豬O型口蹄疫抗體水平檢測(cè)與分析

劉 鴿，于會(huì)舉，張培生，張 倩，宋 敏，楊慧敏，吳圓圓，屈勇剛*
(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003)

為了解北疆地區(qū)口蹄疫（FMD)的免疫抗體水平，本試驗(yàn)選擇克拉瑪依、沙灣、石河子、瑪納斯、奇臺(tái)5個(gè)不同區(qū)域的19個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)進(jìn)行豬O型口蹄疫ELISA抗體水平檢測(cè)并做出初步分析。980份試驗(yàn)血清中檢出851份陽性血清，陽性率為86.84%（851/980）；5個(gè)不同區(qū)域的19個(gè)豬場(chǎng)的豬O型口蹄疫抗體陽性率，克拉瑪依85.13%、沙灣85.43%、石河子89.39%、瑪納斯85.63%、奇臺(tái)79.19%；19個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)的豬O型口蹄疫抗體水平在70%（國(guó)家規(guī)定水平）以上者達(dá)100%，且19個(gè)豬場(chǎng)中豬O型口蹄疫抗體陽性率在90.00%及以上者有6個(gè)，占31.58%（6/19）；抗體陽性率在80.00%及以上者有16個(gè)，占84.21%（16/19）；只有3個(gè)豬場(chǎng)的豬O型口蹄疫抗體陽性率低于80.00%。此試驗(yàn)結(jié)果說明北疆地區(qū)豬O型口蹄疫抗體水平相對(duì)較高；豬群不同構(gòu)成成分豬O型口蹄疫抗體水平存在一定差異，3個(gè)階段的仔豬的豬O型口蹄疫抗體陽性率隨日齡增大而下降。希望本試驗(yàn)結(jié)果在一定程度上可為北疆地區(qū)口蹄疫防疫工作提供一定的參考。

口蹄疫；ELISA；抗體水平；陽性率

口蹄疫（food and mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒引起的一種急性、熱性和高度接觸性的偶蹄動(dòng)物傳染病[1-5]，被國(guó)際獸醫(yī)局（OIE)列為必須上報(bào)的動(dòng)物疫病，被我國(guó)列為一類動(dòng)物傳染病[6-8]。FMD屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，包括7個(gè)血清型（A、O、C、SATI、 SATⅡ、SATⅢ和亞洲I型，其中O型口蹄疫是世界上流行最廣的一種血清型）和80多個(gè)血清亞型，并且各血清型之間無交叉免疫現(xiàn)象[9]。1514年，F(xiàn)MD被首次報(bào)道，現(xiàn)已在全球蔓延，并嚴(yán)重威脅畜牧業(yè)的健康發(fā)展，給畜牧業(yè)造成巨大損失[10-13]。在應(yīng)對(duì)FMD方面，我國(guó)采取疫苗免疫接種和撲殺的綜合防治措施，效果明顯[14-16]。近些年，我國(guó)強(qiáng)制免疫中廣泛使用豬口蹄疫O型滅活疫苗和豬口蹄疫O型合成肽疫苗。

2015年下半年至今，豬肉價(jià)格較高，激發(fā)了養(yǎng)豬單位中畜牧工作者的工作積極性，極大地促進(jìn)了養(yǎng)豬事業(yè)的發(fā)展。為了解2014年1月—2016年9月北疆地區(qū)口蹄疫（FMD)的免疫抗體水平，本試驗(yàn)選擇克拉瑪依、沙灣、石河子、瑪納斯、奇臺(tái)5個(gè)不同區(qū)域的19個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)進(jìn)行豬O型口蹄疫ELISA抗體水平檢測(cè)并做出初步分析，在一定程度上可為北疆地區(qū)口蹄疫防疫工作提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源

2014年1月至2016年9月采自新疆北疆地區(qū)的克拉瑪依、沙灣、石河子、瑪納斯、奇臺(tái)5個(gè)不同區(qū)域的19個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)不同類型豬群（0～10 d、11～ 20 d、21～30 d仔豬，后備母豬，經(jīng)產(chǎn)母豬，種公豬），共采集血樣980份。

1.1.2 材料和儀器

豬O型口蹄疫病毒 ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒（武漢科前生物）、自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó) Bio Tek 儀器有限公司）、一次性5 mL獸用采血器、微量移液器（Eppendorf公司）、若干個(gè)移液槍頭（已高壓滅菌）、恒溫培養(yǎng)箱（光明醫(yī)療儀器廠）、平板震蕩儀等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 采集樣品

