*0070；2.生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 0070；.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)豬研究所，江蘇 南京 210095；.淮安市淮陰種豬場，江蘇 淮安 2222）

RasGRP1基因多態(tài)與蘇淮豬體尺性狀關(guān)聯(lián)分析

吳 慧1，2，黃瑞華3，李平華3，周 煉1，2，傅道斌4，李 強(qiáng)4，李新云1，2*，趙書紅1，2
（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢
430070；2.生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430070；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)豬研究所，江蘇 南京 210095；4.淮安市淮陰種豬場，江蘇 淮安 223322）

欄目協(xié)辦

蘇淮豬是我國培育的一個(gè)優(yōu)良品種，具有肉質(zhì)好、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)良特性，但生長相對較慢，瘦肉率偏低，導(dǎo)致養(yǎng)殖效益偏低，改良其體型、生長等性能指標(biāo)對蘇淮豬的推廣具有重要意義。該實(shí)驗(yàn)中首先測量了354頭蘇淮母豬的部分體尺，對其體尺性狀進(jìn)行了表型相關(guān)分析。性狀相關(guān)分析結(jié)果表明蘇淮母豬體長與體高、胸圍、腹圍、管圍極顯著相關(guān)（P＜0.01）；體高與體長、胸圍、腹圍、腿臀圍極顯著相關(guān)（P＜0.01）；胸圍與體長、體高、腹圍、腿臀圍極顯著相關(guān)（P＜0.01）；腹圍與體長、體高、胸圍、腿臀圍極顯著相關(guān)（P＜0.01）；管圍與體長極顯著相關(guān)（P＜0.01）；腿臀圍與體高、胸圍、腹圍極顯著相關(guān)（P＜0.01）。利用網(wǎng)上已有的豬基因組測序數(shù)據(jù)，對RasGRP1基因進(jìn)行了選擇信號分析，結(jié)果表明RasGRP1基因在西方豬種中受到高強(qiáng)度選擇。通過對RasGRP1基因啟動(dòng)子區(qū)域G/A多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行PCR-RFLP分型，結(jié)果表明，在蘇淮母豬群體中存在多態(tài)，其中A等位基因頻率為0.672 3，為優(yōu)勢等位基因；關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示RasGRP1基因G/A多態(tài)與蘇淮母豬體高呈顯著關(guān)聯(lián)（P＜0.05），與管圍關(guān)聯(lián)接近顯著（P=0.054 8）。其中，AG型個(gè)體的體高及管圍性狀均值均高于GG型個(gè)體（P＜0.05），但AA和GG個(gè)體間差異不顯著（P＞0.05），這表明該位點(diǎn)對體尺性狀的效應(yīng)主要是由非加性效應(yīng)導(dǎo)致的。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為蘇淮母豬種質(zhì)特性研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

蘇淮豬；RasGRP1基因；SNP；體尺性狀；關(guān)聯(lián)分析

蘇淮豬的前身是新淮豬，是將新淮母豬與大白公豬雜交，在F2代中選擇黑豬組建零世代基礎(chǔ)群，然后經(jīng)7個(gè)世代選育而成的[1]。蘇淮豬具有耐粗飼、飼喂成本低、抗病能力強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點(diǎn)，被專家們稱為“中國的杜洛克”[2]，但蘇淮豬也有瘦肉率相對較低，生長速度相對緩慢的缺點(diǎn)。改良蘇淮豬的生長、胴體及體型性狀將有利于提升蘇淮豬的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，強(qiáng)化其品種特性。

選擇性清掃（selective sweep）是定位受選擇重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)基因的重要方法。在西方豬種培育過程中，其生長、體型、胴體等性狀受到長期人工定向選擇，通過選擇信號分析能鑒定出這些性狀主效基因。本實(shí)驗(yàn)中對西方商品豬進(jìn)行了選擇性清掃分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RasGRP1基因受到高強(qiáng)度選擇。RasGRP1為Ras的激活蛋白，屬于小G蛋白Ras鳥嘌呤核苷酸交換因子（gua nine nucleotide exchange factors，GEFs）家族中的一員，該家族包括RasGRP1到RasGRP4四個(gè)成員。RasGRP1主要表達(dá)于T細(xì)胞和胸腺細(xì)胞。Ras蛋白家族是多種細(xì)胞信號通路的開關(guān)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化等過程[3]。研究表明RasGRP1缺陷的小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的胸腺發(fā)育停滯[4]。已有研究表明RasGRP1主要在機(jī)體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，但該基因在其他組織器官中的作用研究的還較少。此外，已有部分研究表明免疫和生長存在互作[5-6]。目前，RasGRP1基因在豬生長及體尺性狀中的作用研究還未見報(bào)道。

