張明亮，黃允寧，盧 林，李智勇，馬強(qiáng)波，馬海雁，靳丁丁，徐遠(yuǎn)義，趙 帥，封存志

·臨床研究·

以CK19為標(biāo)記物研究pN0胃竇癌區(qū)域淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移

張明亮1，黃允寧1，盧 林1，李智勇1，馬強(qiáng)波1，馬海雁1，靳丁丁1，徐遠(yuǎn)義2，趙 帥2，封存志1

目的 通過檢測常規(guī)病理檢查結(jié)果為全部陰性的胃竇癌淋巴結(jié)CK19的表達(dá)量，證實pN0胃竇癌區(qū)域淋巴結(jié)中存在微轉(zhuǎn)移，分析微轉(zhuǎn)移與胃竇癌臨床病理學(xué)的相關(guān)性。方法 取20例pN0胃竇癌患者經(jīng)常規(guī)病理檢測認(rèn)為無轉(zhuǎn)移的區(qū)域淋巴結(jié)蠟塊99個，5例非腫瘤患者淋巴結(jié)蠟塊19個，用RT-PCR檢測淋巴結(jié)中K19mRNA表達(dá)，使用統(tǒng)計學(xué)方法分析檢測結(jié)果與患者臨床病理因素的相關(guān)性。結(jié)果 20例胃竇癌患者中，有5例患者(25%)共計21個淋巴結(jié)(21.2%)檢測陽性，5例非腫瘤患者淋巴結(jié)中均未檢測到CK19mRNA。pN0胃竇癌淋巴結(jié)CK19mRNA陽性表達(dá)與腫瘤的TNM分期呈正相關(guān)性(P<0.05),與腫瘤的部位 、大小、分化程度以及患者的性別、年齡無相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論 PN0胃竇癌區(qū)域淋巴結(jié)存在微轉(zhuǎn)移，淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移與腫瘤浸潤深度有關(guān)，CK19mRNA檢測胃癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移特異性高，可以作為理想的靶基因用于檢測胃竇癌微轉(zhuǎn)移

pN0；淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移；早期胃竇癌

胃竇癌是消化道常見的惡性腫瘤，臨床上許多通過病理組織學(xué)檢測無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃竇癌早期患者，縱然行標(biāo)準(zhǔn)胃癌根治術(shù),但術(shù)后仍死于轉(zhuǎn)移、 復(fù)發(fā)[1]。有學(xué)者對此進(jìn)行研究并提出了癌癥的微轉(zhuǎn)移概念[2]。CK19是相對分子量最小的細(xì)胞角蛋白，是眾多腫瘤標(biāo)記物中常用的一種，主要表達(dá)于單層腺上皮及間皮組織中,僅在癌組織中特異表達(dá)或異常表達(dá)，而不在正常組織中表達(dá)[3]。本文旨在以CK19mRNA為標(biāo)記物對pN0胃竇癌區(qū)域淋巴結(jié)進(jìn)行研究，明確了常規(guī)病理檢查HE染色為陰性的胃竇癌區(qū)域淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的存在，分析胃竇癌臨床病理學(xué)與微轉(zhuǎn)移學(xué)的相關(guān)性，探討pN0胃竇癌患者胃癌根治術(shù)的淋巴結(jié)清掃范圍。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本的選擇范圍:篩選2011年10月-2013年6月寧夏人民醫(yī)院胃腸外科診斷為胃竇癌并行胃癌根治術(shù)+D2淋巴結(jié)清掃術(shù)的20例患者，術(shù)前均未接受化療、放療，其清掃區(qū)域淋巴結(jié)經(jīng)常規(guī)病理切片檢查證實轉(zhuǎn)移全部為陰性。篩選患者中，女性8例,男性12例；年齡45～72歲，中位年齡57.7歲。收集20例胃竇癌患者的第1、2站共99個淋巴結(jié)蠟塊，每例3～6個，平均每例收集4.5個。另選5例非腫瘤患者作為陰性對照組，5例患者中，年齡最大65歲，最小40歲，中位年齡52.2歲；男性3例，女性2例。5例患者共取18個淋巴結(jié)蠟塊，其中包括十二指腸穿孔、胃潰瘍患者各2例，幽門管狹窄1例。

1.2 主要試劑:TRIzol試劑盒為GIBCO產(chǎn)品，Therom 反轉(zhuǎn)錄試劑盒K1622為Therom Fisher Scientific產(chǎn)品，瓊脂糖為西班牙產(chǎn)品。

