王斌，張瓊姝，楊雪芳，張洋洋，郭海利，張小民

（1.山西大學生命科學學院，山西太原030006；2.山西金科海生物技術有限公司，山西太原030006）

沙棘葉科羅索酸濃縮物的毒理學研究

王斌1，張瓊姝1，楊雪芳1，張洋洋1，郭海利2，張小民1

（1.山西大學生命科學學院，山西太原030006；2.山西金科海生物技術有限公司，山西太原030006）

按照食品安全性毒理學評價程序和方法對沙棘葉科羅索酸濃縮物進行了小鼠急性經口毒性試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗。小鼠急性經口毒性試驗結果表明，沙棘葉濃縮物對雌雄小鼠經口最大耐受劑量（MTD）均大于15 g/kg，為無毒級物質；小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗結果表明，該檢品未呈現有致突變性。通過食品安全性毒理學評價，不僅可為沙棘葉濃縮物可食性提供理論依據，也會對整個沙棘葉的開發(fā)起到積極的推動作用。

中國沙棘；葉；提取物；毒理學

科羅索酸具有較高的藥用價值，比如降血糖[1]、抗氧化[2]、調血脂[3]、抗抑郁[4]以及抗心律失常[5]等。沙棘葉中含有科羅索酸，已有許多有關其的研究。吳哲等[6]采用HPLC法測定了沙棘葉中科羅索酸的含量；田曉東等[7]對沙棘葉科羅索酸的濃縮工藝進行了研究；張璐等[8]確定了沙棘葉濃縮物中科羅索酸的測定方法。沙棘在山西有著得天獨厚的資源優(yōu)勢，山西現有沙棘林面積為56萬hm2[9]。近年來，研究者還發(fā)現，沙棘葉中含有多種營養(yǎng)物質和生物活性物質，金婷等[10]證明，沙棘葉中蛋白質、氨基酸、維生素C、脂溶性維生素A、K、E等含量豐富，同時還含有多種不飽和脂肪酸、葡萄糖、果糖、半乳糖以及其他生物活性物質；趙麗萍等[11]研究發(fā)現，沙棘葉中含有豆甾醇、齊墩果酸、槲皮素、表兒茶素、對羥基苯甲酸丁酯等化合物；付陽等[12]通過高效液相-電噴霧質譜法測定了沙棘葉中槲皮素、楊梅素、蘆丁、異鼠李素、山奈酚的含量。

沙棘葉不僅含有較多的生物活性成分，而且這些成分中的黃酮類物質在治療心血管疾病方面有著突出作用。李淑珍等[13]建立了總黃酮含量的測定方法，并對沙棘葉總黃酮提取工藝進行了優(yōu)化[14]；安樂等[15]建立了沙棘葉總黃酮的最佳提取純化工藝。此外，沙棘中齊墩果酸是肝病的輔助治療藥物，對急慢性肝損傷有明顯的保護作用；蘆丁主要用于脆性增加的毛細血管出血癥，也用于高血壓、腦出血、視網膜出血、出血性紫癜、急性出血性腎炎、再發(fā)性鼻出血、創(chuàng)傷性肺出血、產后出血等的輔助治療；科羅索酸通過加快葡萄糖的轉運，促進細胞對葡萄糖的吸收和利用，從而實現其降血糖功效。由于科羅索酸對葡萄糖轉運的興奮作用類似于胰島素，因此，科羅索酸也被稱為植物胰島素。近年來的研究表明，沙棘葉有著較高的開發(fā)和利用價值。

本研究為推進沙棘葉科羅索酸濃縮物的利用和開發(fā)，按食品安全性毒理學評價程序和方法進行了小鼠急性經口毒性試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗以及小鼠精子畸形試驗，這不僅可為沙棘葉濃縮物的食用安全提供依據，也將會加快整個沙棘葉的開發(fā)進程。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 沙棘葉沙棘葉采自山西祁縣來遠鎮(zhèn)唐河底，為野生中國沙棘（Hippophae rhamnoides L.Subsp.Sinensis Rousi）。

