李 凡，郎 冰，張 楠，馬 驕，張 蕊，丁斐嘉，李云鴻，王 銀

·論 著·

苦參堿對神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細胞的抗腫瘤作用

李 凡1,2，郎 冰3，張 楠1,2，馬 驕1,2，張 蕊1,2，丁斐嘉1,2，李云鴻1,2，王 銀1,2

目的 研究苦參堿(MT)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87凋亡的作用及其機制。 方法 培養(yǎng)U87細胞，通過CCK-8細胞增殖實驗檢測MT對U87細胞增殖的影響并確定最佳用藥濃度。實驗分為正常對照組(Control)和加藥組(MT)，利用Western blot檢測2組U87細胞中熱休克蛋白60(HSP60)和Caspase-3的表達水平及應(yīng)用免疫熒光染色技術(shù)檢測MT對U87細胞凋亡的影響。結(jié)果 0.4-0.8μg/μl的MT可以減少U87細胞的增殖，與對照組相比，0.4μg/μl的MT促進了HSP60 和Caspase-3的表達，U87細胞數(shù)目明顯減少(P<0.05)。結(jié)論 MT可能通過提高HSP60的表達促進U87細胞的凋亡。

苦參堿；熱休克蛋白60;神經(jīng)膠質(zhì)瘤

苦參堿(MT)是在苦參根部發(fā)現(xiàn)的生物堿，它們具有各種藥理活性，表現(xiàn)出具有抗炎、抗過敏、抗病毒、抗纖維化和心血管保護作用[1]。最近MT被證實具有抑制癌細胞的增殖，加速細胞凋亡，抑制癌轉(zhuǎn)移和侵襲等抗癌潛力，是極有前途的抗腫瘤藥物[2]，但是MT抗癌的確切機制尚不清楚。熱休克蛋白60(HSP60)主要位于線粒體內(nèi)，研究報道它在病理條件下具有促進細胞凋亡的作用。在心力衰竭的心肌細胞中HSP60的表達和定位發(fā)生了改變，導致心肌細胞的凋亡[3]。本文旨在通過CCK-8細胞增殖實驗，并檢測HSP60 和凋亡因子Caspase-3來研究MT對神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細胞的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 材料：MT購自Tocris公司；HSP60抗體購自Enzo公司；Caspase-3抗體購自Cell Signaling公司；CCK-8試劑盒購自碧云天公司；全蛋白提取試劑盒購自凱基公司；蛋白定量BCA試劑盒購自Thermo公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品；DAPI染色液購自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 U87細胞的培養(yǎng)：U87細胞在含有10%胎牛血清(FBS)和1%雙抗(P/S)的DEME培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37 ℃、5% CO2和95% O2的孵箱中孵育。

1.2.2 CCK-8試劑盒檢測U87細胞的增殖：應(yīng)用CCK-8試劑盒，按照試劑盒操作步驟；MT用無菌的0.01%的PBS充分溶解，與0.4 μg/μl MT共同孵育24 h，分別測定在0.2～1.0 μg/μl濃度的MT作用下U87細胞的增殖程度。

1.2.3 Western blot檢測蛋白表達：設(shè)正常培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞為對照組，含0.4 μg/μl的MT的培養(yǎng)基處理U87細胞為實驗組；培養(yǎng)24 h后,用全蛋白提取試劑盒提取各組蛋白，用BCA法蛋白定量，取等量蛋白，10% SDS PAGE分離后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,用含5%脫脂牛奶TBST封閉膜2 h,一抗4 ℃孵育過夜，TBST充分洗滌膜后用二抗室溫孵育1 h，ECL試劑顯色成像。以GAPDH 作為內(nèi)參照。

1.2.4 免疫熒光染色技術(shù)檢測細胞數(shù)目：24孔板中加入細胞爬片，正常培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞設(shè)為對照組(Control)和含有0.4 μg/μl MT的培養(yǎng)基處理U87細胞為實驗組(MT)。24 h后用PBS清洗玻片，先用4%多聚甲醛常溫固定，然后用含有1% Triton X-100透化處理，用正常羊血清37 ℃封閉60 min。用一抗稀釋液(PBST稀釋)4 ℃孵育過夜，后用PBS清洗玻片，用耦聯(lián)有Alexa Fluor 594染料的二抗稀釋液(PBST稀釋)37 ℃孵育1 h，用PBS清洗玻片，最后用DAPI和Mount封片，共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8實驗結(jié)果：CCK-8試劑盒測試結(jié)果顯示，0.2 μg/μl的MT處理U87細胞24 h對細胞的增殖沒有影響，0.4～0.8 μg/μl的MT可以減少U87細胞的增殖，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1(目錄后)。

2.2 Western blot檢測蛋白表達結(jié)果：Western blot結(jié)果表明0.4 μg/μl MT作用24 h，與對照組比較，U87細胞中Caspase-3的表達量顯著增加，而且HSP60的表達量也明顯增加(均P<0.05)，說明MT促進了神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細胞的凋亡，并且此凋亡過程有HSP60的參與，見圖2(目錄后)。