1.3 標(biāo)本處理:取實驗組及對照組患者淋巴結(jié)石蠟塊，人工切片，置于無酶EP管內(nèi)，-80 ℃保存，以備提取RNA。

1.4 操作及方法: ①引物的設(shè)計與合成 CK19引物序列:5′-AGTTGGATAGCGGTCCGCGCT-3′和5′-AAGTAGCTCTCCGTCGAGCT-3′，其擴(kuò)增片斷為460 bp；內(nèi)參GAPDH的基因引物序列:5′-CACCCCGGGACCGAGGA-3′,5′-CTTCCACGCTTTCAAATGCGAAAAC-3′，其擴(kuò)增片斷為540 bp。上述兩引物均由上海生物工程公司合成。② RNA的提取，按照TRIzol試劑盒說明書提取標(biāo)本總RNA,使用紫外分光光度法鑒定RNA的含量及完整性。③逆轉(zhuǎn)錄(cDNA的合成)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為100 μl，AMV 8 μl、RNA 16 μl、RNasin 2 μl、Oligo (dt)4 μl、5×Buffer 20 μl、dNTPS 8 μl、DEPC-H2O 50 μl在42 ℃溫箱下孵育60 min,以mRNA為模板,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。④ PCR反應(yīng)，該反應(yīng)體系為200 μl，MgCl2 12 μl、Taq酶2 μl、 cDNA 50 μl、GAPDH引物1 μl、dNTPs 16 μl、 10×Buffer 20 μl、K19引物4 μl、 DEPC-H2O 47.5 μl。反應(yīng)體系的循環(huán)參數(shù)為94 ℃ 150 s、 58 ℃ 60 s、 72 ℃ 1 min，共40個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。⑤ PCR產(chǎn)物分析，將PCR產(chǎn)物置于1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色,應(yīng)用GIS數(shù)碼凝膠圖象分析結(jié)果，將結(jié)果逐一記錄。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料比較用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

20例胃竇癌患者中，第1、2站淋巴結(jié)99個，用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法測定 CK19mRNA的表達(dá)，共有5例患者(25%)的21個淋巴結(jié)檢測陽性，pN0胃竇癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的檢出率為21.2%(21/99)；對照組5例患者均未檢出CK19mRNA。 pN0胃竇癌區(qū)域淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的存在與腫瘤TNM分期呈正相關(guān)性(P<0.05),與患者的性別、年齡、腫瘤的分化程度、腫瘤的部位以及大小無相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

表1 pN0胃竇癌區(qū)域淋巴結(jié)CK19mRNA 表達(dá)與病理組織學(xué)的關(guān)系

3 討論

細(xì)胞角蛋白19是細(xì)胞角蛋白家族中被經(jīng)常使用作為檢測胃癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的標(biāo)記物，岳欣等使用免疫組化法證實CK19的免疫組化染色是檢測胃癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的敏感易行的方法[4]?，F(xiàn)已證實CK19在大腸癌、胃癌、乳腺癌均高表達(dá)，甚至有報道CK19在胃癌中的表達(dá)接近100%[5]。本研究中的所有組織標(biāo)本中，CK19mRNA 僅在胃竇癌患者淋巴結(jié)表達(dá)陽性，而在非癌癥患者的淋巴結(jié)中表達(dá)為陰性，說明CK19的特異性很高，可以作為理想的靶基因用于檢測胃竇癌微轉(zhuǎn)移。

胃癌是導(dǎo)致癌癥患者死亡的第二大原因[6]，盡管D2式淋巴清掃已經(jīng)作為治療胃癌患者的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)式，但接受了標(biāo)準(zhǔn)胃癌切術(shù)后的患者，5年生存率仍然不理想(西方國家是20%，亞洲國家是60%)[7]。有學(xué)者對此進(jìn)行研究，提出了癌癥的亞臨床轉(zhuǎn)移-微轉(zhuǎn)移概念，微轉(zhuǎn)移是指傳統(tǒng)的組織學(xué)檢查淋巴結(jié)的1個切面不能發(fā)現(xiàn)或難以發(fā)現(xiàn)直徑<2 mm的癌轉(zhuǎn)移灶[8]。在本實驗中，20例pN0胃竇癌患者淋巴結(jié),經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增CK19mRNA，其中5例患者的淋巴結(jié)呈陽性表達(dá)，pN0胃竇癌患者中淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移檢出率高達(dá)25%；99 個淋巴結(jié)中有21個淋巴結(jié)CK19mRNA表達(dá)陽性，其微轉(zhuǎn)移檢出率為21.21%。區(qū)域淋巴結(jié)CK19mRNA 表達(dá)與病理組織學(xué)關(guān)系分析表明，pN0胃癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的存在與胃癌TNM分期有相關(guān)性(P<0.05),與患者的年齡、性別、腫瘤的大小、腫瘤的分化程度以及部位無相關(guān)性(P>0.05)。本文結(jié)果表明，pN0期胃竇癌患者存在微轉(zhuǎn)移，其發(fā)生率為25%；胃癌患者淋巴結(jié)存在微轉(zhuǎn)移，其發(fā)生率為21.21%。

Fukagawa T等[9-10]認(rèn)為即使通過免疫組化法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胃癌患者存在淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，標(biāo)準(zhǔn)胃癌切除術(shù)加D2淋巴結(jié)清掃仍是一種恰當(dāng)?shù)闹委煼椒?。Zeng Yong等通過Meta分析證實，淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移與亞洲胃癌患者5年生存率有關(guān)[11]，存在淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的胃癌患者，5年生存率顯著低于無淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的胃癌患者。提示臨床醫(yī)師應(yīng)在術(shù)中注意把握清掃淋巴結(jié)的范圍。我們認(rèn)為，目前對于早期胃癌手術(shù)治療，認(rèn)真執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)胃癌切除及D2淋巴結(jié)清掃是十分必要的。

[1] Youn HG，An JY，Chol MG，et al.Recurrence after curative resection of early gastric cancer[J].Annals of Surgical Oncology，2010，17(2):448-454.