在采樣過程中要保證規(guī)范性操作，如此才可保證后續(xù)工作的順利開展。對(duì)已選定的豬群一次性從前腔靜脈（左右各有一條，可根據(jù)操作者的優(yōu)勢(shì)手的習(xí)慣決定從哪側(cè)采血）或耳靜脈采集血液3～5 mL/頭，室溫靜置 30 min左右，待血清析出后，收于采樣箱中（里面放有冰袋）帶回實(shí)驗(yàn)室，每份吸取 1 mL血清于滅菌的1.5 mL EP管中，逐管標(biāo)記，4 000 r/min ，離心10 min，可立即進(jìn)行ELISA檢測(cè)，亦可放-20 ℃保存?zhèn)溆?，在時(shí)間允許的條件下進(jìn)行檢測(cè)，但不能放置過長(zhǎng)時(shí)間。

1.2.2 間接 ELISA 檢測(cè)方法

按照試劑盒使用說明書的步驟測(cè)樣品 OD630nm值。首先，將濃縮的洗滌液恢復(fù)到室溫（25 ℃），然后按照 1∶20稀釋濃縮的洗滌液，最好是當(dāng)天用當(dāng)天配（2～8 ℃，可存放一周時(shí)間）。試驗(yàn)中，在豬O型口蹄疫抗原包被微孔板加入經(jīng) 1∶4倍稀釋的對(duì)照血清和1∶32待檢血清，在37 ℃恒溫箱中溫浴30 min，待抗原抗體結(jié)合后，洗滌后加羊抗豬酶標(biāo)二抗，再次在37 ℃恒溫箱中溫浴30 min，洗滌后加底物A、B，混勻后在室溫下避光顯色 10 min，加終止液終止反應(yīng)，在10 min內(nèi)，用酶標(biāo)儀630 nm 波長(zhǎng)測(cè)定各反應(yīng)孔中的OD630nm值，據(jù)OD630nm值對(duì)抗體水平進(jìn)行判定。

1.2.3 結(jié)果判定

在酶標(biāo)儀上測(cè)各孔OD630nm值。試驗(yàn)成立的條件是陽性對(duì)照孔平均OD630nm值 ≥ 0.8，陰性對(duì)照孔平均OD630nm值必須＜0.3。

樣品OD630nm值 ≥ 0.4，判為陽性；樣品OD630nm值＜0.4，判為陰性。

根據(jù)試劑盒說明書，按表1進(jìn)行OD630nm值與間接血凝試驗(yàn)（IHA)的轉(zhuǎn)換。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 軟件、Excel 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，OD630nm值結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同地區(qū)不同豬場(chǎng)的豬瘟抗體陽性率及抗體水平

豬場(chǎng)A～E在克拉瑪依區(qū)域，F(xiàn)～I(xiàn)在沙灣區(qū)域，J～M在石河子區(qū)域，N～Q在瑪納斯區(qū)域，R～S在克拉瑪依區(qū)域。980份試驗(yàn)血清中檢出851份陽性血清，陽性率為86.84%（851/980），A～S豬場(chǎng)的豬O型口蹄疫抗體陽性率依次為90.00%、85.71%、92.25%、75.00%、82.67%、83.33%、76.79%、93.02%、88.57%、91.11%、87.50%、94.74%、84.21%、86.96%、90.48%、82.93%、88.14%、80.00%、78.38%。其中，抗體陽性率在90.00%及以上者有6個(gè)，抗體陽性率在80.00%及以上者有16個(gè)，只有3個(gè)豬場(chǎng)的豬O型口蹄疫抗體陽性率低于80.00%，分別為75.00%、76.79%、78.38%，均高于70%（國(guó)家規(guī)定水平）。結(jié)果見表2。

2.2 北疆5個(gè)不同區(qū)域豬O型口蹄疫抗體分析結(jié)果

5個(gè)不同區(qū)域的19個(gè)豬場(chǎng)的豬O型口蹄疫抗體陽性率：克拉瑪依85.13%、沙灣85.43%、石河子89.39%、瑪納斯85.63%、奇臺(tái)79.19%；不難發(fā)現(xiàn)，石河子的抗體陽性率最高，為89.39%；奇臺(tái)的抗體陽性率最低，為79.19%；克拉瑪依、沙灣、瑪納斯的抗體陽性率相當(dāng)。19個(gè)試驗(yàn)豬場(chǎng)的豬O型口蹄疫抗體檢測(cè)平均OD630nm值：克拉瑪依1.451，沙灣1.542石河子1.395，瑪納斯1.328，奇臺(tái)1.096。對(duì)19個(gè)豬場(chǎng)的采樣血清進(jìn)行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，間接血凝試驗(yàn)（IHA)均大于等于1∶1024。結(jié)果見表3。

