范芳芳，樊 成，石旭東，伊 昕

（陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西西安 710048）

高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定淀粉制品中孔雀石綠隱形孔雀石綠殘留量的研究

范芳芳，樊 成，石旭東，伊 昕

（陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西西安 710048）

采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)的方法檢測(cè)粉條等淀粉制品中孔雀石綠和隱形孔雀石綠的殘留量；通過(guò)乙腈提取、氮吹濃縮、酸性氧化鋁小柱凈化的方法分離出淀粉制品中的目標(biāo)物；通過(guò)C18-ODS柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）（柱后接25%的二氧化鉛氧化柱），以乙腈與0.1 mol/L的乙酸銨緩沖溶液（用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至4.5）體積比80∶20為緩沖液，實(shí)現(xiàn)孔雀石綠和隱形孔雀石綠的分離。于波長(zhǎng)588 nm和618 nm處測(cè)定2種物質(zhì)的質(zhì)量濃度在0.3～8.0 μg/mL線性關(guān)系良好，相對(duì)偏差（n=7）小于2.5%，檢出限為0.08 μg/mL，分析時(shí)間為20 min。以粉條為基體進(jìn)行回收試驗(yàn)，回收率為77.9%～89.5%。

高效液相色譜-熒光檢測(cè)；孔雀石綠；隱形孔雀石綠；淀粉制品

孔雀石綠（C23H25N2，Malachite green，MG） 是一類合成的三苯基甲烷類化學(xué)物質(zhì)[1-2]，常作為防腐劑、殺菌劑、驅(qū)蟲(chóng)劑在水產(chǎn)中使用[3]，用來(lái)預(yù)防和治療各類水產(chǎn)動(dòng)物的水霉病、鍶霉病和小瓜蟲(chóng)病等[4]?？兹甘G及其代謝物（Leucomalachite green，LMG）具有極強(qiáng)的毒性，其官能團(tuán)三苯甲基可引起肝癌，因此被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為第2類致癌物質(zhì)[5]。由于孔雀石綠的廉價(jià)性，其使用范圍又被擴(kuò)大。近年來(lái)，有不良商販為了使粉條看起來(lái)顏色鮮綠，增加賣點(diǎn)，將孔雀石綠作為染色劑在制作粉條等淀粉制品的過(guò)程中加入。2015年，曾有地方食藥局查獲這樣一批粉條，加之在一定條件下，孔雀石綠和隱形孔雀石綠會(huì)互相轉(zhuǎn)化，因此建立粉條等淀粉制品中孔雀石綠和隱形孔雀石綠殘留的提取及檢測(cè)方法迫在眉睫。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物提取檢測(cè)方法的研究[6-11]很多，但對(duì)于淀粉制品中MG和LMG的提取檢測(cè)尚未見(jiàn)報(bào)道。水產(chǎn)動(dòng)物屬于生物體，在對(duì)MG和LMG殘留的提取上存在穿透細(xì)胞、去除蛋白[2]等雜質(zhì)的技術(shù)難點(diǎn)，而淀粉制品不存在這些問(wèn)題。經(jīng)過(guò)查閱大量參考文獻(xiàn)及反復(fù)的試驗(yàn)，研究最終通過(guò)用乙腈反復(fù)提取、氮吹至近干、乙腈重新溶解后過(guò)酸性氧化鋁小柱凈化，最后收集全部流出液，再用氮吹儀吹至近干，用乙腈溶解殘?jiān)⒍ㄈ?，通過(guò)C18-ODS柱（5 μm，4.6 mm×250 mm） （柱后接25%的二氧化鉛氧化柱），以乙腈與0.1 mol/L的乙酸銨緩沖溶液（pH值為4.5）體積比80∶20為緩沖液，實(shí)現(xiàn)孔雀石綠和隱形孔雀石綠的分離。該法具有操作簡(jiǎn)單、定量性好、回收率穩(wěn)定等特點(diǎn)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

