丁銀秀，張自新，馬江波，馮利強(qiáng)，劉印明

·經(jīng)驗(yàn)交流·

低劑量電離輻射對(duì)C6腦腫瘤干細(xì)胞增殖分化及凋亡的影響

丁銀秀1，2，張自新3，馬江波1,2，馮利強(qiáng)1,2，劉印明1,2

目的 觀察低劑量電離輻射對(duì)C6 BTSCs增殖、分化及凋亡的影響。方法 進(jìn)行C6 BTSCs的懸浮培養(yǎng)，應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察干細(xì)胞的生長特性，通過BrdU和CD133免疫熒光染色法明確C6 BTSCs的增殖情況，流式細(xì)胞分析法觀察低劑量電離輻射后C6 BTSCs的凋亡情況。結(jié)果 在無血清條件培養(yǎng)基的作用下，懸浮培養(yǎng)的C6 BTSCs增殖速度快，干細(xì)胞數(shù)量較多；低劑量電離輻射后，0.3 Gy組促進(jìn)C6 BTSCs增殖和分化能力，且0.3 Gy組C6 BTSCs存活細(xì)胞數(shù)量較多，凋亡的細(xì)胞數(shù)量較少，與對(duì)照組或3.0 Gy組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。結(jié)論 C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中存在具有干細(xì)胞特性的C6 BTSCs，且低劑量電離輻射刺激對(duì)C6 BTSCs的增殖、分化具有促進(jìn)作用。

C6腦腫瘤干細(xì)胞；低劑量電離輻射；流式細(xì)胞分析

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源:大鼠源性C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，由上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供。

1.2 主要試劑和儀器:DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基、Accutase 消化酶、B27、D1-SGH液購自Gibco公司，堿性成纖維細(xì)胞生長因子bFGF和表皮生長因子EGF 購自Peprotech公司；羊抗CD133、L-左旋多聚賴氨酸(PLL)、BrdU摻入試劑和Hoechst均購自Sigma公司，相應(yīng)標(biāo)記的熒光二抗購自Invitrogen公司，鼠抗BrdU購自Chemicon公司，免疫熒光封片劑購自Vector Laboratories Inc公司，T 25cm2培養(yǎng)瓶購自Corning公司，24孔板、96孔板是Nunc公司產(chǎn)品，其他試劑均為市購。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 C6 BTSCs的培養(yǎng)及增殖鑒定:將貼壁培養(yǎng)的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，消化，離心棄上清，加入無血清條件培養(yǎng)基(1∶1 DMEM/F12+2 % B27+20 ng/mL bFGF+20 ng/mL EGF)，重懸，制成單細(xì)胞懸液，按0.5×106/ cm2接種于T 25 cm2的培養(yǎng)瓶。鏡下觀察C6 BTSCs呈懸浮的細(xì)胞球生長，每5～6 d傳代1次。傳代采用 Accutase 消化合并機(jī)械分離法，收集C6 BTSCs離心，棄上清液，加入1mL Accutase蛋白酶作用5～8 min，用彎頭滴管輕柔吹打組織團(tuán)塊，制成單細(xì)胞懸液，離心，棄上清，再次加入無血清條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。以后每5 d傳代一次，方法同前。

將P3代的C6 BTSCs 培養(yǎng)至第3天，加入BrdU(終濃度10 μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h。將細(xì)胞球接種于經(jīng)PLL處理過的無菌玻片上，置恒溫孵育箱內(nèi)孵育2～4 h；經(jīng)4% 多聚甲醛室溫固定40 min，2 N濃 HC1，37 ℃抗原變性1 h；硼酸緩沖液抗原修復(fù),室溫作用10 min；0.3% Triton X-100，室溫封閉10 min，加入相應(yīng)的抗體，進(jìn)行免疫熒光染色。對(duì)貼壁2～4 h的細(xì)胞球進(jìn)行BrdU(1∶100)和CD133(1∶200)染色，免疫熒光抗淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3.2 低劑量電離輻射實(shí)驗(yàn):細(xì)胞培養(yǎng)同前，輻射實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[2]進(jìn)行操作。將培養(yǎng)3或4 d的P3代C6 BTSCs細(xì)胞混勻后分瓶，設(shè)定組別：con；0.3 Gy；3.0 Gy。在專業(yè)放療人員的操作指導(dǎo)下，應(yīng)用西門子直線加速器MD7745進(jìn)行C6 BTSCs等距離，等中心照射(6 mV- X-ray，300 Gy/min)。照射后維持該效應(yīng)48 h，細(xì)胞爬片分化，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況。