本試驗(yàn)測量了354頭蘇淮母豬體尺數(shù)據(jù)，對體尺性狀間進(jìn)行了相關(guān)分析；同時(shí)在蘇淮母豬群體中，對RasGRP1基因啟動(dòng)子區(qū)域一個(gè)受選擇的多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行了基因型檢測及性狀關(guān)聯(lián)分析。本試驗(yàn)結(jié)果為蘇淮豬種質(zhì)特性研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集

本研究收集354頭蘇淮母豬體尺數(shù)據(jù)，采用基因組提取試劑盒（TIANGEN）提取DNA。該母豬群體擁有詳細(xì)的系譜資料，飼喂的營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)和環(huán)境條件一致。測定性狀包括體長、體高、胸圍、腹圍、管圍與腿臀圍。所有測量值均校正到220日齡。

1.2 選擇性清掃信號分析

利用29頭西方商品豬種和21頭中國地方豬的全基因組重測序數(shù)據(jù)進(jìn)行選擇性清掃分析[7-8]，具體算法參照已發(fā)表文獻(xiàn)中的方法[9]。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Ensemble中ID為ENSSSCG00000004791豬RasGRP1基 因 序列，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)引物如下，擴(kuò)增RasGRP1基因啟動(dòng)子區(qū)域371 bp片段。Primer-F： 5’-AAGATCACAGAATCCTTAGTCAAAT-3’；Primer-R：5’-G T T G C T T T G C T T T T CCCTTC-3’。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成備用。

1.4 PCR擴(kuò)增及PCR-RFLP方法進(jìn)行基因分型

PCR擴(kuò)增體系(10 μL)：DNA模板(50 ng/μL) 1 μL，PCR mix 5 μL，正反向引物各0.2 μL，加滅菌雙蒸水補(bǔ)足至10 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火溫度30 s，72 ℃延伸25 s，循環(huán)數(shù)35個(gè)，72 ℃終延伸5 min，15 ℃保存2 min后停止反應(yīng)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

性狀間相關(guān)分析使用SPSS 2.0軟件。使用T檢驗(yàn)對相關(guān)系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。性狀關(guān)聯(lián)分析使用SAS 9.2軟件，數(shù)學(xué)模型如下：

其中：Y為表型值；X為固定效應(yīng)關(guān)聯(lián)矩陣；β為固定效應(yīng)參數(shù)向量，包括基因型效應(yīng)、公畜效應(yīng)、公畜內(nèi)母畜效應(yīng)；e為隨機(jī)殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘇淮母豬體尺性狀測定及性狀間相關(guān)分析

對蘇淮母豬體尺性狀進(jìn)行了測定，測定結(jié)果均校正到220日齡，結(jié)果表明蘇淮母豬體長為（109.58±5.56）cm； 體 高 為（58.71±3.36）cm；胸 圍 為（102.85±8.00）cm； 腹圍 為（117.12±6.89）cm； 管 圍為（16.10±0.94）cm；腿 臀 圍 為（79.66±5.90）cm（表1）。相關(guān)分析結(jié)果表明蘇淮母豬體長與體高、胸圍、腹圍、管圍極顯著相關(guān)（P＜0.01）；體高與體長、胸圍、腹圍、腿臀圍極顯著相關(guān)（P＜0.01）；胸圍與體長、體高、腹圍、腿臀圍極顯著相關(guān)（P＜0.01）；腹圍與體長、體高、胸圍、腿臀圍極顯著相關(guān)（P＜0.01）；管圍與體長極顯著相關(guān)（P＜0.01）；腿臀圍與體高、胸圍、腹圍極顯著相關(guān)（P＜0.01）（表2）。

圖1 RasGRP1基因選擇信號分析（星號下為rs330828410SNP位點(diǎn)）

表1 蘇淮母豬體尺性狀均值

表2 蘇淮母豬體尺性狀相關(guān)分析

2.2 選擇信號分析與PCR-RFLP結(jié)果

西方豬種選擇信號分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RasGRP1基因區(qū)域在中外豬種中的分化程度（0.55）高于全基因組顯著水平（0.2）。其中1號染色體148 271 478處（Ensemble Variant ID rs330828410）存在一個(gè)A＞G（星號標(biāo)識）多態(tài)（圖1a，b），這個(gè)多態(tài)位點(diǎn)位于RasGRP1基因啟動(dòng)子區(qū)域，造成一個(gè)PsiI酶切位點(diǎn)。RasGRP1基因酶切后存在3種基因型（圖2）。

圖2 RasGRP1基因SNP位點(diǎn)PsiI酶切判型結(jié)果

2.3 RasGRP1 A＞G SNP位點(diǎn)與蘇淮母豬體尺性狀關(guān)聯(lián)分析

對354頭蘇淮母豬進(jìn)行了基因型分析，其中AA型168頭，AG型140頭，GG型46頭。A基因頻率為0.672 3，為優(yōu)勢等位基因。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，該位點(diǎn)與蘇淮豬體高呈顯著關(guān)聯(lián)（P＜0.05），與管圍關(guān)聯(lián)接近顯著（P=0.054 8），其中，AG型個(gè)體的體高及管圍性狀均值均顯著高于GG型個(gè)體（P＜0.05），但AA和GG個(gè)體間差異不顯著（P＞0.05）。該位點(diǎn)與其他體尺性狀關(guān)聯(lián)不顯著（表3）。

