楊朝暉 章輝 顧華敏 范廣民 曹學全 王四玲 盧洪勝

宮頸癌組織中miR-21和Stat3的表達及相關(guān)性研究

楊朝暉 章輝 顧華敏 范廣民 曹學全 王四玲 盧洪勝

目的 探討微小RNA-21（miR-21）和信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄活化因子-3（Stat3）在宮頸癌中的表達情況及臨床意義。方法采用實時熒光定量PCR檢測48例宮頸癌及20例正常宮頸組織中miR-21和Stat3 mRNA的表達，免疫組化Envision法檢測宮頸癌及正常宮頸組織中Stat3蛋白表達，分析miR-21和Stat3表達的相關(guān)性及其與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果miR-21和Stat3 mRNA在宮頸癌組織中的表達均顯著高于正常宮頸組織（均P＜0.05），且miR-21和Stat3 mRNA的高表達呈正相關(guān)（r=0.631，P＜0.05）。Stat3蛋白在癌組織中的表達陽性率為79.17%（38/48）。Stat3的高表達和腫瘤低分化及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（均P＜0.05）。結(jié)論miR-21在宮頸癌中的表達升高，可能和宮頸癌的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。

宮頸癌 微小RNA 微小RNA-21 Stat3

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于乳腺癌，并且呈持續(xù)上升，嚴重威脅著女性的健康。近年來，隨著對微小RNA的基礎(chǔ)研究越來越多，微小RNA在宮頸癌致癌機制中的作用研究取得了積極進展。微小RNA-21（miR-21）在多種腫瘤中表達上調(diào)，但其作用機制和靶基因尚未完全明確。Cao等[1]報道微小RNA可以通過多種途徑調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄活化因子-3（signal transducers and activators of transcription 3，Stat3）的活性，從而誘導腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，但miR-21和Stat3在宮頸癌中的作用機制和相關(guān)性未見報道。本研究采用實時熒光定量PCR檢測48例宮頸癌組織中miR-21和Stat3的表達，免疫組化檢測Stat3蛋白的表達，分析它們之間的相關(guān)性及其與患者臨床病理特征的關(guān)系，為宮頸癌的分子診斷、評估預后及復發(fā)轉(zhuǎn)移提供新的理論依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2008年6月至2013年12月臺州市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科行手術(shù)治療的宮頸癌患者48例，術(shù)前未行放、化療及內(nèi)分泌治療，年齡28～73歲，平均（48.0± 10.975）歲。組織病理類型的判斷標準參照2003版WHO宮頸腫瘤的病理學分類。同時選取20例同期因子宮肌瘤行子宮全切術(shù)患者的宮頸組織，均經(jīng)病理檢查證實為正常，患者年齡32～61歲，平均（44.5±6.653）歲。

1.2 主要試劑 Trizol試劑購自美國lnvitrogen公司，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、oligo dT、dNTPs等購自Takara公司，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，鼠抗人Stat3單克隆抗體及免疫組化試劑盒（PV-9000）購自北京中杉生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量PCR檢測miR-21和Stat3 mRNA表達 取宮頸癌組織及正常宮頸組織標本，按Trizol試劑說明書提取總RNA，DEPC處理過的蒸餾水溶解。分別取宮頸癌組織及正常宮頸組織總RNA各1μg，miR-21莖環(huán)RT-PCR引物參考文獻[2]，莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物序列為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGT TGAGTCAACATC-3′。逆轉(zhuǎn)錄反應條件為16℃30min，42℃30min，75℃15min。PCR擴增miR-21上游引物為5′-ACACTCCAGCTGGGTAGCTT ATCAGACTGATG-3′，下游為5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′，PCR產(chǎn)物大小67bp。PCR反應條件：95℃10min變性；95℃15s，60℃1min，40個循環(huán)。所有反應均設立3個復孔。記錄每個反應管中的熒光信號到達所設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct值，以U6作為內(nèi)參照，采用相對定量法，以2-ΔΔCt表示腫瘤組織目的基因表達相對于配對的正常組織的變化倍數(shù)，其中ΔΔCt=（CtmiR-21-CtU6）腫瘤-（CtmiR-21-CtU6）正常。Stat3上游引物5′-AAG AGGCGGCAACAGATT-3′，下游引物5′-CGGTCTTGA-TGCCGAGGG-3′，反應條件及計算方法同上述。

