黃旭晴 徐長青 童岳陽

SU5416對小鼠急性肺損傷后肺纖維化的影響研究

黃旭晴 徐長青 童岳陽

目的 探討血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）受體抑制劑Z-3-[（2，4-二甲基吡咯-5-烴基）亞甲基]-2-吲哚滿酮（SU5416）對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷（ALI）后肺纖維化的影響。方法90只雄性C57BL/6小鼠隨機分為LPS模型組（MG組）、SU5416干預(yù)組（TG組）和正常對照組（CG組），每組30只。MG組及TG組小鼠經(jīng)尾靜脈注射0.5ml LPS（5mg/kg）建立小鼠ALI模型；CG組以等體積0.9%氯化鈉注射液代替。30min后，TG組小鼠即予腹腔注射0.5ml SU5416（50mg/kg），MG組和CG組小鼠則腹腔注射等體積0.9%氯化鈉注射液。于第7、14、28天分別處死3組小鼠各10只；行HE及Masson染色觀察小鼠肺損傷改變；檢測肺組織勻漿中羥脯氨酸水平；免疫組化法測定肺組織VEGF、CD31表達水平。結(jié)果MG組小鼠第7天肺損傷明顯，肺呈纖維化改變，第28天纖維化進一步加重；同一時間點，MG組及TG組小鼠肺損傷評分、羥脯氨酸水平、CD31及VEGF表達水平均高于對照組（均P＜0.05），而TG組小鼠上述指標(biāo)均低于MG組（均P＜0.05）。結(jié)論SU5416可減輕LPS誘導(dǎo)小鼠ALI后肺纖維化，其可能通過抑制VEGF、CD31表達發(fā)揮作用。

血管內(nèi)皮生長因子受體抑制劑 急性肺損傷 肺纖維化 VEGF CD31

急性肺損傷（ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是各種肺內(nèi)、外致病因素導(dǎo)致的急性彌漫性炎癥性肺部損傷，進而引起急性呼吸衰竭；由膿毒癥和重癥肺炎誘發(fā)的ALI/ARDS病死率高達40%～50%[1]。ALI發(fā)病一般認為與炎癥介質(zhì)組成的細胞因子網(wǎng)絡(luò)動態(tài)失衡引發(fā)機體病理性炎癥變化有關(guān)[2-3]，炎癥介質(zhì)誘發(fā)巨噬細胞浸潤，血管內(nèi)皮細胞高表達血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）受體（VEGFR）[4]。研究發(fā)現(xiàn)，博萊霉素損傷肺早期可見肺間質(zhì)內(nèi)先是巨噬細胞，隨后是肺間質(zhì)細胞強烈表達VEGF，并伴有肺間質(zhì)大量新生血管形成[5-6]。羥脯氨酸（HYP）為膠原纖維所特有，可反映纖維化的程度。VEGF的高表達和新生血管形成存在時間劑量依賴性。CD31是新生血管形成的主要標(biāo)志之一，可反映肺組織新生血管的密度。在ALI早期既有炎癥反應(yīng)，同時又有纖維組織增生及修復(fù)[7]。如何防止或減輕ALI遠期肺纖維化是改善ALI預(yù)后的關(guān)鍵問題。血管內(nèi)皮生長因子受體抑制劑Z-3-[（2，4-二甲基吡咯-5-烴基）亞甲基]-2-吲哚滿酮（SU5416）是一種脂溶性小分子合成受體酪氨酸激酶抑制劑[8]，既可抑制VEGFR-1，也能阻斷VEGFR-2。SU5416主要用于抑制腫瘤新生血管形成的研究，其對ALI后肺纖維化的作用研究報道不多。本研究擬以經(jīng)尾靜脈注射脂多糖（LPS）的方法誘導(dǎo)小鼠ALI，通過觀察肺損傷改變，檢測肺組織HYP、VEGF及CD31水平，探討SU5416對小鼠ALI后肺纖維化的影響，以期為ALI研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料 實驗動物：雄性健康清潔級C57BL/6小鼠90只，6～8周齡，體重20～24g，購自南京君科生物工程有限公司。試劑：HYP檢測試劑盒購自南京建成生物研究所；SU5416購自美國Santa Crutz公司；LPS購自美國Sigma公司；VEGF及CD31試劑盒購自武漢博士德生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型建立 將小鼠按隨機數(shù)字表法分為LPS模型組(MG組)、SU5416干預(yù)組（TG組）、正常對照組（CG組），每組30只。小鼠于實驗開始前12h禁食，自由飲水。消毒小鼠尾部皮膚，MG組及TG組小鼠經(jīng)尾靜脈注射0.5ml LPS（5mg/kg）建立小鼠ALI模型；CG組以等體積0.9%氯化鈉注射液代替。LPS致傷后30min，TG組小鼠即予腹腔注射0.5ml SU5416（50mg/kg），MG組和CG組小鼠則腹腔注射等體積0.9%氯化鈉注射液。于第7、14、28天分別處死3組小鼠各10只；取左肺組織行HE及Masson染色觀察肺泡炎、肺纖維化及肺損傷改變；免疫組化法檢測肺組織CD31及VEGF的表達水平；取右肺上葉制作肺組織勻漿用于HYP含量檢測。

