*（.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部豬遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 40070；.湖北省畜禽育種中心，湖北 武漢 4007；.浙江天蓬集團(tuán)有限公司，浙江 江山 4）

美系大白豬LEF-1基因多態(tài)性與乳頭數(shù)及生長性狀的相關(guān)性研究

胡閃耀1，楊 華2，姜佳佳3，毛 翠3，毛慧敏3，王利通3，王國水3，左 波1*
（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部豬遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070；2.湖北省畜禽育種中心，湖北 武漢 430072；3.浙江天蓬集團(tuán)有限公司，浙江 江山 324111）

乳頭數(shù)是衡量母豬整體繁殖性能的重要指標(biāo)之一，增加母豬有效乳頭數(shù)對于提高仔豬哺乳成活率具有重要意義。該試驗(yàn)采用PCR-RFLP技術(shù)，在美系大白（633頭）群體中，對LEF-1基因的多態(tài)性進(jìn)行檢測和遺傳效應(yīng)分析。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在美系大白豬中檢測到LEF-1基因三種基因型（AA、AG和GG基因型）的存在，但不同基因型個(gè)體之間乳頭數(shù)無顯著差異。

豬；LEF-1；SNP；關(guān)聯(lián)分析

1 前言

淋巴增強(qiáng)結(jié)合因子1（LEF-1）屬于調(diào)節(jié)蛋白家族的一員，是最早被發(fā)現(xiàn)參與乳腺形成的調(diào)節(jié)因子之一。LEF-1是經(jīng)典Wnt信號通路中的調(diào)節(jié)因子之一，該信號通路在胚胎發(fā)育過程中，可以調(diào)節(jié)早期的乳腺形態(tài)發(fā)生變化[1-2]。因此，S.Tetzlaff等將LEF-1作為影響豬乳頭數(shù)的候選基因，并在其3’端UTR發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)SNPs（EU719607：g.1351T＞C，g.1666A＞C）與豬乳頭數(shù)顯著相關(guān)[3]；Xu RX等以3個(gè)中國地方豬種和大白豬為材料，對LEF-1基因進(jìn)行重測序，分別在第4外顯子和第9內(nèi)含子上檢測到兩個(gè)新的突變位 點(diǎn)（NC_010450.3：g.99514A＞G，119846C＞T）。關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)突變位點(diǎn)均可以顯著影響豬乳頭數(shù)[4]。這些研究結(jié)果表明，LEF-1基因可作為影響豬乳頭數(shù)的候選基因進(jìn)行深入的研究。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

美系大白豬633頭（源自浙江開盛生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司）?；蚪MDNA采用血液基因組DNA中量提取試劑盒（離心柱型）提取，于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

2.2 基因型檢測

本實(shí)驗(yàn)主要利用PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行基因分型，本研究所用引物根據(jù)Xu RX（2014）發(fā)表的引物序列合成引物：（F）5′--TGATTCTTGTTACTGCTGATGC--3′，（R）5′-- ACCACCCACCCAATGACA--3′。PCR反應(yīng)體系為20 μL包含以下成分：Sense primer（10 μM），0.5 μL；Antisense primer（10 μM），0.5 μL；ddH2O，8.0 μL；DNA，1.0 μL；2×Es Taq MasterMix（ 含染 料 ），10.0 μL。 反 應(yīng) 程 序 為：94 ℃，4 min；34個(gè) 循 環(huán)（94 ℃，30 s-Tm，40 s-72 ℃，根據(jù)片段長度有所不同，1 000 bp按30 s設(shè)計(jì)）；72 ℃，5 min；25 ℃，1 min。PCR產(chǎn)物利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

酶切反應(yīng)體系為20 μL，其中 PCR production，10.0 μL；FastDigest EcoRII，1.0 μL；10×FastDigest Green Buffer，2.0 μL； ddH2O，7.0 μL。37 ℃消化30 min，然后利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照保存圖片，統(tǒng)計(jì)基因型。

2.3 基因效應(yīng)分析

本實(shí)驗(yàn)所采用模型為：Tijkl=μ+Gi+Fj+Sk+Pl+eijklm，Tijkl為 性狀表型值，μ為平均值，Gi為基因型效應(yīng)（包括基因加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)）；Fj、Sk、Pl為固定效應(yīng)，分別為家系、性別、批次，eijklm為殘差效應(yīng)。采用SAS軟件GLM模型自編程序完成，同時(shí)采用reg程序計(jì)算基因加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 LEF-1基因的PCR-EcoRIIRFLP多態(tài)性檢測