1.1.2 試驗動物清潔級昆明種小鼠，購自北京維通利華試驗動物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 沙棘葉濃縮物的獲取將沙棘葉經60℃干燥箱干燥，粉碎，過0.25 mm篩，置于蒸餾水中，加熱至80℃，浸泡4 h，過濾并棄濾液，將沙棘葉于60℃烘干。烘干后的沙棘葉置于圓底燒瓶中，按料液比1∶10加入無水乙醇，90℃回流3 h，過濾后將濾液倒入旋轉蒸發(fā)瓶，減壓回收乙醇，制得浸膏，4℃保存。

1.2.2 小鼠毒理試驗

1.2.2.1 小鼠急性經口毒性試驗按GB15193.3—2003急性毒性試驗方法中最大耐受劑量法進行。選體質量為19～22 g的健康小鼠20只，雌雄各占1/2。小鼠禁食14 h，稱取受試物15 g，加蒸餾水至40 mL。2次經口灌胃給予受試物，每千克體質量灌胃量為20 mL，中間間隔6 h，合并劑量為15 g/kg。14 d后記錄中毒癥狀及死亡情況。

1.2.2.2 小鼠骨髓細胞微核試驗按GB15193.5— 2003骨髓細胞微核試驗進行。選用體質量為25～30 g的健康小鼠50只，按照體質量隨機分為5組，每組10只，雌雄各占1/2，處理劑量分別為2.5，5，10 g/kg，同時設置溶劑對照組（蒸餾水）和陽性對照組（環(huán)磷酰胺50 mg/kg）。各劑量溶液配制方法：稱取受試物2.5，5，10 g，分別加蒸餾水至20 mL，依次為低、中、高劑量組；取環(huán)磷酰胺儲備液（25 mg/mL）2 mL加蒸餾水至20 mL為陽性對照組，溶劑對照組為蒸餾水。各組均按20 mL/kg經口灌胃，受試物現用現配。各組均采用2次經口給受試物，中間間隔24 h，于第2次給受試物后6 h處死動物，取一側股骨制備骨髓涂片，Gimsa染色后鏡檢計數嗜多染紅細胞中的微核發(fā)生率。

1.2.2.3 小鼠精子畸形試驗按GB15193.7—2003小鼠精子畸形試驗進行。選體質量為26～35 g的雄性性成熟小鼠25只，按照體質量隨機分為5組，每組5只，設3個劑量組，即2.5，5，10 g/kg，同時設溶劑對照組（蒸餾水）和陽性對照組（環(huán)磷酰胺50 mg/kg）。各劑量溶液配制方法同1.2.2.2。各組均按20 mL/kg的體積經口灌胃，受試物現用現配。連續(xù)5 d經口給予受試物，一天一次，均于首次給受試物后的第35天處死動物，取兩側副睪，制備精子標本，高倍鏡下檢查每只動物的精子形態(tài)，計數結構完整精子1 000個。

2 結果與分析

2.1 急性毒性試驗

在14 d的觀察期內，動物未見明顯中毒癥狀；眼、鼻、口未見分泌物，無腫脹現象；糞便黑灰色，呈麥粒狀，外陰部光潔；被毛整潔光滑、乳白色，黏膜無充血、水腫，體質量增長正常，無一動物死亡。表明該受試物對雌雄小鼠經口最大耐受劑量（MTD）均大于15 g/kg（表1）。

表1 沙棘葉提取物對小鼠急性經口毒性試驗結果

2.2 小鼠骨髓細胞微核試驗

經單因素方差分析可知，各劑量組微核細胞率與溶劑對照組相比，差異均無顯著性（P＞0.05），且微核細胞率均在文獻報道的正常組的正常值范圍之內，而陽性對照組微核細胞率與溶劑對照組以及各劑量組之間進行比較，差異達極顯著（P＜0.01）（表2）。

2.3 小鼠精子畸形試驗

經單因素方差分析可知，各劑量精子畸形率與溶劑對照組相比，差異不顯著（P＞0.05），而陽性對照組精子畸形率與溶劑對照組及各劑量組相比，差異極顯著（P＜0.01）（表3）。