1.3.2 免疫組化檢測Stat3蛋白的表達 采用Envision法檢測宮頸癌組織及正常宮頸組織中Stat3蛋白的表達，具體操作嚴格按照產(chǎn)品說明書進行。鼠抗人Stat3單克隆抗體工作濃度1∶100，抗原枸櫞酸鹽熱修復。以PBS代替一抗作陰性對照。Stat3表達以細胞質(zhì)中呈不同染色程度的棕黃色顆粒為陽性，少數(shù)位于細胞核。觀察5個以上高倍視野（×400），計數(shù)不少于1 000個細胞中的陽性細胞數(shù)，陽性細胞數(shù)＜10%為陰性，≥10%為陽性。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗及方差分析，計數(shù)資料組間比較用χ2檢驗或秩和檢驗分析，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織中miR-21和Stat3 mRNA表達

2.1.1 宮頸癌組織與正常宮頸組織中miR-21和Stat3 mRNA表達的比較 宮頸癌組織中miR-21的mRNA相對表達量為1.0546±0.3325，正常宮頸組織中為0.4510± 0.2341；宮頸癌組織中Stat3的mRNA相對表達量為0.5256±0.1034，正常宮頸組織中為0.2048±0.0508，宮頸癌組織中兩者表達均高于正常宮頸組織，均有統(tǒng)計學差異（均P＜0.05）。miR-21、Stat3以及內(nèi)參U6的實時熒光定量PCR的擴增曲線和熔解曲線見圖1-2。

圖1 實時熒光定量PCR的擴增曲線（a：miR-21；b：Stat3；c：U6）

2.1.2 宮頸癌組織中miR-21和Stat3 mRNA的表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 miR-21 mRNA的表達量與患者年齡、腫瘤大小、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及FIGO分期均無關(guān)（均P＞0.05）。Stat3 mRNA的表達量與宮頸癌分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均相關(guān)（均P＜0.01），與患者年齡、腫瘤大小及FIGO分期均無關(guān)（均P＞0.05），見表1。

2.1.3 宮頸癌組織中miR-21和Stat3 mRNA表達的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中miR-

21和Stat3 mRNA的表達呈正相關(guān)（r=0.631，P＜0.05）。

2.2 宮頸癌組織及正常宮頸組織中Stat3蛋白表達的比較 Stat3蛋白染色后出現(xiàn)棕黃色顆粒，主要集中在細胞質(zhì)，部分在細胞核中。宮頸癌組織中Stat3蛋白表達呈強陽性（38/48，79.17%），正常宮頸組織中Stat3蛋白低表達或無表達（6/20，30.00%），兩者間比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。隨著腫瘤分化程度減低，Stat3蛋白表達陽性率逐漸遞增，Stat3蛋白的表達還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（均P＜0.05），見圖3-4和表2。

圖2 實時熒光定量PCR的熔解曲線（a：miR-21；b：Stat3；c：U6）

表1 宮頸癌組織中miR-21和Stat3 mRNA的表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

