黃俊駿 王華華 候俊杰 梁衛(wèi)紅

(河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 新鄉(xiāng) 453007)

1 什么是CRISPR

CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是指基因序列上成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列。CRISPR本身是大多數(shù)細(xì)菌及古細(xì)菌中的一種防御系統(tǒng)，可用來(lái)對(duì)抗入侵的病毒及外源DNA。在這些生物基因組中的CRISPR位點(diǎn)上能表達(dá)與入侵病毒基因組序列相匹配的小分子RNA。當(dāng)微生物感染了這些病毒中的一種，CRISPR RNA就能通過(guò)互補(bǔ)序列結(jié)合病毒基因組，并表達(dá)CRISPR相關(guān)酶(核酸酶Cas)，它能靶向切割病毒DNA，進(jìn)而阻止病毒完成其功能[1]?？梢哉f(shuō)，CRISPR就是一把“分子剪刀”，能夠剪斷DNA分子。

2 何謂CRISPR技術(shù)

此前多種基因編輯技術(shù)(例如，ZFN/TALEN技術(shù)[2]、RNAi技術(shù))已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。而CRISPR技術(shù)因相對(duì)較為簡(jiǎn)單、廉價(jià)和高效，而且可以多處打靶，逐漸處于基因編輯技術(shù)領(lǐng)域的統(tǒng)治地位。

目前，科學(xué)家使用的CRISPR技術(shù)是由最簡(jiǎn)單的type II CRISPR改造而來(lái)，由有核酸內(nèi)切酶活性的Cas9蛋白和單鏈的導(dǎo)向RNA組成[3]。通過(guò)核酸內(nèi)切酶蛋白Cas9引起DNA雙鏈的斷裂，而細(xì)胞通過(guò)非同源末端連接(NHEJ)的修復(fù)會(huì)造成插入和缺失(INDEL)效應(yīng)，進(jìn)而造成基因的移碼突變而達(dá)到基因敲除的目的[2]。

3 如何使用CRISPR技術(shù)

將細(xì)菌的天然免疫防御系統(tǒng)CRISPR用于其他非細(xì)菌細(xì)胞時(shí)需要滿足兩個(gè)條件：①核酸酶Cas蛋白，用于切斷目的基因中的靶向DNA片段；②導(dǎo)向RNA的RNA分子，它既能通過(guò)互補(bǔ)靶向DNA結(jié)合目的基因，又能與核酸酶Cas蛋白形成復(fù)合物，進(jìn)而指導(dǎo)核酸酶Cas蛋白到達(dá)正確的剪切位點(diǎn)[4]。因此，在整個(gè)基因編輯的過(guò)程中，只需要導(dǎo)入編碼向?qū)NA和Cas蛋白的質(zhì)粒即可。一旦在細(xì)胞中表達(dá)了向?qū)NA和Cas9蛋白，那么這一復(fù)合物就能完成余下的工作，輕而易舉地切斷靶向DNA的兩條鏈。

目前，科研人員已經(jīng)研發(fā)出各種各樣的載體來(lái)滿足不同的生物體系，可直接從Addgene公司網(wǎng)站上查詢和選擇合適的CRISPR/CAS系統(tǒng)[5]。同樣，在目的基因靶向DNA區(qū)域選擇合適的位點(diǎn)時(shí)，也可從相關(guān)的的網(wǎng)站上[6]進(jìn)行查詢。然后研究人員可通過(guò)改變Cas活性，或結(jié)合其他元件，來(lái)達(dá)到調(diào)整這種工具在基因校正和基因調(diào)控方面作用的目的。

4 CRISPR技術(shù)有哪些應(yīng)用

CRISPR技術(shù)已成功應(yīng)用于動(dòng)物、植物和微生物等諸多物種的基因組改造，例如，Zhang等人將編碼Cas9蛋白的mRNA和兩條向?qū)NA分子直接注入小鼠的受精卵細(xì)胞中，成功地敲除了兩個(gè)基因，成功率達(dá)到了80%，并且只需要數(shù)周的時(shí)間[7]；中國(guó)科學(xué)院北京遺傳及發(fā)育生物學(xué)研究所Gao的團(tuán)隊(duì)利用CRISPR技術(shù)已經(jīng)成功地使OsPDS等4種水稻基因失活，該研究首次證實(shí)CRISPR-Cas系統(tǒng)能夠用于植物的基因組編輯；隨后又利用該技術(shù)將小麥中的TaMLO基因敲除，得到耐白粉病的小麥新品種[8]。 Zhang等人最近又構(gòu)建出一種新的小鼠模型，簡(jiǎn)化了CRISPR-Cas9系統(tǒng)在體內(nèi)基因組編輯實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用，并且構(gòu)建出最致命的一種人類癌癥——肺腺癌的模型[9]。

5 CRISPR技術(shù)有何意義

CRISPR技術(shù)從2012年底出現(xiàn)至今，可謂是生物界的焦點(diǎn)。CRISPR技術(shù)相對(duì)于RNAi、ZFN/TALEN等基因打靶技術(shù)來(lái)說(shuō)，具有更簡(jiǎn)便、更經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用越來(lái)越廣泛。一般的實(shí)驗(yàn)室都可以自主構(gòu)建平臺(tái)，為研究者解析生物基因功能提供了一種更加有效的辦法。2014年，《自然·方法》雜志在十周年之際推出紀(jì)念特刊，點(diǎn)評(píng)了在過(guò)去十年中對(duì)生物學(xué)研究影響最深的十大技術(shù)，CRISPR赫然上榜。CRISPR技術(shù)讓人們從全新的角度去認(rèn)識(shí)微生物中內(nèi)在和相互之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機(jī)制，認(rèn)識(shí)原核細(xì)胞和真核細(xì)胞之間的聯(lián)系和異同，甚至獲得協(xié)同進(jìn)化的證據(jù)。隨著CRISPR技術(shù)在人類醫(yī)療和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的潛在應(yīng)用價(jià)值的提升，這個(gè)技術(shù)還由于可能被用來(lái)培育和設(shè)計(jì)嬰兒、治療遺傳病或解決人類進(jìn)化過(guò)程中的缺陷而引發(fā)社會(huì)的廣泛關(guān)注。例如，早在20世紀(jì)70年代末，科研人員就已經(jīng)能夠通過(guò)大腸桿菌進(jìn)行胰島素的生產(chǎn)，這意味著基因編輯技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域存在巨大的應(yīng)用潛力；人類基因組測(cè)序早已于2005年完成，但關(guān)于人類絕大多數(shù)的基因的具體功能和作用的研究并沒(méi)有取得突破性的進(jìn)展，瓶頸就在于當(dāng)時(shí)的基因編輯技術(shù)操作過(guò)程太過(guò)復(fù)雜、耗費(fèi)昂貴等，而這一切都將因?yàn)镃RISPR技術(shù)的出現(xiàn)而發(fā)生巨大的改變。