表2 沙棘葉提取物對小鼠骨髓細胞微核率的影響

表3 沙棘葉提取物對小鼠精子畸形率的影響

3 討論與討論

根據《食品安全性毒理學評價程序和方法》（GB 15193.1～15193.21—2003）的要求，對沙棘葉科羅索酸濃縮物進行了小鼠急性經口毒性試驗及2項致突變試驗。小鼠急性經口毒性試驗結果表明，在14 d的觀察期內，動物未見明顯中毒癥狀，被毛整潔光滑，黏膜無充血、水腫，體質量增長正常，無一動物死亡。表明該受試物對雌雄小鼠經口MTD均大于15 g/kg。按急性毒性劑量分級標準屬無毒級物質。

小鼠骨髓細胞微核試驗結果表明，各劑量組微核細胞率與溶劑對照組相比，差異均無顯著性（P＞0.05），而陽性對照組微核細胞率與溶劑對照組以及各劑量組相比，差異極顯著（P＜0.01），說明沙棘葉濃縮物未使小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率發(fā)生改變。

小鼠精子畸形試驗結果表明，各劑量精子畸形率與溶劑對照組相比，差異均不顯著（P＞0.05），而陽性對照組精子畸形率與溶劑對照組及各劑量組相比，差異極顯著（P＜0.01），說明沙棘葉濃縮物在所涉及劑量范圍內不會引起小鼠畸形率增高。

沙棘雖然是果葉兩用植物，但對沙棘葉的開發(fā)遠不如沙棘果，張小民等[16]按照食品安全性毒理學評價程序和方法對沙棘葉進行了急性毒性試驗和骨髓細胞微核試驗，初步證明了沙棘葉作為新的食物資源的安全性。劉緒川等[17]研究指出，用沙棘葉長期飼喂試驗動物無蓄積性毒害，不影響動物繁殖，對胚胎也無致畸作用，更無致癌或促發(fā)腫瘤作用，長期飼喂還能提高機體抗病力。劉艷豐等[18]研究了沙棘葉黃酮對綿羊瘤胃代謝和血清指標的影響，結果認為，在綿羊日糧中添加沙棘葉黃酮，可以提高綿羊蛋白質的合成，調節(jié)脂類代謝，增加細胞因子的含量，有益于免疫力的提高，建議在綿羊日糧中添加0.25%的沙棘葉黃酮。山西省沙棘資源豐富，面積大，分布廣，每年都有大量的枝葉產生，對沙棘葉的深入研究，將會加快沙棘葉的開發(fā)利用進程，為沙棘葉在醫(yī)藥領域的拓展起到推動作用。

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Toxicologic Study on Corosolic Acid Concentrations of Seabuckthorn Leaves

WANGBin1，ZHANGQiongshu1，YANGXuefang1，ZHANGYangyang1，GUOHaili2，ZHANGXiaomin1
（1.College ofLife Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；
2.Shanxi Jinkehai Biological TechnologyCo.，Ltd.，Taiyuan 030006，China）

The acute oral toxicity,micronucleus test of bone marrow and sperm shape abnormality test in mice was applid on corosolic acid concentrations of seabuckthorn leaves according to the evaluation processes and methods of food safety toxicology.The acute oral toxicity showed the maximum tolerated dosesea（MTD）of seabuckthorn leaves concentrations through the mouth of mice was greater than 15 g/kg,indicating the seabuckthorn leaves concentrations had no toxic.The micronucleus test and sperm shape abnormality test demonstrated that the examined sample didn't presented mutagennicity.On the basis ofthe evaluation processes and methods of food safety toxicology,this study not only provided theoretical basis for edibility of seabuckthorn leaves concentrations,but promoted the seabuckthorn leaves exploitation actively.

Chinese seabuckthorn;leaves;extractive;toxicology

S793.6

：A文獻標識碼：1002-2481（2017）02-0203-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.02.14

2016-11-17

王斌（1988-），男，山西晉中人，在讀碩士，研究方向：動物學。張小民為通信作者。