圖3 Stat3在宮頸中分化鱗狀細胞癌中的陽性表達（Envision染色，×200）

圖4 Stat3在宮頸低分化鱗狀細胞癌中的陽性表達（Envision染色，×200）

表2 宮頸癌組織中Stat3蛋白表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)了一類內(nèi)源性短鏈RNA，即miRNA，長度約為22nt，不編碼蛋白質(zhì)，但能夠通過和靶基因mRNA部分或完全互補結(jié)合抑制其翻譯或?qū)е缕浣到舛鸬睫D(zhuǎn)錄后沉默基因表達的作用，有可能作為一種生物標記，成為惡性腫瘤治療的一個新靶點及腫瘤診斷和預后的分子標志物[3]。miR-21定位于17q23.1，具有癌基因特性，是miRNA家族中著名的癌基因，在胰腺癌及肺癌等惡性腫瘤中高表達[4-5]，并通過抑制凋亡而與腫瘤的發(fā)生及進展有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-21的mRNA在宮頸癌組織中的表達量明顯高于正常宮頸組織，與文獻報道一致[6]，而在不同年齡、腫瘤大小、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及FIGO分期的患者之間比較，其相對表達量無統(tǒng)計學差異。研究結(jié)果提示miR-21可能參與了宮頸癌的發(fā)生，在腫瘤形成過程中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用[6]，而是否參與宮頸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移尚無確切的證據(jù)。

Stat3是信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄活化因子家族的重要成員，在正常組織中僅短暫表達，而在多種惡性腫瘤組織，如肝癌、乳腺癌和胃癌中呈持續(xù)性激活和高表達，并且與腫瘤的惡性程度及預后密切相關(guān)[7-8]。本研究結(jié)果顯示Stat3 mRNA和蛋白在正常宮頸組織中也有表達，在宮頸癌組織中表達增高，并且隨著宮頸癌組織分化的減低和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，表達水平進一步升高。隨著腫瘤向晚期進展，分化程度減低，Stat3被不斷激活，進入細胞核，發(fā)揮抑制腫瘤細胞凋亡的作用[9]。同時，可能通過誘導靶基因 Survivin、VEGF、MMP家族等的表達，促使腫瘤細胞增殖，這在其他多種腫瘤中已得到驗證[10-11]。

本研究通過對48例宮頸癌組織中的miR-21及Stat3 mRNA的相對表達量進行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關(guān)。這提示miR-21可能調(diào)控Stat3表達，抑制腫瘤凋亡，促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展。有文獻報道Stat3可能結(jié)合miR-21的啟動子調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄[12]，但是具體如何調(diào)節(jié)尚不清楚。

另外miR-21調(diào)控的靶基因還有多種，如PDCD4、PTEN、SPRY1、SPRY2及p53等[13-15]，它們在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中都發(fā)揮重要作用。miR-21如何調(diào)節(jié)Stat3以及其他靶基因，這些靶基因之間是否存在相互作用，相互作用的信號通路如何，還有待進一步研究。

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Expression of miR-21 and Stat3 in cervical cancer and their clinicopathological significance

Objective To investigate the expression of microRNA-21(miR-21)and Stat3 in cervical cancer and their clinicopathologic significance.MethodsStem-loop real-time RT-PCR was used to examine the expression of miR-21 and Stat3 in 48 specimens of cervical cancer and 20 specimens of normal cervical tissue.Immunohistochemistry was used to examine Stat3 protein expression in the tumor tissue.The association of miR-21 and Stat3 expression with clinicopathologic features was analyzed.ResultsThe expression of miR-21 and Stat3 in cervical cancer tissues were significantly higher than that of normal tissues(P＜0.05).The expression rate of Stat3 in cervical cancer tissue was 79.17%(38/48).The expression of miR-21 was positively correlated with Stat3(r=0.631,P＜0.05).The expression of Stat3 was correlated with lower differentiation,lymph node metastasis in cervical cancer(P＜0.05).ConclusionThe expressions of miR-21 and Stat3 are up-regulated in cervical cancer, which may be involved in the development and progression of cervical cancer.

Cervical cancerMicroRNA MicroRNA-21 Stat3

2015-08-10）

（本文編輯：胥昀）

臺州市科技局計劃項目基金（131KY14、14SF04）

318000 臺州市中心醫(yī)院（臺州學院附屬醫(yī)院）病理科