系統(tǒng)，產(chǎn)生持久的降低DA濃度的效應，使動物在生長發(fā)育過程中出現(xiàn)DA受體超敏現(xiàn)象，導致動物出現(xiàn)刻板行為［14］，這一誘導機制在本實驗中得到驗證。氟哌啶醇是一種DRD2拮抗劑，是治療TS的代表性藥物，通過作用于DRD2受體，使DA不能與DRD2結(jié)合，從而降低DA神經(jīng)元的活性而抑制大腦皮質(zhì)運動區(qū)的興奮性，緩解抽動癥狀。本實驗中氟哌啶醇和熄風靜寧顆粒中、高劑量可降低TS模型大鼠腦紋狀體DRD2 mRNA的表達，證明了熄風靜寧顆粒具有類似氟哌啶醇DRD2拮抗劑的作用，通過降低DRD2受體的敏感性，進而調(diào)節(jié)多巴胺系統(tǒng)的功能，達到臨床治療的目的。

DAT是多巴胺神經(jīng)元末梢突觸前膜的膜蛋白，其功能是多巴胺神經(jīng)元發(fā)放神經(jīng)沖動后，再攝取突觸間隙的DA，終止細胞間的信息傳導。DA總量的80%經(jīng)DAT轉(zhuǎn)運進入細胞內(nèi)，然后再釋放利用。DAT專一定位于多巴胺合成神經(jīng)元，被認為是多巴胺能神經(jīng)元的獨特標志，DAT的變化可以在一定程度上反映多巴胺系統(tǒng)的功能。Yoon［11］、Minzer［13］發(fā)現(xiàn)TS患者腦內(nèi)DRD2增高的同時，也存在DAT的增高。本研究發(fā)現(xiàn)造模后TS模型大鼠腦紋狀體DAT mRNA表達顯著增加，與上述研究結(jié)果一致，推測DAT表達增加的原因可能與TS患者體內(nèi)存在多巴胺系統(tǒng)功能的亢進，引起突觸前膜多巴胺轉(zhuǎn)運體代償性升高有關(guān)。這一結(jié)果，支持TS多巴胺系統(tǒng)功能亢進的發(fā)病理論。目前有研究發(fā)現(xiàn)氟哌啶醇能抑制紋狀體DAT基因表達［15-16］，在本實驗中也得到證實，氟哌啶醇和高劑量熄風靜寧顆粒降低了DAT mRNA的表達，而且氟哌啶醇作用更顯著。這種降低趨勢說明了兩者在一定程度上抑制了TS多巴胺系統(tǒng)功能的亢進，支持臨床療效的顯著性。

綜上所述，熄風靜寧顆粒能夠通過降DRD2受體的敏感性，進而抑制多巴胺系統(tǒng)功能的亢進，發(fā)揮藥物的治療作用，為以后更廣泛的臨床應用和開發(fā)研究提供了依據(jù)。而且熄風靜寧顆粒還尚具有部分調(diào)節(jié)機體狀態(tài)的作用，這有待以后更進一步的研究證實。

［1］ Herzberg I，Valencia-Duarte AV，Kay VA，et al.Association ofDRD2 variants and Gilles de la Tourette syndrome in a familybasedsample from a South American population isolate［J］. Psychiatr Genet，2010，20（4）：179-183.

［2］ Taylor JL，Rajbhandari AK，Berridge KC，et al.Dopaminereceptor mo-dulation of repetitive grooming actions in the rat.Potential relevance for Tourette syndrome［J］.Brain Res，2010，31（1322）：92-101.

［3］ Nikolaus S，Antke C，Muller HW.In vivo imaging of synapticfuntion in the central nervous system：II.Mental and afectivedisorders［J］.Behav Brain Res，2009，204（1）：32-66.

［4］ Liu H，Dang F，Meng Z，et al.Evaluation of Tourette’s syndromeby（99m）Tc-TRODAT-ISPECT/CT imaging［J］.Ann Nucl Med，2010，24（7）：515-521.

［5］ Li JJ，Li ZW，Li AY，et al.A bnormal expression of dopamineand sero-tonin transporters associated with the pathophysiologicmechanism of Tourette syndrome［J］.Neurol India，2010，58（4）：523-529.

［6］ Napier TC，Istre ED．Methamphetamine-Induced sensitization includes a functional upregulation of ventral pallidal 5-HT2A/ 2C receptors［J］．Synapse，2008，62：14-21．

［7］ Paxinos G，Watson C.The rat brain in stereotaxic coordinates［M］.London：Academic Press，1996：1104.

