趙 佩 騰麗杰 王 軻 杜麗璞 任 賢 佘茂云 葉興國,*

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小麥TaVIP1家族基因克隆、分子特性及功能分析

趙 佩1,**騰麗杰2,**王 軻1杜麗璞1任 賢2佘茂云3,*葉興國1,*

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/ 國家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學(xué)工程, 北京100081;2北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院, 寧夏銀川750002;3安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所, 安徽合肥 230031

植物VIP1蛋白(VirE2 interacting protein 1)與農(nóng)桿菌侵染植物后T-DNA在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān), 影響植物轉(zhuǎn)化效率, 但還未見有關(guān)小麥中基因研究的報(bào)道。本研究利用技術(shù)從普通小麥中克隆了家族基因, 該家族基因全部由4個(gè)外顯子構(gòu)成, 編碼產(chǎn)物相似性高, 與擬南芥AtVIP1蛋白質(zhì)序列相似性僅為50.7%~51.4%。Southern雜交結(jié)果表明,基因在小麥基因組中存在3個(gè)拷貝。根據(jù)小麥3個(gè)基因的差異序列設(shè)計(jì)特異引物, 以四倍體小麥Langdon與中國春D組染色體代換系為材料進(jìn)行PCR檢測(cè), 結(jié)合生物信息學(xué)分析, 將小麥3個(gè)基因分別定位在4AL、4BS和4DS染色體上。亞細(xì)胞定位分析表明, TaVIP1蛋白分布于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草, 過表達(dá)基因降低了煙草轉(zhuǎn)化效率。小麥基因編碼的氨基酸序列與擬南芥基因及煙草基因編碼的氨基酸序列相似性很低, 這可能是小麥農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率低的原因之一。

小麥;; 煙草; 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

相比傳統(tǒng)雜交育種, 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因工程育種具有育種目標(biāo)明確、育種周期短、成本低等優(yōu)勢(shì)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)已逐步成為玉米、大豆等作物的重要育種手段之一, 然而在小麥上極低的轉(zhuǎn)化效率限制了該技術(shù)的應(yīng)用, 亟待鑒定、挖掘與小麥轉(zhuǎn)化效率相關(guān)的基因或蛋白, 利用基因工程手段提高小麥轉(zhuǎn)化效率, 促進(jìn)小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)開展[1-5]。

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中, 由農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒編碼的毒性基因(virulence,)發(fā)揮了重要作用。迄今為止, 已發(fā)現(xiàn)至少有20種Vir蛋白參與轉(zhuǎn)移DNA (transferred DNA, T-DNA)的形成和宿主基因組整合過程[6]。其中, VirE2是一種單鏈DNA結(jié)合蛋白, 通過與T-DNA單鏈非共價(jià)結(jié)合, 保護(hù)后者免于細(xì)胞內(nèi)核酸酶降解, 同時(shí)引導(dǎo)其進(jìn)入宿主基因組[7]。VIP1 (VirE2-interacting protein 1)是一種與VirE2蛋白特異互作的植物蛋白, 在VirE2與importinα蛋白互作中起橋梁作用, 同時(shí)利用自身的核定位信號(hào)引導(dǎo)VirE2的核輸入, 在酵母和動(dòng)物中不存在其同系物[8-9]。Tzfira等[10]以VirE2作為誘餌蛋白, 利用酵母雙雜交的方法首次在擬南芥中篩選到與VirE2互作的VIP1蛋白, 序列分析發(fā)現(xiàn)AtVIP1含有亮氨酸拉鏈(basic-zipper protein, bZIP)結(jié)構(gòu)域, 具有核定位(nuclear localization signal, NLS)功能。Djamei等[11]進(jìn)一步研究證實(shí), 擬南芥AtVIP1蛋白的第79位絲氨酸殘基磷酸化與否決定了AtVIP1的核定位功能。Lacroix等[12]在植物細(xì)胞活體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了DNA-VirE2-VIP1復(fù)合物的存在, 證實(shí)了VIP1引導(dǎo)VirE2進(jìn)入細(xì)胞核并與染色體上的核小體互作, 同時(shí), 此復(fù)合物進(jìn)一步與其他毒性蛋白(如VirF)等互作, 引導(dǎo)VirE2-VIP1降解并釋放T-DNA。

Tzfira等[10,13]研究VIP1在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)化中的作用時(shí)發(fā)現(xiàn), 不論是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染還是穩(wěn)定轉(zhuǎn)化, 表達(dá)反義cDNA的煙草植株都表現(xiàn)出對(duì)農(nóng)桿菌侵染的抗性, 而過表達(dá)擬南芥煙草植株, 則表現(xiàn)出較高的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率。此外, Li等[14]研究發(fā)現(xiàn), 部分突變的僅降低轉(zhuǎn)基因擬南芥穩(wěn)定轉(zhuǎn)化效率, 但對(duì)瞬時(shí)侵染沒有影響。