LEF-1基因酶切分型的PCR產(chǎn)物長為344 bp，見圖1，利用EcoRII內(nèi)切酶酶切后分別產(chǎn)生189 bp和155 bp的片段，根據(jù)酶切后產(chǎn)生的條帶類型將三種基因型分別命名為：AA型（189 bp+155 bp），AG型（344 bp+189 bp+155 bp），GG型（344 bp）。1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。

3.2 LEF-1基因在大白豬中的基因頻率分布及與乳頭數(shù)和生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

3.2.1 LEF-1基因在大白豬群體中的基因頻率

圖1 LEF-1基因PCR電泳結(jié)果

圖2 LEF-1基因PCR-EcoRII-RFLP酶切分型結(jié)果

表1 大白豬LEF-1基因EcoRII-RFLP基因型頻率和等位基因頻率

表2 LEF-1基因EcoRII多態(tài)性與美系大白豬乳頭數(shù)和生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

利用PCR-EcoRII-RFLP技術(shù)對LEF-1基因多態(tài)性進(jìn)行檢測，在美系大白豬中檢測到三種基因型，對各基因型頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表1所示。

由表1可以看出，在美系大白豬群體中LEF-1基因的AA基因型頻率高于AG和GG基因型，A等位基因?qū)儆趦?yōu)勢等位基因。另外，該基因在美系大白豬中不符合哈迪-溫伯格平衡（P＜0.05）。

3.2.2 LEF-1基因多態(tài)性與美系大白豬乳頭數(shù)及生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

分別對LEF-1基因?qū)γ老荡蟀棕i乳頭數(shù)及生長性狀的遺傳效應(yīng)進(jìn)行分析，分析結(jié)果見表2。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，在美系大白豬群體中LEF-1基因?qū)θ轭^數(shù)、初生重、體長等性狀都沒有顯著影響。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)對LEF-1基因的SNP（g.99514A＞G）位點(diǎn)在美系大白豬中的多態(tài)性進(jìn)行了檢測。在美系大白豬中AA、AG和GG三種基因型均有分布，其中A等位基因頻率為0.805，屬于優(yōu)勢等位基因，這與Xu RX等人的研究結(jié)果一致[4]。關(guān)聯(lián)分析研究結(jié)果顯示，在美系大白群體中AA基因型個(gè)體的乳頭數(shù)略高于AG型和GG型個(gè)體，但沒有達(dá)到顯著水平，這與Xu RX等人的研究結(jié)果并不一致[4]，說明LEF-1基因的g.99514A＞G突變位點(diǎn)對美系大白豬的乳頭數(shù)變異沒有影響。由此推測該突變位點(diǎn)可能只是一個(gè)連鎖性的標(biāo)記，并不是引起豬乳頭數(shù)變化的因果突變位點(diǎn)，在不同的群體中對乳頭數(shù)的遺傳效應(yīng)也不一致。因此，LEF-1基因作為一個(gè)影響豬乳頭數(shù)的候選基因，還需要對其進(jìn)行進(jìn)一步的研究，檢測是否存在功能性的突變位點(diǎn)，并在不同群體中擴(kuò)大樣本進(jìn)行分析驗(yàn)證。

[1] VAN GENDEREN C，OKAMURA R M，F(xiàn)ARINAS I，et al.Development of several organs that require inductive epithelial-mesenchymal interactions is impaired in LEF-1-deficient mice[J].Genes & development，1994，8(22)：2691-2703.

[2] BORAS-GRANIC K，CHANG H，-GROSSCHEDL R，et al.Lef1 is required for the transition of Wnt signaling from mesenchymal to epithelial cells in the mouse embryonic mammary gland[J].Developmental biology，2006，295(1)：219-231.

[3] TETZLAFF S，JONAS E，PHATSARA C，et al.Evidence for association of lymphoid enhancer-binding factor-1(LEF1) with the number of functional and inverted teats in pigs[J].Cytogenetic and genome research，2009，124(2)：139-146.

[4] XU R X，WEI N，WANG Y，et al.Association of Novel Polymorphisms in Lymphoid Enhancer Binding Factor1(LEF-1) Gene with Number of Teats in Different Breeds of Pig[J].Asian-Australasian journal of animal sciences，2014，27(9)：1254.

2016-12-20）

本項(xiàng)目受國家科技支撐計(jì)劃（項(xiàng)目編號：2014BAD20B01）、浙江省重大科技專項(xiàng)（項(xiàng)目編號：2014C02010）、中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（項(xiàng)目編號：2014PY038；2662016PY012）資助

胡閃耀（1988-），男，河南平頂山人，碩士，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖方面研究，E-mail：shy907530102@qq.com

左波，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，動(dòng)科動(dòng)醫(yī)學(xué)院教授，E-mail：zuobo@mail.hzau.edu.cn