3 討論

本研究測定了蘇淮母豬的體尺性狀，并分析了各個(gè)體尺性狀間的相關(guān)。根據(jù)本研究結(jié)果，大部分體尺性狀存在表型相關(guān)，這也是合乎邏輯的，體尺性狀主要取決于骨骼生長，而全身的骨骼是一個(gè)整體，因此會(huì)存在相關(guān)。根據(jù)本文的研究，我們認(rèn)為如果需要改良蘇淮豬的體型，可以主選1～2個(gè)體尺性狀即可達(dá)到目的。

表3 RasGRP1基因G/A SNP位點(diǎn)與蘇淮母豬體尺性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

選擇性清掃分析是鑒定養(yǎng)殖動(dòng)物重要經(jīng)濟(jì)性狀主效基因的主要方法，目前已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道運(yùn)用此方法鑒定了動(dòng)物經(jīng)濟(jì)性狀主效基因[10-12]。眾所周知，西方豬種在培育的過程中，其生長、體型及胴體等性狀受到長期定向人工選擇，導(dǎo)致西方豬種和中國地方品種在體型、生長方面存在很大差異，因此，通過選擇信號分析有利于發(fā)現(xiàn)與上述性狀的重要候選基因。本研究中，利用全基因組選擇性清掃分析發(fā)現(xiàn)RasGRP1基因在西方豬種中受到高強(qiáng)度選擇，最終選擇了啟動(dòng)子區(qū)域的一個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)研究，該SNP位于轉(zhuǎn)錄因子NR3C1的核心motif（TGTACAGATTGTAAA）中，該SNP可能影響NR3C1轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，很可能是該選擇信號區(qū)域的致因突變，故我們選擇了這個(gè)SNP進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析研究。

基因頻率分析結(jié)果表明RasGRP1基因的A等位基因是優(yōu)勢等位基因。根據(jù)全基因組選擇分析可以發(fā)現(xiàn)A等位基因主要是存在西方豬種中，而蘇淮豬中含有75%的大白豬血液，推測這是導(dǎo)致A等位基因?yàn)閮?yōu)勢等位基因的主要原因。性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，RasGRP1基因多態(tài)與蘇淮母豬體高顯著關(guān)聯(lián)，與管圍關(guān)聯(lián)接近顯著。這表明RasGRP1基因能夠影響蘇淮母豬的體尺性狀。目前的研究表明RasGRP1基因主要在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用[13]，而許多研究表明生長與免疫存在互作。Williams等人發(fā)現(xiàn)減少豬只與病原接觸，抑制免疫系統(tǒng)激活，能夠促進(jìn)機(jī)體生長、提高飼料利用效率[5]。因此，我們推測RasGRP1基因可能會(huì)通過機(jī)體免疫系統(tǒng)間接影響體尺性狀。另外，我們發(fā)現(xiàn)RasGRP1基因兩種純合子間體高和管圍性狀差異均不顯著，而雜合子均值大于兩純合子。這表明該基因的效應(yīng)主要是由非加性效應(yīng)導(dǎo)致的，非加性效應(yīng)是形成雜種優(yōu)勢的一個(gè)重要原因，因此該基因的雜合子高于兩純合子可能是由于非加性效應(yīng)導(dǎo)致的雜種優(yōu)勢。非加性效應(yīng)形成的機(jī)理非常復(fù)雜，需要進(jìn)一步研究。盡管非加性效應(yīng)在目前的育種中很難利用，但是非加性效應(yīng)是遺傳方差的重要組成部分，也是導(dǎo)致群體遺傳變異的重要因素，因此，也是需要深入研究的。另外，根據(jù)雜種優(yōu)勢，也可以安排合理的雜交生產(chǎn)，提高生產(chǎn)效益。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)測量了354頭蘇淮母豬體尺數(shù)據(jù)，對體尺表型進(jìn)行了性狀間相關(guān)分析，并在蘇淮母豬群體中進(jìn)行了性狀關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)RasGRP1基因能夠影響蘇淮母豬體尺性狀，并鑒定了一個(gè)關(guān)鍵的多態(tài)位點(diǎn)。

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2016-12-05）

國家自然科學(xué)基金（31372291）

吳慧，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士研究生，主要從事動(dòng)物分子育種方向的研究，E-mail：wuhuixqh@163.com

李新云，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樨i骨骼肌生長發(fā)育的分子機(jī)理，E-mail：hzaulxy@163.com