目前, 關(guān)于基因的研究主要集中在擬南芥和煙草等幾個(gè)模式植物中, 在小麥中還沒有該基因的研究報(bào)道。本研究根據(jù)擬南芥編碼序列, 利用技術(shù)克隆小麥基因家族, 通過對(duì)該基因家族的分子特性及在煙草轉(zhuǎn)化中的功能初步分析, 為解析農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥低轉(zhuǎn)化效率奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及過表達(dá)和亞細(xì)胞定位載體

普通小麥(AABBDD, 2= 42)品系CB037由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所陳孝研究員選育, 本課題組保存。普通小麥品系Luivo、植物表達(dá)載體pZP211和農(nóng)桿菌菌株C58C1由美國內(nèi)布拉斯加大學(xué)Tom Clemente教授提供。煙草品系NC89由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所裴新梧研究員提供。小麥二倍體野生材料PI10474 (, Tm)、PI330486 (, Ael)和TD38 (, Aet), 四倍體小麥Langdon (AABB), Langdon與中國春D組染色體整套代換系材料1D(1A)、2D(2A)、3D(3A)、4D(4A)、5D(5A)、6D(6A)、7D(7A)和1D(1B)、2D(2B)、3D(3B)、4D(4B)、5D(5B)、6D(6B)、7D(7B)[15], 以及亞細(xì)胞定位載體p16318-GFP均由本課題組保存, 過表達(dá)載體pWMB006由本課題組構(gòu)建。

1.2 基因組DNA、總RNA提取和cDNA合成

取飽滿無蟲蛀的小麥種子, 經(jīng)70%乙醇表面消毒1 min和20%次氯酸鈉溶液滅菌15 min, 無菌水沖洗4次后, 置無菌水浸潤(rùn)的濾紙上, 室溫暗培養(yǎng)至萌芽。隨后移入營養(yǎng)缽, 20 d后取嫩葉用于RNA提取。采用RNAprep Pure Plant Kit (Qiagen, Germany), 參照說明書提取總RNA, 并用DNase I (Sigma D5025)清除殘留的痕量基因組DNA, 然后按照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, 大連)操作說明, 以O(shè)ligo dT為引物合成cDNA第一鏈。同時(shí), 利用CTAB法[16]提取普通小麥CB037和Luivo的基因組DNA, 經(jīng)RNaseA處理并純化后, 于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 小麥基因家族序列檢索及克隆

以擬南芥AtVIP1的氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)為NM_103495)為種子序列,采用tblastn比對(duì)方法, 在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)及IWGSC (International Wheat Genome Sequencing Consortium)數(shù)據(jù)庫(http://www.wheatgenome.org/)檢索小麥全基因組shotgun數(shù)據(jù), 參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)。根據(jù)得到的候選全長(zhǎng)小麥基因序列, 利用Primer Premier 5.0軟件(PREMIER BiosoftInternational, USA)設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物(F: 5′-CGCCATGGACCCTCGCTTC-3′; R: 5′-AGG TTGCCCAGAGACTCCTCACAT-3′)。分別以小麥gDNA和cDNA作為模板, 利用KOD高保真聚合酶(KOD+Neo, TOYOBO, Japan)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min; 94℃變性45 s, 60℃退火1 min, 68℃延伸3 min, 35個(gè)循環(huán); 68℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物連入Trans-T simple載體(北京全式金生物技術(shù)有限公司), 并測(cè)序確認(rèn)。

1.4 目標(biāo)基因Southern blot檢測(cè)

將純化的小麥gDNA, 分別用限制性內(nèi)切酶R V、I和I完全酶切。以基因cDNA全長(zhǎng)作為探針, 利用地高辛標(biāo)記Southern blotting試劑盒(Roche), 參照說明書進(jìn)行Southern blot檢測(cè), 分析基因在普通小麥中的拷貝數(shù)。

1.5 目標(biāo)基因染色體定位

根據(jù)小麥基因序列設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增引物, 其中A基因組(F: 5′-GAGGACTCACCATTTTGTTATC A-3′; R: 5′-CACATTAGTTCCTCTCCTGCCA-3′)、B基因組(F: 5′-GGGCAGGGAGACAGTAACAGA-3′; R: 5′-ACATGGTCGACCCTCAGATG-3′)和D基因組特異引物(F: 5′-ATTATGTTGAAAGCTTCCTTGCT ACA-3′; R: 5′-CACATTAGTTCCTCTCCTGCTG-3′)的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為727、514和618 bp; 同時(shí)以四倍體小麥Langdon及其與中國春D組染色體14個(gè)代換系為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按TOYOBO產(chǎn)品說明, 采用step down步驟, 以提高擴(kuò)增特異性。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后照相, 記錄基因染色體定位結(jié)果。利用A或B基因組特異引物擴(kuò)增沒有特異帶出現(xiàn)時(shí), 說明目標(biāo)基因所在的染色體被D組的部分同源染色體代換, 即基因位于被代換的染色體上; 利用D基因組特異引物擴(kuò)增出特異帶時(shí), 說明目標(biāo)基因所在的D組染色體代換了Langdon中A組或B組的部分同源染色體, 即等位基因位于該D染色體上。