孔雀石綠（草酸鹽）標(biāo)準(zhǔn)品和隱形孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品，均為德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司提供，其純度分別為95%和98%，生產(chǎn)批號(hào)分別為20201和30103；乙腈，色譜純，德國(guó)默克公司提供；試驗(yàn)用水為超純水，所用試劑除指定外均為分析純。

孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg/mL），準(zhǔn)確稱取0.01 g孔雀石綠（草酸鹽）標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容；隱形孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg/mL），準(zhǔn)確稱取0.01 g隱形孔雀石綠的標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容；量取約5.0 g不含孔雀石綠和隱形孔雀石綠的粉條粉碎樣于50 mL容量瓶中，量取一定量乙腈進(jìn)行混勻，經(jīng)超聲、離心后取上清液得到基質(zhì)溶液。用儲(chǔ)備液和基質(zhì)溶液配置一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于4℃的冰箱中冷藏保存；配制0.1 mol/L的乙酸胺溶液，并用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值為4.5，供流動(dòng)相用。

1.2 儀器與設(shè)備

2998 TDQ型高效液相色譜儀配有二聯(lián)泵、柱溫箱、UV2487型檢測(cè)器、Waters色譜工作站，美國(guó)Waters產(chǎn)品；HP5016SY型氮吹儀，上海濟(jì)成儀器廠產(chǎn)品；TG16-NS型離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；KQ-250DE型超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；JA1003N型天平，上海佑科儀器儀表有限公司產(chǎn)品。

1.3 色譜條件

色譜柱：Waters C18-ODS柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm），柱后接25%的二氧化鉛氧化柱；柱溫25℃；流速1.0 mL/min；流動(dòng)相：乙腈與0.1 mol/L的乙酸銨緩沖溶液（pH值為4.5）體積比為80∶20；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)588 mm和618 mm。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品提取

取一定量的粉條樣品，用打磨機(jī)將其打磨至粉末狀。稱取5.00 g粉條磨碎樣于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈，劇烈振搖30 s，以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心10 min，取上清液于潔凈試管中；然后向50 mL離心管中加入15 mL乙腈，重復(fù)上述操作，合并乙腈層至試管中。

1.4.2 樣品凈化

將盛有提取液試管放置含有水浴鍋的氮吹儀上，在45℃的條件下氮吹至近干，加入2.5 mL乙腈溶解殘?jiān)?。將酸性氧化鋁小柱放置在固相萃取裝置上，用5 mL乙腈活化，將試管中的溶液轉(zhuǎn)移至小柱中，用2.5 mL乙腈洗滌試管2次，洗滌液依次過(guò)柱，并控制流速，使其緩緩流下，收集全部流出液，于45℃條件下氮吹至近干，殘?jiān)? mL乙腈溶解，過(guò)0.45 μm濾膜，按色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

通過(guò)比較Agilent的C18型柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm）與Waters-ODS的C18型柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm）分離情況發(fā)現(xiàn)，后者對(duì)目標(biāo)物的分離效果好、基線平穩(wěn)、雜峰干擾少。在波長(zhǎng)分別為588 nm和618 nm時(shí)，孔雀石綠和隱形孔雀石綠分別在5.053 min和17.149 min時(shí)響應(yīng)值最大。

5 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)色譜見(jiàn)圖1。

圖1 5 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)色譜

2.2 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)中色譜分離的難點(diǎn)是孔雀石綠與周圍雜質(zhì)峰的分離程度。通過(guò)研究流動(dòng)相的組成以及各種梯度的淋洗發(fā)現(xiàn)，乙腈與0.1 mol/L的乙酸銨緩沖溶液（pH值為4.5）體積比為80∶20時(shí)，可實(shí)現(xiàn)孔雀石綠和隱性孔雀石綠與其周圍雜質(zhì)峰的完全分離，且分離所需時(shí)間最短，為20 min。

流動(dòng)相組成對(duì)目標(biāo)物峰型的影響見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相組成對(duì)目標(biāo)物峰型的影響

2.3 線性關(guān)系和檢出限

在色譜條件下，分別對(duì)所配置的孔雀石綠和隱形孔雀石綠的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定。以峰面積A對(duì)質(zhì)量濃度C（μg/mL）進(jìn)行線性回歸。