［8］ 李耀宇，舒斯云，包新民，等.成年大鼠紋狀體、邊緣區(qū)和蒼白球的計算機三維結(jié)構(gòu)重建［J］.中國組織化學與細胞化學雜志，2000，9（4）：361-364.

［9］ Church AJ，Dale RC，Lees AJ，et al.Tourette’s syndrome：across sectional study to examine the PANDAS hypothesis［J］. J Neurol Neurosurg Psychiatry，2003，74（5）：602-607.

［10］李燕，徐榮謙，王俊宏，等.熄風靜寧湯對小鼠免疫功能的影響［J］．中國實驗方劑學雜志，2011，17（7）：198-201．

［11］Singer HS，Minzer K.NeurobiologyofTourette'ssyndrome：concepts of neuroanatomic loealization and neuroehemieal abnormalities［J］.Brain Dev，2003，25（S）：70-84.

［12］Yoon DY，Gause CD，Leckman JF，et al.Frontal dopaminergicabnormality in tourette syndrome：a postmortem analysis［J］. JNeurol Sci，2007，255（1-2）：50-56.

［13］Minzer K，Lee O，Hong JJ，et al.Increased prefrontal D2 proteinin Tourette syndrome：a postmortem analysis of frontal cortexand striatum［J］.J Neurol Sci，2004，219（1-2）：55-61.

［14］Diamond BI，Reyes MG，Borision R．A new animal model for Tourctte syndrome［J］．Adv Neural，1982，35：221-225．

［15］Roselei F，Jardel GV，Caroline W，et al.Valerianaofficinalisdoesnotaltertheorofacialdyskinesiaindueedbyhaloperidol in rats：Role of dopamine transporter［J］.Neuro-PsychoPhannacology&Bio Psychiatry，2007，31：1478-1486.

［16］Saldana M，Bonastre M，Aguilar E，et al.Differential nigral expression of Bcl-2 protein family in chronically haloperidol and clozapine-treated rats：Role in neurotoxicity and stereotyped behavior［J］.Exp Neurol，2007，203：302-308.

Effects of Xifeng Jingning Granule on Dopamine Receptor D2 and Dopamine Transporter mRNA Expression in Striatum of Tourette Syndrome Rat

LI Yan，WANG Xinzheng，WANG Junhong，et al.
Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China.

Objective：To investigate the mRNA expression of dopamine receptor D2（DRD2）and dopamine transporter（DAT）in rat brain striatum of tourette syndrome model.Methods：Male Wistar rats（n＝36）were randomly divided into 6 groups：control group，model group，haloperidol group，low-dose of Xifeng Jingning granule group，middle-dose of Xifeng Jingning granule group and high-dose of Xifeng Jingning granule group.The tourette syndrome model was established in rats by intraperitoneal injection of iminodipropionitrile（IDPN）.After modeling the rats were given medicines for 6 weeks.The mRNA expression of dopamine receptor D2（DRD2）and dopamine transporter（DAT）in rat brain striatum of Tourette Syndrome model were investigated by using real-time quantitative polymerase chain reaction（RT-PCR）.Results：The weight of tourette syndrome rats by intraperitoneal injection of iminodipropionitrile was significantly lower than normal rats（P＜0.01）.There was no difference on rat weight gain between middle-dose of Xifeng Jingning granule group and control group（P＞0.05）.Compared with control group，dopamine receptor D2 mRNA in striatum of tourette syndrome rats showed higher expression（P＜0.01）.Middle-dose，high-dose of Xifeng Jingning granule group and haloperidol group could reduce the expression of dopamine receptor D2 mRNA in tourette syndrome rat striatum （P＜0.05）.Compared with control group，dopamine transporter mRNA in tourette syndrome rat striatum showed higher expression（P＜0.01）.Dopamine transporter mRNA expression in tourette syndrome rat striatum in high-dose of Xifeng Jingning granule group and haloperidol group could get reduced，but more obviously in haloperidol group（P＜0.01）.Conclusion：Xifeng Jingning granule has a partial role in regulating body state；Tourette syndrome may induce overactivity ofdopamine system.The therapeutic effect of Xifeng Jingning granule can be implemented regulating the sensitivity of postsynaptic dopamine receptors，and then reducing overactivity of dopamine system.

Xifeng Jingning granule；Tourette Syndrome；Dopamine receptor D2；Dopamine Transporter

R285.5

A

1004-745X（2017）01-0023-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.01.007

2016-10-10）

高等學校博士學科點專項科研基金項目（20120013120011）