1.6 亞細(xì)胞定位

利用報(bào)告基因GFP (green fluorescent protein)對(duì)目的基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位。根據(jù)目的基因cDNA序列設(shè)計(jì)基因融合表達(dá)引物(TaVIP1-GFP-F: 5′-TATCGGATCCATGGACCCTCGCTTC-3′; TaVIP1- GFP-R: 5′-TGCTCAATCCCATGAAATCCA TGGAGTCG-3′; 下畫線為酶切位點(diǎn)), 利用同源重組(TaKaRa, 大連)將目的基因片段連接到p16318- GFP載體上, 命名為p16318-TaVIP1-GFP。采用Bio-Rad PDS1000/He基因槍(Bio-Rad, USA)無菌轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞, 黑暗培養(yǎng)12~16 h, 以激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM 700, Germany)觀察綠色熒光信號(hào), 檢測(cè)波長(zhǎng)為488 nm。

1.7 植物家族基因檢索和聚類分析

根據(jù)擬南芥基因序列, 采用Blastp方法在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)及Phytozomev11(http://www.phytozome.net/)數(shù)據(jù)庫中檢索植物基因, 由于部分物種測(cè)序不完整, 本研究利用in silico技術(shù)進(jìn)行全長(zhǎng)序列拼接, 并利用softberry (http://www.softberry.com/)網(wǎng)站的FGENESH/ FGENESH+對(duì)序列編碼區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

采用在線ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/ clustalw2/index.html)對(duì)檢索到的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì), 經(jīng)手動(dòng)調(diào)整后, 利用Mega 6.0軟件包中Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 對(duì)構(gòu)建的進(jìn)化樹進(jìn)行bootstraps檢驗(yàn), 設(shè)bootstrap參數(shù)為1000。

1.8 TaVIP1家族蛋白生化特性分析

采用BioEdit軟件(http://www.mbio.ncsu.edu/ bioedit/bioedit.html)手工編輯比對(duì)TaVIP1家族蛋白功能域, 利用WebLogo (http://weblogo.threeplusone. com/create.cgi)分析殘基保守性。蛋白質(zhì)bZIP結(jié)構(gòu)域及核定位信號(hào)預(yù)測(cè)軟件分別為2ZIP (http://www. expasy.org/)和PSORTII (http://www.genscript.com/ cgi-bin/tools/psort2.pl)。

1.9 過表達(dá)載體的構(gòu)建和煙草轉(zhuǎn)化

根據(jù)基因的ORF序列設(shè)計(jì)特異引物TaVIP1-BamHIF (5′-AAAGGATCCATGGACCCTCG CTTC-3′)和TaVIP1-SpeIR (5′-AAAACTAGTACTC CTCACATGAAATCC-3′), 分別在上下游引物中引入H I和I酶切位點(diǎn), 將基因構(gòu)建到pZP211載體上, 構(gòu)建重組質(zhì)粒pZP211-(圖1), 通過三親雜交法將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌C58C1。利用攜帶pZP211-載體的農(nóng)桿菌侵染預(yù)培養(yǎng)的煙草葉盤, 經(jīng)卡那霉素篩選, 獲得轉(zhuǎn)基因植株。利用CTAB法從轉(zhuǎn)基因煙草植株中提取基因組DNA, 利用引物TaVIP1F (5′-CGCCATGGACCCTCGCTTC-3′)和TaVIP1R (5′-AGGTTGCCCAGAGACTCCTCACAT- 3′)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

以擬南芥AtVIP1的氨基酸編碼序列(NM_ 103495)為種子序列, 采用技術(shù)搜索NCBI中小麥的EST, 得到一條與之同源性較高的小麥候選EST, 登錄號(hào)為AK335929, 利用NCBI中的ORF Finder程序確定起始和終止密碼子的位置, 并根據(jù)其側(cè)翼序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長(zhǎng)引物, 成功從小麥品系CB037的cDNA中擴(kuò)增出一條約1000 bp的片段。測(cè)序結(jié)果表明, 小麥基因cDNA全長(zhǎng)987 bp, 編碼328個(gè)氨基酸, 與煙草NtVIP1和擬南芥AtVIP1蛋白質(zhì)序列相似性只有45%和51%。該小麥基因已提交NCBI數(shù)據(jù)庫, 登錄號(hào)為KF752431。