線性回歸方程和線性范圍見(jiàn)表2。

表2 線性回歸方程和線性范圍

孔雀石綠和隱形孔雀石綠檢出限均為0.08 μg/mL。

2.4 精密度試驗(yàn)

在色譜條件下，用5.0 μg/mL孔雀石綠、隱形孔雀石綠混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，每次20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，得孔雀石綠和隱形孔雀石綠的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.8%和1.3%，均小于2.5%。

2.5 回收率

以不含孔雀石綠和隱形孔雀石綠的粉條為樣品，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行回收試驗(yàn)。

回收試驗(yàn)結(jié)果（n=7）見(jiàn)表3。

表3 回收試驗(yàn)結(jié)果（n=7）

由表3可知，孔雀石綠的回收率整體高于隱形孔雀石綠，但是對(duì)于同種目標(biāo)物質(zhì)，回收試驗(yàn)時(shí)其加入的質(zhì)量與回收率并無(wú)直接關(guān)系。

2.6 樣品分析

分別從市場(chǎng)購(gòu)買多批粉條、粉絲以及粉帶等淀粉制品，按上述方法在色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，并用外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，這些產(chǎn)品的殘留量均小于0.08 μg/mL。

3 結(jié)論與展望

通過(guò)研究淀粉制品中MG和LMG殘留的檢測(cè)方法，建立了以乙腈溶解、氮吹濃縮以及酸性氧化鋁

小柱凈化的提取方法，并用高效液相色譜-熒光檢測(cè)器的方法進(jìn)行測(cè)定。該法具有穩(wěn)定性好、重現(xiàn)度高、定量性好以及檢出限低等優(yōu)點(diǎn)。在今后的試驗(yàn)中，應(yīng)進(jìn)一步對(duì)試驗(yàn)中各個(gè)因素進(jìn)行研究，并且提高回收率。

[1]李寧.孔雀石綠對(duì)健康的影響 [J].國(guó)外醫(yī)學(xué)（衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)），2005，32（5）：262-264.

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[8]任秀蓮，魏琦峰，程春萍，等.高效液相色譜測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物殘留量的研究進(jìn)展 [J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17（1）：173-176.

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[10]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 19857—2005水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定 [S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2005.

[11]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.SN/T 1479—2004進(jìn)出口水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量檢測(cè)方法 [S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.◇

Study on Extracting Malachite Green and Leucomalachite Green in Starch Products by HPLC-FLD

FAN Fangfang，F(xiàn)AN Cheng，SHI Xudong，YI Xin
（Shaanxi Institute of Product Quality Supervision and Inspection，Xi'an，Shaanxi 710048，China）

High performance liquid chromatography（HPLC）coupled with fluorescence detection（FLD）is developed for the detection of malachite green and leucomalachite green from starch products such as vermicelli.The sample is extracted with acetonitrile and purified by nitrogen and passing through SPE column of acidic aliminum oxide.The C18-ODS column 5 μm，4.6 mm×250 mm is used as the stationary phase（link with oxygen column of 25%lead dioxide），and solutions of acetonitrile and 0.1 mol/L ammonium acetate（adjusted to pH 4.5 with glacial acetic acid）mixed by the volume ration of 80∶20 are used as the mobile phase in gradient elution.Linear relationships between values of peak area and mass concentration of the 2 compounds are found in the same range of 0.3～8.0 μg/mL，with their detection limits less than 0.08 μg/mL.Array diode detection at 588 nm and 618 nm is adopted.Values of relative standard deviation（RSD）for the 2 compounds are all less than 2.5%.The time of this method is last for 20 min.Some of starch products are analyzed by this method，and test for recovery is calculated in the range of 77.9%～89.5%.

HPLC-FLD；malachite green；leucomalachite green；starch products

S948

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.01.021

1671-9646（2017）01a-0074-03

2016-11-11

范芳芳（1987— ），女，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩c檢測(cè)。