1.4 流式細(xì)胞凋亡測定:將維持低劑量電離輻射效應(yīng)48 h的C6 BTSCs收集在離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。加入Accutase蛋白酶進(jìn)行消化，37 ℃作用5～8 min。機(jī)械吹打數(shù)次制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/cm2～1×106/cm2，加入PI和AnnxinV燃料，置4 ℃冰箱，作用30 min后上機(jī)檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果至少重復(fù)3次，2組間比較用t檢驗(yàn)，以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C6 BTSCs的形態(tài)學(xué)觀察:在無血清條件培養(yǎng)基的作用下，C6 BTSCs呈懸浮的細(xì)胞球生長。接種初期的C6 BTSCs懸浮于液體中，胞體大小均一，折光性強(qiáng)。12 h后細(xì)胞聚集成球，并不斷增大；5 d左右，進(jìn)行細(xì)胞傳代。經(jīng)Accutase蛋白酶合并機(jī)械分離法以1∶4比例傳代，99%的細(xì)胞可消化為單細(xì)胞，細(xì)胞活性良好，12 h后再次出現(xiàn)分裂相，并聚集成球。以后每5 d左右傳代一次，方法同前。

將P3代C6 BTSCs的細(xì)胞球進(jìn)行BrdU和 CD133免疫熒光染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，呈BrdU和 CD133強(qiáng)陽性，且C6 BTSCs增殖速度快，干細(xì)胞的數(shù)量較多。

2.2 低劑量電離輻射刺激對(duì)C6 BTSCs增殖和分化的影響:維持低劑量輻射效應(yīng)48 h后，將P3代的C6 BTSCs細(xì)胞球爬片分化，2～4 h完全貼壁，有細(xì)胞從細(xì)胞球邊緣遷移出來，24 h 后細(xì)胞向遠(yuǎn)處遷移的細(xì)胞增多，48 h細(xì)胞球可完全遷移分散開。在5%低血清條件培養(yǎng)基的作用下，與對(duì)照組比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.3 Gy低劑量電離輻射刺激促進(jìn)C6 BTSCs細(xì)胞聚球能力，細(xì)胞球的增殖速度較快，細(xì)胞數(shù)量增多。當(dāng)輻射刺激48 h后細(xì)胞爬片分化能力增強(qiáng)；當(dāng)照射劑量達(dá)到(3.0 Gy)時(shí)，C6 BTSCs的細(xì)胞聚球能力受到抑制，死亡細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞增殖速度減慢，且爬片分化能力下降。

2.3 低劑量電離輻射刺激對(duì)C6 BTSCs凋亡的影響:維持低劑量輻射效應(yīng)48 h后，收集P3代的C6 BTSCs進(jìn)行流式細(xì)胞分析，觀察低劑量電離輻射刺激C6 BTSCs凋亡的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低劑量電離輻射后，0.3 Gy組C6 BTSCs存活細(xì)胞數(shù)量較多，早晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)量較少，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)；當(dāng)電離輻射刺激劑量達(dá)到3.0 Gy時(shí)，C6 BTSCs早晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)量較多，壞死的細(xì)胞數(shù)量也明顯增加,見表1。

表1 流式細(xì)胞分析低劑量電離輻射后C6 BTSCs的細(xì)胞凋亡情況

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)惡性腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的1/3～2/3[8]。由于膠質(zhì)瘤與周圍組織呈浸潤式生長，手術(shù)治療不能完全切除病灶，術(shù)后易復(fù)發(fā)，預(yù)后差，死亡率較高，也是困擾臨床醫(yī)生的難題。越來越多的證據(jù)表明，腦腫瘤干細(xì)胞(BTSCs)可能成為腦腫瘤防治的關(guān)鍵靶點(diǎn)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中具有重要的作用[9-11]。目前放療聯(lián)合手術(shù)治療仍然是腦膠質(zhì)瘤治療的主要手段，但放療照射的劑量并無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，考慮到機(jī)體對(duì)放療的輻射敏感效應(yīng)不盡相同，且其在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也殺死正常細(xì)胞。因此，如何界定放療照射閾值就顯得尤為重要。如果能定向誘導(dǎo)、靶向干預(yù)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起決定性作用的腫瘤干細(xì)胞的增殖、分化和凋亡過程，從而調(diào)控腫瘤的無限增殖和術(shù)后復(fù)發(fā)，是研究腦膠質(zhì)瘤防治的重要方向。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中電離輻射對(duì)干細(xì)胞的影響，具體調(diào)控機(jī)制的研究仍然處于早期階段。本研究應(yīng)用不同劑量的電離輻射作用于懸浮培養(yǎng)的C6 BTSCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，電離輻射劑量的高低與干細(xì)胞受損的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。當(dāng)輻射刺激48 h后，0.3 Gy低劑量電離輻射刺激促進(jìn)C6 BTSCs細(xì)胞聚球能力，細(xì)胞球的增殖速度較快，細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞爬片分化能力增強(qiáng)；當(dāng)照射劑量達(dá)到3.0 Gy時(shí)，C6 BTSCs的細(xì)胞聚球能力受到明顯抑制，死亡細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞球增殖速度減慢，且細(xì)胞分化能力下降，細(xì)胞突起變短、變粗，提示腦腫瘤干細(xì)胞增殖、分化能力與電離輻射劑量存在劑量效應(yīng)關(guān)系。研究表明，膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)電離輻射較敏感，一定劑量的電離輻射刺激調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞的增殖、分化過程[12-14]。