鑒于小麥屬異源六倍體作物, 其基因組由3個(gè)異源二倍體構(gòu)成, 理論上每個(gè)基因在小麥上應(yīng)存在3個(gè)同源基因。據(jù)此, 本研究分別用限制性內(nèi)切酶R V、I和I對(duì)小麥品系CB037和Luivo的gDNA進(jìn)行完全酶切, 以地高辛標(biāo)記的克隆的基因全長(zhǎng)序列作為探針進(jìn)行Southern blot分析。結(jié)果表明, 2個(gè)小麥品系的gDNA經(jīng)R V和I酶切后均出現(xiàn)清晰的3條雜交帶(圖2), 因此認(rèn)為基因在普通小麥中有3個(gè)拷貝, 推測(cè)分別位于A、B、D染色體組上, 每個(gè)染色體組存在1個(gè)拷貝; 而2個(gè)小麥品系gDNA經(jīng)I酶切后只有2個(gè)雜交條帶(圖2), 推測(cè)與I酶切位點(diǎn)有關(guān), 存在大小相似的重疊片段。

1~3: 品系Luivo基因組DNA分別被R V、I和I酶切; 4~6: 品系CB037基因組DNA分別被R V、I和I酶切。

1–3: genomic DNA of line Luivo was digested byR V,I, andI, respectively; 4–6: genomic DNA of line CB037 was digested byR V,I, andI, respectively.

2.2 小麥基因的染色體定位分析

Southern blot雜交已明確在小麥中存在3個(gè)同源基因, 進(jìn)一步在IWGSC數(shù)據(jù)庫, 利用Blastn在線比對(duì)工具檢索到小麥3個(gè)高度相似序列(E值為0), 分別位于染色體4AL、4BS和4DS上, 序列識(shí)別號(hào)依次為TGACv1_scaffold_289134、TGACv1_scaffold_328709和TGACv1_scaffold_361639。利用FGENESH/FGENESH+對(duì)這3個(gè)高度相似序列編碼區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè), 發(fā)現(xiàn)3個(gè)同源序列均包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子(圖3), 與擬南芥及煙草(NP_001312899)在基因結(jié)構(gòu)上高度一致。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn), 本研究所克隆的小麥基因中的一個(gè)同源基因KF752431位于4BS染色體上。序列分析表明, 普通小麥中3個(gè)同源基因編碼蛋白相似性較高, 其中位于4AL與4DS染色體上的2個(gè)同源基因的相似性達(dá)99.1%, 而與4BS染色體上的同源基因的相似性為96.6%, 暗示4AL與4DS染色體上的基因可能存在功能重疊, 為此, 后續(xù)關(guān)于基因初步功能研究采用4BS上的同源基因。為了深入分析基因在小麥簇中的結(jié)構(gòu), 以小麥二倍體野生種為材料, 分別擴(kuò)增到來源于AA、SS和DD組的基因, 3種擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與普通小麥相應(yīng)基因組同源基因的序列沒有差異, 而且其編碼蛋白的大小也與普通小麥同源基因的相應(yīng)蛋白一致。

利用小麥3個(gè)同源基因特異引物, 對(duì)四倍體小麥Langdon及其與中國春D基因組14個(gè)代換系1D(1A)、2D(2A)、3D(3A)、4D(4A)、5D(5A)、5D(5A)、7D(7A)和1D(1B)、2D(2B)、3D(3B)、4D(4B)、5D(5B)、6D(6B)、7D(7B)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。發(fā)現(xiàn)利用A、B基因組上基因的特異引物擴(kuò)增時(shí), 除4D(4A)和4D(4B)代換系外的所有材料均擴(kuò)增出特異帶, 說明A、B基因組中的等位基因分別位于4A和4B染色體上(圖4-A, B); 利用D基因組基因的特異引物擴(kuò)增時(shí), 只有4D(4A)和4D(4B)代換系擴(kuò)增出了特異帶, 其他材料均沒有擴(kuò)增出特異帶, 說明D基因組中的等位基因位于4D染色體上(圖4-C)。根據(jù)PCR檢測(cè)獲得的染色體定位結(jié)果與序列數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)結(jié)果完全一致, 證明普通小麥中3個(gè)等位基因分別位于染色體4AL、4BS和4DS染色體上。