[2] Isozaki.The New Age of cardiac surgery driven by tissue engineering and biotechnology[J].Medicine and Health Rhode Island，2006，89(1):6-10.

[3] 楊永棟，阿不都外力·吾守爾,王云海.MUC1mRNA和CK19mRNA在胃癌淋巴結(jié)表達(dá)的意義[J].中國微創(chuàng)外科雜志，2007，7(7)：697-700.

[4] 岳倫，王家倫.N0期31例胃癌患者區(qū)域淋巴結(jié)組織中CK19的表達(dá)[J].腫瘤防治雜志，2005，12：900-902.

[5] Moll R，F(xiàn)rankeo W.The catalog of human cytokeratin:patterns of expression in normal epithlia，tumors and cultured cells[J].Cell,1982,31:11-24.

[6] Ferlay J，Shin HR，Bray F，et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008[J].International Journal of Cancer，2010，127(12):2893.

[7] Mori M，Mimori K，Inoue H，et al.Detection of cancer micrometastases in lymph nodes by reverse transcriptasepolymerase chain reaction[J].Cancer Res,1995,55:3417.

[8] 趙愛蓮,李吉友,孫文清.常規(guī)檢查淋巴結(jié)陰性胃癌的淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移研究[J].中華腫瘤雜志,2000,22(3):222-224.

[9] Siewert JR，Kestlmeier R，Busch R，et al.Benefits of D2 lymph node dissection for patients with gastric cancer and pN0 and pN1 lymph node metastases[J].Br J Surg，1996，83:1144-1147.

[10] Fukagawa T，Sasako M，Mann GB，et al.Immunohistochemically detected micrometastases of the lymph nodes in patients with gastric carcinoma[J].Cancer，2001，92(4):753-760.

[11] Zeng Yongji，Zhang Chundong，Dai Dongqiu.Impact of lymph node micrometastasis on gastric carcinoma prognosis:a meta-nanlysis[J].World Journal of Gastroenterology，2015，21(5):1628.

Study on the lymph node metastasis of gastric antrum carcinoma in PN0 with CK19 marker

ZHANGMingliang1，HANGyunning1，LULin1，LIZhiyong1，MAQiangbo1，JINDingding1，MAJianwen1，XUYuanyi2，ZHAOShuai2，F(xiàn)ENCunzhi1.

1.GastrointestinalSurgery，NingxiaPeople'sHospital，Yinchuan750002，China;2.ClinicalCollegeNingxiaofMedicalUniversity，Yinchuan750004，China

Correspondingauthor:HUANGYunning,Email: 641291178@ qq.com

Objective To detect CK19 of gastric antrum cancer lymph node by routine pathological examination and results were all negative.And to confirm micrometastasis was occurring in pN0 gastric antrum cancer lymph node and to explore the relevance between micrometastasis and clinical pathology of gastric antrum cancer.Methods 20 cases of pN0 gastric antrum cancer patients with regular pathological examination that there was no metastasis of lymph node paraffin block 99，five cases of non-tumor lymph node paraffin block 19，the expression of K19 mRNA was detected by using RT-PCR in lymph nodes.The correlation between the detection results and the clinical pathological factors were analyzed.Results In all of the 20 cases of gastric antrum cancer patients，there was five patients (25%) with total of 21 lymph nodes (21.2%) tested positive and five non-tumor patients tested negative.Lymph node metastasis of gastric antrum carcinoma was related to tumor invasion and depth (P<0.05)，and the age，sex，tumor size，degree of differentiation，and location of pN0 (P>0.05) were not related.Conclusion The regional lymph node of pN0 gastric antrum cancer present micrometastasis，and CK19 mRNA can be used as an ideal target gene for detection of gastric cancer with lymph node metastasis.Lymph node metastasis is related to the depth of tumor invasion.

pN0；Lymphnodemicrometastasis；Earlygastricantrumcancer

10.13621/j.1001-5949.2017.01.0036

寧夏自然科學(xué)基金資助項目(NZ14163)

1.寧夏人民醫(yī)院胃腸外科，寧夏 銀川 7500022.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004

黃允寧，Email:641291178@ qq.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170112.1704.016.html

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A

2016-09-20 [責(zé)任編輯]李 潔