1.2.2 肺組織HE、Masson染色 在光學(xué)顯微鏡下觀察3組小鼠肺組織大體及病理改變（HE染色），確定LPS誘發(fā)的小鼠ALI模型是否成功。Masson染色進行膠原纖維及肌纖維的鑒別。

1.2.3 肺損傷程度評判 根據(jù)以下4項指標(biāo)進行肺損傷評分[9-10]：（1）肺泡充血；（2）肺出血；（3）肺間隙或血管壁中性粒細胞浸潤或聚集；（3）肺泡間隔增厚或透明膜形成。根據(jù)每項指標(biāo)病變輕重進行0～4分半定量分析（無損傷計0分，輕度損傷計l分，中度損傷計2分，重度損傷計3分，極重度損傷計4分），累加各項評分的總分作為肺損傷評分。

1.2.4 肺組織勻漿HYP水平檢測 準(zhǔn)確稱取保存?zhèn)溆玫臐穹谓M織30～40mg/只，剪碎后制成勻漿，采用堿水解法測定樣本光密度，然后參照HYP檢測試劑盒說明書，根據(jù)肺組織含量計算HYP水平。

1.2.5 VEGF及CD31表達水平測定 采用免疫組化SP法，切片皆采用圖像分析軟件先進行顏色分離，然后自動計算其積分光密度（IOD）值進行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠一般情況比較 經(jīng)尾靜脈注射LPS后，CG組小鼠呼吸平穩(wěn)，無口唇發(fā)紺、肺出血表現(xiàn)；MG組小鼠48h出現(xiàn)呼吸急促、口唇發(fā)紺、肺出血等癥狀，符合ALI表現(xiàn)；而TG組上述癥狀有所減輕。

2.2 3組小鼠肺組織病理形態(tài)比較 CG組小鼠各時間點肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡大小均勻，肺泡腔清晰，肺間質(zhì)及肺泡腔無明顯炎性細胞浸潤、出血及纖維組織增生。MG組小鼠第7天肺間質(zhì)水腫、毛細血管擴張充血、大量肺泡腔內(nèi)可見炎性細胞浸潤，可見大量新生血管形成，伴灶性出血、肺氣腫及肺不張等ALI改變；第14天時損傷改變分布不均勻，以胸膜下區(qū)明顯，肺泡間隔輕度增寬、巨噬細胞等炎性細胞浸潤明顯、膠原纖維沉積少；第28天時肺組織肺泡炎仍較重，部分肺泡腔消失，間質(zhì)被大量藍色膠原纖維占據(jù)，新生血管減少，破壞嚴(yán)重、纖維化明顯、少見炎性細胞浸潤，嚴(yán)重纖維化。TG組小鼠第7、14、28天時肺損傷和纖維化均較MG組輕。

2.3 3組小鼠肺組織Masson染色表現(xiàn)比較 見圖1-3。

由圖1-3可見，MG組小鼠可見藍色膠原沉積明顯，并隨著小鼠生存時間延長，藍色膠原沉積加重；CG組小鼠肺組織未見藍色膠原沉積；TG組小鼠肺組織可見藍色膠原沉積介于CG組與MG組之間。

2.4 3組小鼠肺損傷評分比較 見表1。

由表1可見，3組小鼠第7、14、28天肺損傷評分比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05）；MG組與TG組小鼠第7、14、28天肺損傷評分均高于CG組（均P＜0.05）；TG組小鼠第7、14、28天肺損傷評分均較MG組降低（均P＜0.05）。

2.5 3組小鼠肺組織HYP水平比較 見表2。

由表2可見，3組小鼠第7、14、28天肺組織HYP水平比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05）；MG組與TG組小鼠第7、14、28天肺組織HYP水平均高于CG組（均P＜0.05）；TG組小鼠第7、14、28天肺組織HYP水平均較MG組降低（均P＜0.05）。