2.3 植物系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

為了解析植物基因系統(tǒng)發(fā)生極其進(jìn)化上的相關(guān)性, 從Phytozome v11及NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫中檢索到部分植物VIP1蛋白全長(zhǎng)序列, 結(jié)合本研究中克隆的小麥簇TaVIP1蛋白序列, 運(yùn)用MEGA6.0軟件進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹?？梢郧逦闯? 進(jìn)化樹明顯分成2個(gè)一級(jí)分支(羅馬數(shù)字表示)和4個(gè)二級(jí)分支(阿拉伯?dāng)?shù)字表示), 第I級(jí)分支包括單子葉和雙子葉植物, 而第II分支主要包括雙子葉植物。其中在第I級(jí)分支中, 單、雙子葉植物來源的VIP1又明顯形成2個(gè)獨(dú)立的二級(jí)分支, 第①級(jí)分支主要包括小麥族植物, 而第②級(jí)分支則包括十字花科植物, 如擬南芥, 白菜等。茄科植物主要分布在第③級(jí)分支, 其余植物的VIP1分布在第④級(jí)分支中(圖5)。

粗豎線表示染色體定位用引物。Vertical lines show the primers for chromosome location assay.

A: 利用A基因組上同源基因特異引物的擴(kuò)增結(jié)果; B: 利用B基因組上同源基因特異引物的擴(kuò)增結(jié)果; C: 利用D基因組上同源基因特異引物的擴(kuò)增結(jié)果。 M: DNA marker V, 自上而下分子量依次是2000、1500、1000、700、400和200 bp; 1~7: 四倍體小麥Langdon代換系1D(1A)、2D(2A)、3D(3A)、4D(4A)、5D(5A)、6D(6A)和7D(7A); 8~14: 四倍體小麥Langdon代換系1D(1B)、2D(2B)、3D(3B)、4D(4B)、5D(5B)、6D(6B)和7D(7B); 15: Langdon。

A: PCR amplification using the specific primers to the homologousgene onA genome; B: PCR amplification using the specific primers to the homologousgene on B genome; C: PCR amplification using the specific primers to the homologousgene on D genome. M: DNA marker V. Bands from up to down are 2000, 1500, 1000, 700, 400, and 200 bp; 1–7: Langdon durum disomic substitution lines 1D(1A), 2D(2A), 3D(3A), 4D(4A), 5D(5A), 6D(6A), and 7D(7A), respectively; 8–15: Langdon durum disomic substitution lines 1D(1B), 2D(2B), 3D(3B), 4D(4B), 5D(5B), 6D(6B), and 7D(7B), respectively.

2.4 植物VIP1蛋白功能保守域分析

為持續(xù)提升人才培養(yǎng)質(zhì)量，高校還需構(gòu)建完善的教學(xué)質(zhì)量保障體系。這是高等教育改革的必然要求，更是高等教育強(qiáng)國建設(shè)的必由之路?；谡J(rèn)知理論對(duì)高校教學(xué)質(zhì)量保障體系構(gòu)建分析，對(duì)于建立健全內(nèi)部教學(xué)質(zhì)量保障體系、完善高等教育人才培養(yǎng)理論而言，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

為了解析植物VIP1蛋白家族bZIP1結(jié)構(gòu)及其核定位信號(hào)序列, 利用WebLogo在線分析軟件, 對(duì)經(jīng)2ZIP和PSORTII的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行核心區(qū)域及上下游10~15個(gè)氨基酸殘基保守性分析。結(jié)果表明, 核定位信號(hào)核心氨基酸殘基在所分析的植物VIP1蛋白中十分保守(圖6-A); 同時(shí), bZIP結(jié)構(gòu)域中亮氨酸殘基位置保守性高, 每隔6個(gè)氨基酸殘基就存在一個(gè)亮氨酸(圖6-B)。

2.5 小麥TaVIP1的亞細(xì)胞定位

為了明確小麥TaVIP1蛋白亞細(xì)胞定位, 根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)in-fusion引物, 通過PCR擴(kuò)增獲得兩端攜帶載體序列的基因的cDNA序列(去掉終止子), 利用同源重組的方法連接到載體p16318-GFP上, 使其與綠色熒光蛋白N端融合形成TaVIP1-GFP融合蛋白。將構(gòu)建正確的融合蛋白表達(dá)載體通過基因槍轟擊進(jìn)入洋蔥表皮細(xì)胞, 使融合蛋白瞬時(shí)表達(dá), 以空載體p16318-GFP質(zhì)粒作為對(duì)照。結(jié)果表明, 在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核皆有GFP表達(dá)(圖7-D、E和F), 而對(duì)照質(zhì)粒的GFP則在整個(gè)細(xì)胞中隨機(jī)分布(圖7-A、B和C)。

羅馬數(shù)字表示一級(jí)分支, 阿拉伯?dāng)?shù)字表示二級(jí)分支; 實(shí)心和空心圓分別表示本研究所克隆到的來源于六倍體小麥和二倍體小麥的TaVIP1。