電離輻射的強(qiáng)度也極大地影響干細(xì)胞的存活和凋亡，且具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。有研究表明，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)低劑量電離輻射的放射抑制，增加了細(xì)胞的存活,抑制干細(xì)胞的凋亡[15]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用不同劑量的電離輻射刺激體外培養(yǎng)C6 BTSCs的流式細(xì)胞結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，0.3 Gy低劑量電離輻射刺激C6 BTSCs存活細(xì)胞數(shù)量較多，早晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)量較少。當(dāng)照射劑量達(dá)到3.0 Gy時(shí)，C6 BTSCs早晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)量較多，壞死的細(xì)胞數(shù)量也明顯增加。與上述結(jié)果是一致的，分析原因細(xì)胞凋亡可能與輻射導(dǎo)致DNA鏈斷裂損傷、多種信號(hào)通路的激活以及離子通道的開放等有關(guān)[16-18]。細(xì)胞凋亡，又稱程序化細(xì)胞死亡，它在胚胎發(fā)生、發(fā)育以及腫瘤發(fā)生等方面具有十分重要的作用。即使是在正常情況下，干細(xì)胞的分化過程中也存在細(xì)胞凋亡。電離輻射對(duì)干細(xì)胞凋亡的具體作用機(jī)制不是很清楚，這也是今后研究關(guān)注的主要方向。

這些前期研究和實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，電離輻射對(duì)神經(jīng)發(fā)生活動(dòng)可能具有重要的干預(yù)作用，特別是低劑量電離輻射的生物學(xué)效應(yīng)及其分子機(jī)制問題，有待進(jìn)一步的深入研究。在腫瘤的放療過程中，當(dāng)選擇合適的輻射劑量，優(yōu)化病變輻射的部位，盡可能多地殺死癌變細(xì)胞，又要使電離輻射對(duì)周圍正常組織的損傷降低到最小。因此，輻射劑量閾值的界定對(duì)腦膠質(zhì)瘤的臨床治療具有重要的指導(dǎo)意義。

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10.13621/j.1001-5949.2017.01.0080

R739.4

B

寧夏自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NZ14136)；國家自然科學(xué)基金地區(qū)項(xiàng)目(81360062)

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)顱腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 7500042.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖和組織胚胎學(xué)系，寧夏 銀川 7500043.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤醫(yī)院放療科，寧夏 銀川 750004

輻射治療是繼手術(shù)治療惡性腦腫瘤的主要方式之一。傳統(tǒng)概念認(rèn)為電離輻射對(duì)機(jī)體有害，但近年國內(nèi)外研究證實(shí)，低劑量電離輻射能夠促進(jìn)干細(xì)胞增殖，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生最大的生物保護(hù)效應(yīng)[1-3]。提示電離輻射可能成為研究腫瘤干細(xì)胞增殖分化的重要工具[4-5]。另有研究表明，腦膠質(zhì)瘤中存在腦腫瘤干細(xì)胞，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)密切相關(guān)[6-7]。因此，本項(xiàng)目擬應(yīng)用低劑量電離輻射實(shí)驗(yàn)，檢測其對(duì)體外培養(yǎng)的C6腦腫瘤干細(xì)胞增殖、分化及凋亡的影響，預(yù)期為低劑量放射技術(shù)防治腦腫瘤疾病的輻射劑量閾值的界定提供必要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2016-06-17 [責(zé)任編輯]王凱榮