2.3 19個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)豬群不同構(gòu)成成分的豬O型抗體水平

分析19個(gè)試驗(yàn)豬場(chǎng)的豬O型抗體水平，0～10 d仔豬、11～20 d仔豬、21～30 d仔豬、后備母豬、經(jīng)產(chǎn)母豬、種公豬的豬瘟抗體陽性率分別為 95.79%、91.58%、89.47%、75%、86.34%、98.82%。結(jié)果見表4。

表1 表1 豬O型口蹄疫抗體 ELISA 檢測(cè)OD630nm值與間接血凝試驗(yàn)效價(jià)的轉(zhuǎn)換

表2 北疆地區(qū)5個(gè)不同區(qū)域的19個(gè)豬場(chǎng)豬O型口蹄疫抗體檢測(cè)結(jié)果

表3 北疆5個(gè)不同區(qū)域豬O型口蹄疫抗體分析結(jié)果

表4 19個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)不同構(gòu)成成分豬群豬O型口蹄疫抗體水平

3 討論

3.1 北疆地區(qū)豬O型口蹄疫抗體水平相對(duì)較高

分析試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，980份試驗(yàn)血清中檢出851份陽性血清，陽性率為86.84%（851/980）；北疆地區(qū)的克拉瑪依、沙灣、石河子、瑪納斯、奇臺(tái)5個(gè)不同區(qū)域的19個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)的豬O型口蹄疫抗體水平在70%（國(guó)家規(guī)定水平）以上者達(dá)100%，且19個(gè)豬場(chǎng)中豬O型口蹄疫抗體陽性率在90.00%及以上者有6個(gè)，占31.58%（6/19）；抗體陽性率在80.00%及以上者有16個(gè)，占84.21%（16/19）；只有3個(gè)豬場(chǎng)的豬O型口蹄疫抗體陽性率低于80.00%。此試驗(yàn)結(jié)果說明北疆地區(qū)豬O型口蹄疫抗體水平相對(duì)較高，對(duì)于那些豬O型口蹄疫抗體水平較低的豬場(chǎng)來說，應(yīng)引起豬場(chǎng)工作人員的高度重視，從疫苗質(zhì)量、免疫操作、豬群狀況等幾個(gè)方面入手，找到真正的原因并盡快解決，保障豬群健康，以求養(yǎng)豬事業(yè)更好更快發(fā)展，為國(guó)民提供健康放心豬肉。

3.2 豬群不同構(gòu)成成分豬O型口蹄疫抗體水平存在一定差異

分析0～10 d仔豬、11～20 d仔豬、21～30 d仔豬、后備母豬、經(jīng)產(chǎn)母豬和種公豬的豬O型口蹄疫抗體水平發(fā)現(xiàn)，種公豬的抗體陽性率最高，為98.82%，免疫水平較高；后備母豬的抗體陽性率最低，為75%，有待提高；0～10d仔豬、11～20 d仔豬、21～30 d仔豬的抗體陽性率依次為95.79%、91.58%、89.47%，都是較高的免疫水平，3個(gè)階段仔豬的豬O型口蹄疫抗體陽性率隨日齡增大而下降，其中仔豬出生10 d后抗體水平有下降增快的趨勢(shì)，這可能與母源抗體有一定的關(guān)系，提示在仔豬出生后應(yīng)在適宜的時(shí)間及時(shí)做好免疫接種工作，并保證飼養(yǎng)環(huán)境良好，采取適當(dāng)?shù)木C合措施以促進(jìn)仔豬的健康生長(zhǎng)，為仔豬群的后續(xù)發(fā)展打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

3.3 加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，有效預(yù)防疾病

加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，是一項(xiàng)非常重要的措施，只有好的管理，才能有效保障豬群健康。鑒于豬口蹄疫的巨大危害，采取及時(shí)有效的免疫接種是行之有效的措施，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間應(yīng)進(jìn)行豬O型口蹄疫的免疫接種。對(duì)種公豬和繁殖母豬進(jìn)行豬O型口蹄疫的全免，還要根據(jù)各自豬場(chǎng)的實(shí)際情況對(duì)免疫程序進(jìn)行調(diào)整。在豬場(chǎng)的日常工作中，應(yīng)將豬群免疫接種工作放到非常重要的位置，并采取嚴(yán)格的制度規(guī)范。

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2016-10-12）

新疆石河子市農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：2013NY04）

作者 ：劉鴿（1986-），男，山東省淄博人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病診斷與防治工作

*通訊作者 ：屈勇剛（1971-），男，陜西省渭南人，副教授，主要從事動(dòng)物傳染病診斷與防治工作