The primary and secondary branches are indicated by roman and arabic numbers, respectively. Filled and hollow circles represent the TaVIP1 proteins isolated from hexaploid and diploid wheat species, respectively. BoVIP1:, XP_013586120.1; BrVIP1:, XP_009145063.1; BnVIP1:, XP_013706434.1; GhVIP1:, XP_016693775.1; CsVIP1:, XP_006472967.1; VvVIP1:, XP_010665015.1; AtVIP1:, NP_564486.1; CsaVIP1:, XP_004141014.1; GrVIP1:, XP_012446799.1; AlVIP1:, XP_002891267.1; SpVIP1:, XP_015071489.1; GmVIP1:, KRH70316.1; StVIP1:, XP_006363906.1; NtVIP1:, NP_001312899.1; SlVIP1:, XP_004242016.1; TuVIP1:; HvVIP1:, BAK03813.1; ZmVIP1:, XP_008668106.1; SbVIP1:, XP_002441871.1; OsVIP1_J:Group, XP_015618202.1; OsVIP1_I:Group, EAY82358.1; AetVIP1:; AelVIP1:; TaVIP1_4A:, chromosome 4A; TaVIP1_4B:, chromosome 4B; TaVIP1_4D:, chromosome 4D.

2.6 小麥基因初步功能研究

以煙草品系NC89幼嫩葉片為材料, 分別用攜帶pZP211-載體和pZP211空載體的農(nóng)桿菌C58C1侵染其葉盤, 獲得抗性再生植株。移栽到花盆, 待再生植株生長(zhǎng)健壯時(shí), 取少量葉片提取gDNA, 利用基因全長(zhǎng)引物檢測(cè)轉(zhuǎn)基因陽性植株。重復(fù)3次基因轉(zhuǎn)化煙草試驗(yàn), 共侵染葉盤數(shù)47個(gè), 但以PCR僅檢測(cè)到1株呈陽性的轉(zhuǎn)基因煙草植株, 轉(zhuǎn)化率僅為2.1%, 而轉(zhuǎn)化pZP211空載體對(duì)照組的轉(zhuǎn)化率為35.0% (表1)?？梢? 將基因在煙草中過表達(dá), 對(duì)提高煙草的轉(zhuǎn)化效率具有負(fù)面作用, 因此認(rèn)為, 小麥基因可能抑制了T-DNA在植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)和向染色體上的整合。

3 討論

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化是一系列農(nóng)桿菌蛋白和植物蛋白相互作用的結(jié)果[7,17]。植物VIP1蛋白參與了T-DNA的核輸入和向植物基因組上的整合, 在農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要作用[8,10,13]。鑒于小麥極低的轉(zhuǎn)化效率, 本研究試圖通過分析小麥基因的克隆和分子特性, 來解釋農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化小麥效率較低的原因。

研究表明, 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥和煙草均具有較高的遺傳轉(zhuǎn)化效率, 而轉(zhuǎn)化小麥的效率一直比較低[3]。結(jié)合擬南芥VIP1與其遺傳轉(zhuǎn)化效率相關(guān)的報(bào)道[18], 我們比對(duì)分析了小麥與擬南芥及煙草基因的序列特點(diǎn), 發(fā)現(xiàn)它們?cè)诨蚪Y(jié)構(gòu)上一致, 均由4個(gè)外顯子組成(圖3), 但其編碼蛋白的相似性分別僅為45%和51%, 僅bZIP結(jié)構(gòu)域十分保守。同時(shí), 利用轉(zhuǎn)基因的方法將小麥基因轉(zhuǎn)入煙草, 對(duì)轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行的初步分析表明, 在煙草中過表達(dá)小麥基因降低了煙草對(duì)農(nóng)桿菌侵染的敏感性, 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率顯著低于對(duì)照(表1)。推測(cè)原因可能由于過表達(dá)的基因?qū)е缕渚幋a二聚化程度加劇, 干擾其介導(dǎo)的VirE2細(xì)胞核定位功能的發(fā)揮, 最終影響轉(zhuǎn)化效率[14,19]。Tzfira等[10,13]研究發(fā)現(xiàn), 在煙草中表達(dá)反義cDNA后, 受體煙草植株都表現(xiàn)出對(duì)農(nóng)桿菌侵染的抗性, 相反, 過表達(dá)的煙草植株其農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率顯著提高。最近, Shi等[19]探討了擬南芥突變體對(duì)農(nóng)桿菌的敏感性, 發(fā)現(xiàn)無論瞬時(shí)轉(zhuǎn)化還是穩(wěn)定轉(zhuǎn)化突變體的轉(zhuǎn)化率都與野生型相同。本研究結(jié)果與其類似。不同植物物種基因呈現(xiàn)轉(zhuǎn)化作用的不一致性, 可能是因?yàn)橹参锓N類間存在著巨大差異, 當(dāng)它們用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物組織時(shí), 因物種類型和植株發(fā)育時(shí)期存在很大差異, 一些基因的差異表達(dá)導(dǎo)致農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率在某些物種上明顯提高, 但卻在另一些物種上不表現(xiàn)提高效應(yīng)。事實(shí)上, 我們通過小麥?zhǔn)荏w植株生理狀態(tài)調(diào)節(jié)等策略, 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥部分基因型的效率已達(dá)20%左右(未發(fā)表), 證明這些基因型中基因可能與轉(zhuǎn)化效率沒有關(guān)系, 或在適宜的生理狀態(tài)中基因表達(dá)處于有利T-DNA轉(zhuǎn)化的最佳水平, 促進(jìn)了轉(zhuǎn)化效率的提高, 具體原因有待進(jìn)一步探討。