2.3 免疫熒光染色檢測細胞數(shù)目結(jié)果：免疫熒光染色檢測顯示，0.4 μg/μl MT(24 h)顯著地抑制了U87細胞的生長，細胞數(shù)目明顯減少(P<0.05)(圖3，目錄后)，表明MT具有促進U87細胞凋亡的作用。

3 討論

U87細胞來源于星型細胞瘤，是神經(jīng)膠質(zhì)瘤的一種。神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見的惡性腫瘤，惡性程度高，易復(fù)發(fā)，預(yù)后差，死亡率高，目前也是神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的一大難題[4]。對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療以手術(shù)為主，但手術(shù)有風險，且不一定能完全避免腫瘤轉(zhuǎn)移，也不一定能徹底清除腫瘤細胞。因此，選擇天然活性藥物抑制腫瘤細胞生長、促進凋亡成為另一種選擇。

苦參堿在抗腫瘤方面具有良好的藥理活性。很多研究發(fā)現(xiàn)苦參堿對胃癌[5-6]、肝癌[7]、腎癌[8]、骨癌[9]等都有明顯的抑制作用，其機制可能通過細胞增殖調(diào)控、細胞周期、DNA損傷、癌基因修飾、蛋白質(zhì)修飾等，但是苦參堿對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用還少有報道，尤其是HSP60在其中的作用尚不明確。

正常生理狀態(tài)下，HSP60主要位于線粒體內(nèi)(有70%～80%)，小部分位于胞漿。心肌細胞中的研究顯示，當發(fā)生炎癥反應(yīng)時，HSP60高度表達并轉(zhuǎn)位到細胞膜上，甚至釋放至胞外。胞外的HSP60具有很強的免疫原性，可作為自身抗原與細胞膜上的Toll樣受體(TLR)-4結(jié)合，激活TLR-4信號通路從而引起機體自身免疫反應(yīng)，導致細胞凋亡[10-11]。我們以前的實驗在小膠質(zhì)細胞BV2中也證實了這一點[12]，HSP60廣泛存在于神經(jīng)膠質(zhì)細胞中，但是關(guān)于HSP60在神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87中的作用還未見研究。

本實驗中，假設(shè)MT是通過上調(diào)U87細胞中HSP60的表達而促進腫瘤細胞的凋亡，因此檢測了MT處理后細胞中HSP60表達水平及凋亡標志因子Caspase-3水平，研究結(jié)果證實了這一假設(shè)：CCK-8實驗證明U87細胞在0.4～1.0 μg/μl MT作用下細胞增殖受到抑制，同時MT處理后，DAPI染色顯示細胞核數(shù)目比對照組減少，說明U87細胞數(shù)目減少，MT對U87細胞的增殖有抑制作用；Western blot檢測蛋白表達結(jié)果顯示胞內(nèi)細胞凋亡因子Caspase-3的表達水平升高，說明MT具有促進U87細胞凋亡的作用；而且MT促進了胞內(nèi)HSP60的表達，說明HSP60可能在MT介導的促進U87細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，但是其具體機制還有待進一步研究證實。

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The anti-tumor effect of matrine on neuroglioma U87

LIFan1,2,LANGBing3，ZHANGNan1,2，MAJiao1,2，ZHANGRui1,2，DINGFeijia1,2，LIYunhong1,2，WANGYin1,2.

KeyLaboratoryofNingxia,NingxiaMedicalUniversity，Yinchuan750004，China

Correspondingauthor:WANGYin，Email：yin-wang@hotmail.com

Objective To investigate the effect of matrine on neuroglioma U87 cells.Methods U87 cells were cultured and the optimum drug concentration of MT was tested by CCK-8 cell activity experiment.The cells were divided into the control and experimental group in which were treated with MT.The expression of HSP60 and Caspase-3 were measured by western blot.The expression of HSP60 and the number of U87 cells were measured by immunofluorescence technique.Results Compared with the control group,the expression of HSP60 and Caspase-3was remarkably promoted by MT (0.4 ug/ul) treated,and decreased the number of U87 cells in experimental group (P<0.05).Conclusion MT may promote the apoptosis of U87 cells through upregulating the expression of HSP60.

Matrine;HSP60；euroglioma

10.13621/j.1001-5949.2017.01.0001

國家自然科學基金資助項目(81571098，31460257)

1.寧夏顱腦疾病重點實驗室，寧夏 銀川 750004 2.寧夏醫(yī)科大學，寧夏 銀川 750004 3.寧夏銀川市人民醫(yī)院重癥監(jiān)護室，寧夏 銀川 750001

李凡(1990-)，男，在讀碩士研究生，主要從事神經(jīng)生物學研究。

王銀，Email：yin-wang@hotmail.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20160615.1440.010.html

R285.5

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2016-02-22 [責任編輯]王凱榮