圖1 MG組肺組織Masson染色表現(xiàn)（a:第7天；b:第14天；c:第28天；×400）

圖2 TG組肺組織Masson染色表現(xiàn)（a:第7天；b:第14天；c:第28天；×400）

圖3 CG組肺組織Masson染色表現(xiàn)（a:第7天；b:第14天；c:第28天；×400）

表1 3組小鼠肺損傷評分比較（分）

表2 3組小鼠肺組織HYP水平比較（mg/g）

2.6 3組小鼠肺組織VEGF、CD31表達水平（IOD值）比 較 見表3。

表3 3組小鼠肺組織VEGF、CD31表達水平（IOD值）比較（×103）

由表3可見，3組小鼠第7、14、28天肺組織VEGF、CD31表達水平比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05）；MG組與TG組小鼠第7、14、28天肺組織VEGF、CD31表達水平均高于CG組（均P＜0.05）；TG組小鼠第7、14、28天肺組織VEGF、CD31表達水平均較MG組降低（均P＜0.05）。

3 討論

ALI的確切發(fā)病機制目前尚不明確，臨床上也缺乏特異有效的治療方法，目前對其研究主要集中在致病機制和藥物機制方面[11-12]。進一步探索ALI的發(fā)病機制，對ALI預(yù)防和靶向治療意義重大。ALI早期消減炎癥介質(zhì)的釋放，減輕ALI后的肺纖維化，維持內(nèi)皮細胞正常功能至關(guān)重要[13]。

VEGF可能通過與特異性受體結(jié)合促進成纖維細胞生長，合成膠原等細胞外基質(zhì)，導(dǎo)致肺纖維化[14]。SU5416是一種脂溶性小分子合成受體酪氨酸激酶抑制劑[6]，既可抑制VEGFR-1，也能阻斷VEGFR-2。SU5416與VEGFR-1分子結(jié)合，能明顯抑制單核巨噬細胞在肺部聚集、活化；同時還通過與VEGFR-2結(jié)合，降低血管通透性，抑制黏附過程，減少巨噬細胞等炎性細胞的滲出和向損傷病灶的移動[15]，從而減輕ALI后的肺纖維化。HYP是機體膠原蛋白的主要成分之一，為膠原纖維所特有，可以判斷纖維化的程度[16]。本研究結(jié)果顯示，通過LPS誘導(dǎo)小鼠ALI后的第7天，MG組肺血管通透性明顯增加，出現(xiàn)肺泡間隔增厚、炎癥細胞浸潤，伴灶性出血、肺氣腫及肺不張等典型ALI改變，后期出現(xiàn)廣泛膠原纖維沉積、肺泡腔消失、HYP水平進行性增加等肺纖維化改變，符合ALI后肺纖維化的病理過程。在各時間點MG組和TG組小鼠肺組織HYP水平均明顯高于CG組；MG組小鼠肺組織HYP水平呈進行性增加，第28天最高，而在同一時間點TG組較MG組均低。

SU5416通過VEGF/VEGFR信號途徑，阻斷VEGF對內(nèi)皮細胞的營養(yǎng)、增殖和促進存活作用，促進內(nèi)皮細胞凋亡，抑制新生血管形成，減少巨噬細胞等炎性細胞的滲出和向損傷病灶的移動[15]。CD31是新生血管形成的主要標(biāo)志之一，通過免疫組化法測定CD31表達水平可判斷肺組織新生血管的密度，其在調(diào)控血管通透性、介導(dǎo)炎性細胞滲入局部組織過程中起關(guān)鍵作用[17]。CD31表達水平上調(diào)，是白細胞浸潤的分子基礎(chǔ)，抑制CD31表達是防治炎性細胞浸潤損傷的策略之一。本研究結(jié)果顯示，TG組小鼠肺組織VEGF、CD31表達水平均較MG組降低，能減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI后肺纖維化；其作用機制可能是SU5416抑制VEGF及CD31表達，進而抑制新生血管形成。

[1]Mikkelsen M E,Shah C V,Meyer N J,et al.The epidemiology of acute respiratory distress syndrome in patients presenting to the emergency department with severe sepsis[J].Shock,2013,40(5): 375-381.

[2]Gao R,Ma Z,Hu Y,et al.Sirt1 restrains lung inflammasome activation in a murine model of sepsis[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2015,308(8):847-853.

[3]Huston J M,Tracey K J.The pulse of inflammation:heart rate variability,the cholinergic anti-inflammatory pathway and implications for therapy[J].J Intern Med,2011,269(1):45-53.