A: 橫線表示核定位結(jié)構(gòu)域, 下箭頭指示保守的極性氨基酸, 如賴氨酸(K)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)。B: 橫線表示bZIP結(jié)構(gòu)域, 數(shù)字1~6指示保守的亮氨酸(L)殘基。

A: nuclear localization signal domain. Overbar shows the NLS motif and polar amino acid positions are marked with arrows, including lysine (K), arginine (R), and glutamic acid (E). B: overbar shows the bZIP domain and conserved leucine (L) residues are numbered (1–6).

表1 TaVIP1基因過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草的轉(zhuǎn)化率

A~C: 轉(zhuǎn)化TaVIP1-GFP融合蛋白的洋蔥表皮細(xì)胞; D~F: 轉(zhuǎn)化GFP的洋蔥表皮細(xì)胞。A和D: 綠色熒光; B和E: 白光; C和F: 疊加。標(biāo)尺=10 μm。

A–C: onion epidermal cells expressing TaVIP1-GFP fusion protein; D–F: onion epidermal cells expressing GFP protein only. A and D: green fluorescence images; B and E: bright-field images; C and F: overlap of fluorescence and bright-field images. Scale bar = 10 μm.

另外, 小麥基因與擬南芥基因在序列上存在較大差異, 在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮作用的途徑和位置可能不同。亞細(xì)胞定位研究表明, 小麥TaVIP1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核, 其中以細(xì)胞核定位為主, 表現(xiàn)為細(xì)胞核中熒光物質(zhì)濃度較高(圖7-F), 這與Tzfira等[10,13]的報(bào)道一致。此外, 本研究發(fā)現(xiàn)有部分TaVIP1蛋白定位于細(xì)胞膜中, 這是現(xiàn)有文獻(xiàn)中尚未報(bào)道的結(jié)果, 可能的原因是過表達(dá)基因引起其表達(dá)產(chǎn)物量異常豐富, 容易形成聚合物無法通過細(xì)胞膜, 同時(shí), 由于亞細(xì)胞定位是以瞬時(shí)基因表達(dá)研究, 不可避免存在質(zhì)粒滯留細(xì)胞間隙的現(xiàn)象, 從而造成定位在細(xì)胞膜的誤判。在擬南芥中, 缺少氨基末端1~80個(gè)氨基酸的AtVIP1- GUS融合蛋白只定位于細(xì)胞核中[10]; 而全長(zhǎng)AtVIP1-YFP融合蛋白定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中, 其中, 突變后模擬磷酸化狀態(tài)的AtVIP1蛋白更趨于定位在細(xì)胞核中, 而突變后模擬非磷酸化狀態(tài)的AtVIP1蛋白則定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中[11]。Shi等[19]發(fā)現(xiàn), 突變后模擬磷酸化的AtVIP1蛋白和突變后模擬非磷酸化的AtVIP1蛋白都定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中, 但并沒有發(fā)現(xiàn)磷酸化的AtVIP1更趨向于定位在細(xì)胞核的結(jié)果。不同物種的VIP1蛋白的亞細(xì)胞定位也有所不同, 主要原因是基因的序列差異, 但也可能受到啟動(dòng)子類型、植物材料和外界環(huán)境的影響。

農(nóng)桿菌對(duì)植物的侵染和植物免疫是兩個(gè)拮抗的過程, 推測(cè)VIP1調(diào)控植物免疫信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程與其協(xié)助農(nóng)桿菌侵染植物的過程相互影響, 最后在不同植物中表現(xiàn)出不同的作用。對(duì)此, 史勇[20]提出了一個(gè)關(guān)于VirE2蛋白在農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物過程中作用的新模型, 認(rèn)為T-DNA鏈的細(xì)胞核定位主要受農(nóng)桿菌VirD2蛋白的影響。VirE2的主要作用是影響T-DNA鏈的形態(tài)使其更易通過核孔[17], VirE2在植物細(xì)胞中與VIP1互作調(diào)節(jié)植物防御基因的轉(zhuǎn)錄, VirE2與VIP1的互作使后者逗留在細(xì)胞質(zhì)中。由于VIP1在一些植物中的表達(dá)量很低, 降低了VIP1激活植物防御基因的表達(dá)水平, 從而提高了轉(zhuǎn)化效率, 這也部分說明過表達(dá)基因反而降低了煙草對(duì)農(nóng)桿菌侵染的敏感性。

VIP1蛋白不僅參與農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化, 其作為轉(zhuǎn)錄因子, 還調(diào)控許多下游基因的表達(dá), 參與植物免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑[8]。本研究克隆的基因在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)化過程中并沒有起到提高轉(zhuǎn)化率的作用, 但VIP1具有保守的bZIP結(jié)構(gòu)域, 屬于bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族的I亞族, 可通過與保守的VIP1應(yīng)答原件VRE結(jié)合, 可激活許多防御相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄, 引起植物對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的抵御反應(yīng)[8, 21]。業(yè)已證明, VIP1被促分裂原蛋白激酶MPK3 (Mitogen-activated protein kinase 3)磷酸化, 進(jìn)而遷移到細(xì)胞核, 激活防衛(wèi)基因的表達(dá)[11]。在表達(dá)被抑制的RNAi水稻植株中,基因的表達(dá)量相應(yīng)下降, 而基因?qū)儆诨蚣易? 在植物抵御病原菌侵害時(shí)表達(dá)量上升[22]。還可通過調(diào)控ABA途徑中的基因的表達(dá), 參與擬南芥滲透勢(shì)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[23]。另外, 抗逆相關(guān)基因硫氧還蛋白和轉(zhuǎn)錄因子基因的啟動(dòng)子區(qū)域都含有特異的VRE區(qū)域, 是VIP1蛋白的靶基因, 參與響應(yīng)假單胞桿菌等多種病菌侵染、損傷和氧化等逆境脅迫[11,24]。通過對(duì)本研究克隆的基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析, 發(fā)現(xiàn)TaVIP1也具有保守的bZIP結(jié)構(gòu)域, 屬于bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族的I亞族[8]。所以, 我們認(rèn)為基因在提高小麥等植物的抗病和抗逆性方面具有潛在利用價(jià)值, 有待進(jìn)一步鑒定。

4 結(jié)論

克隆了小麥基因, cDNA全長(zhǎng)987 bp, 編碼328個(gè)氨基酸。證明在普通小麥中存在3個(gè)同源基因, 分別位于4AL、4BS和4DS染色體。TaVIP1蛋白分布于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上, 過表達(dá)小麥TaVIP1基因不能提高煙草轉(zhuǎn)化率。小麥基因與擬南芥及煙草基因在序列、結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位及功能等方面有顯著差異, 可能小麥VIP1并非參與外源T-DNA在小麥細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和向基因組上的整合, 這可能是小麥農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率較低的原因之一。

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Cloning, Molecular Characterization, and Functional Analysis of WheatGenes

ZHAO Pei1,**, TENG Li-Jie2,**, WANG Ke1, DU Li-Pu1, REN Xian2, SHE Mao-Yun3,*, and YE Xing-Guo1,*

1Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Beijing 100081;2College of Biology and Engineering, Beifang University of Nationalities, Yinchuan 750002, China;3Crop Research Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230031, China

Plant VIP1 (VirE2 interacting protein 1) is involved in the transportation of T-DNA in plant cells afterinfection, affecting plant transformation efficiency. However, the function ofis unknown. Using in silico technique, a family ofgenes were successfully cloned from common wheat in this study. The gene family encompasses four exons and shares high similarity among its members while only shares 50.7%–51.4% similarity to the AtVIP1 in. Southern blotting assay showed that thehad three allelic copies in wheat genome. The three copies ofwere further assigned to wheat chromosomes 4AL, 4BS, and 4DS according to Blastn in the IWGSC (International Wheat Genome Sequencing Consortium) database, and experimentally confirmed by PCR using specific primers to eachallele based on their DNA sequences and Langdon-Chinese Spring disomic substitution lines. Subcellular localization analysis showed that TaVIP1 proteins were located in cell membrane, cytoplasm, and nucleus. Over-expression ofin tobacco obviously reduced-mediated transformation efficiency. The amino acid sequence encoded byonly had low similarity to the corresponding amino acid sequence encoded byinorin tobacco. This might be a reason of the low transformation efficiency of wheat mediated by.

Wheat;; Tobacco;-mediated transformation

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31401380, 31401376)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31401380, 31401376).

2016-03-25; Accepted(接受日期): 2016-09-18; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期)：2016-09-28.

10.3724/SP.J.1006.2017.00201

佘茂云, E-mail: ahxiaoshe@126.com; 葉興國, E-mail: yexingguo@caas.cn

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160928.0948.014.html