[4]Eubank T D,Roberts R,Galloway M,et al.GM-CSF induces expression of soluble VEGF receptor-1 from human monocytes and inhibits angiogenesis in mice[J].Immunity,2004,21(6):831-842.

[5]Sewack G F,Ellis T W,Hansen U.Binding of TATA binding protein to a naturally positioned nucleosome is facilitated by histone acetylation[J].Mol Cell Biol,2001,21(4):1404-1415.

[6]Okuma T,Terasaki Y,Kaikita K,et al.C-C chemokine receptor 2 (CCR2)deficiency improves bleomycin-induced pulmonary fibrosis by attenuation of both macrophage infiltration and production of macrophage-derived matrix metalloproteinases[J].J Pathol,2004,204(5):594-604.

[7] 王麗.急性呼吸窘迫綜合征早期肺纖維化的研究進展[J].國際呼吸雜志,2003,23(1):50-54.

[8]Sukbuntherng J,Cropp G,Hannah A,et al.Pharmacokinetics and interspecies scaling of a novel VEGF receptor inhibitor, SU5416[J].J Pharm Pharmacol,2001,53(12):1629-1636.

[9]Leali D,Dell'Era P,Stabile H,et al.Osteopontin(Eta-1)and fibroblast growth factor-2 cross-talk in angiogenesis[J].J Immunol,2003,171(2):1085-1093.

[10] 朱惠蘭,黃成亮,王文軍,等.穿心蓮內(nèi)酯對肺纖維化大鼠BALF中細胞因子和肺組織Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達的影響[J].細胞與分子免疫學(xué)雜志,2011,27(7):725-729.

[11]高言國,杜貴賓,吳瑩,等.垂體后葉素對百草枯中毒大鼠急性肺損傷的治療作用及機制[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2014,94(4):306-309.

[12]劉軍,張朋書,于濤,等.氯沙坦抑制肺樹突狀細胞活化對小鼠急性肺損傷的保護效應(yīng)[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2014,94(41):3216-3219.

[13]Parekh D,Dancer R C,Thickett D R.Acute lung injury[J].Clin Med(Lond),2011,11(6):61561-61568.

[14]Chen H,Tini M,Evans R M.HATs on and beyond chromatin[J]. Curr Opin Cell Biol,2001,13(2):218-224.

[15]Zeng H,Zhao D,Mukhopadhyay D.Flt-1-mediated down-regulation of endothelial cell proliferation through pertussis toxin-sensitive G proteins,beta gamma subunits,small GTPase CDC42,and partly by Rac-1[J].J Biol Chem,2002,277(6): 4003-4009.

[16]汪友平,李艷麗,賴榮德,等.血必凈對大鼠急性肺損傷的干預(yù)效應(yīng)研究[J].中國急救醫(yī)學(xué),2011,31(11):1003-1006.

[17]Blagosklonny M V,An W G,Romanova L Y,et al.p53inhibitshypoxia-inducible factor-stimulated transcription[J].J Biol Chem, 1998,273(20):11995-11998.

VEGF receptor inhibitor SU5416 attenuates pulmonary fibrosis in mice with acute lung injury

Objective To investigate the effect of VEGF receptor inhibitor SU5416 on pulmonary fibrosis after acute lung injury in rats.MethodsNinety C57BL/6 mice were randomly divided into three groups (n=30 in each group).Lung injury was induced by injection of lipopolysaccharide(LPS)via caudal vein in model group and intervention group;mice in control group were injected with 0.5ml normal saline instead.SU5416 (50mg/kg)was given to mice in intervention group and the same volume of normal saline was given to mice in control group and model group.Mice were sacrificed at d7,d14 and d28.Pathological changes of the lung tissue and ALI score and hydroxyprolline contents were examined.The expression of VEGF and CD31 were measured by immunohistochemistry.ResultsALI score,the expression of VEGF and CD31,and hydroxyprolline contents in model group and intervention group were higher than those in control group.Compared with model group,these changes were attenuated significantly in intervention group.ConclusionAdministration of SU5416 can attenuate LPS-induced pulmonary fibrosis in mice,which is associated with the down-regulation of VEGF and CD31 expression.

Vascular endothelial growth factor receptor inhibitorAcute lung injury Pulmonary fibrosis VEGF CD31

2016-09-21）

（本文編輯：李媚）

浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計劃項目（2015C33258）；杭州市社會發(fā)展自主申報項目（20160533B18）；杭州市衛(wèi)生科技計劃項目（2011A017）

310015 杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科

黃旭晴，E-mail:hxq3871@126.com