周云鋒+褚歐成+邊海霞+郭磊++王學(xué)強(qiáng)+王潔+王翔

摘要：從寧夏某養(yǎng)殖場(chǎng)雞白痢雞傷寒多價(jià)平板凝集抗原陽(yáng)性雞只的腸道中分離到一株革蘭氏陰性桿菌，經(jīng) 16S rRNA 測(cè)序鑒定為奇異變形桿菌；通過(guò)對(duì)該菌株進(jìn)行人工感染健康雞只，成功復(fù)制出與自然感染相同的病例。

關(guān)鍵詞：雞白痢；雞傷寒；變形桿菌的分離

中圖分類(lèi)號(hào)： S858 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI編號(hào)： 10.14025/j.cnki.jlny.2017.01.016

雞沙門(mén)氏菌病 OIE 規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)診斷方法：病原鑒定。采取檢測(cè)樣本，通過(guò)選擇性培養(yǎng)基分離、培養(yǎng)細(xì)菌，還有沙門(mén)氏菌復(fù)蘇試驗(yàn)，都可以從病原學(xué)上鑒定、驗(yàn)證雞沙門(mén)氏菌病；血清學(xué)試驗(yàn)。利用沙門(mén)氏菌抗原，通過(guò)快速全血凝集試驗(yàn)、快速血清凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)、微量凝集試驗(yàn)等檢測(cè)樣本中的抗體，達(dá)到診斷的目的。但我國(guó)國(guó)標(biāo)對(duì)雞白痢傷寒檢測(cè)采用平板凝集實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方法隨著細(xì)菌的變異準(zhǔn)確性越來(lái)越低，經(jīng)實(shí)踐證明有多種細(xì)菌感染均會(huì)引起平板凝集陽(yáng)性，其中包括奇異變形桿菌。

奇異變形桿菌（proteusmirabilis，PM）屬于腸桿菌科變形桿菌屬，是革蘭氏陰性運(yùn)動(dòng)細(xì)菌，有鞭毛，是人和動(dòng)物的寄生菌和病原菌；廣泛分布于人和動(dòng)物的體表、黏膜及消化道，其產(chǎn)生的毒素可引起中毒，是一種常見(jiàn)的條件性致病菌[1]，當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時(shí)容易引起發(fā)病。雞奇異變形桿菌病是近年來(lái)新發(fā)生的一種雞群的細(xì)菌性傳染病，各種日齡的雞均可感染，但以 7 周齡以下的雛雞最易感，病死率可高達(dá) 50%以上；育成雞及成年產(chǎn)蛋雞均易感但發(fā)病率與病死率一般很低。該病作為一種不常暴發(fā)的新的細(xì)菌性傳染病，可造成較高的死亡，而愈后的雛雞生長(zhǎng)速度變慢，導(dǎo)致雛雞的大批死亡，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，因此應(yīng)引起養(yǎng)雞業(yè)的高度重視[2]。

近年來(lái)，有少量文獻(xiàn)報(bào)道[3]奇異變形桿菌與沙門(mén)氏菌屬具有共同抗原，能夠與沙門(mén)氏菌屬的多價(jià)血清和因子血清發(fā)生交叉凝集，引起菌種鑒定上的困難。但能引起雞白痢雞傷寒多價(jià)平板凝集抗原陽(yáng)性反應(yīng)的未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)室在分離沙門(mén)氏菌時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)其能引起雞白痢雞傷寒多價(jià)平板凝集抗原陽(yáng)性反應(yīng)，且在反應(yīng)時(shí)間和形成的凝結(jié)塊上根本無(wú)法進(jìn)行區(qū)分，經(jīng)病例復(fù)制實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該菌正是造成雞只雞白痢雞傷寒多價(jià)平板凝集抗原假陽(yáng)性反應(yīng)的病原菌。

1 材料與方法

1.1 被檢材料

寧夏某雞場(chǎng) 110 日齡育成雞，經(jīng)雞白痢雞傷寒沙門(mén)氏菌多價(jià)抗原平板凝集實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的陽(yáng)性雞只，無(wú)臨床癥狀。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

緩沖蛋白胨水、SC 增菌液、氯化鎂孔雀綠肉湯、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、SS 瓊脂平板、LB 肉湯、XLT4 培養(yǎng)基等均購(gòu)自北京路橋技術(shù)有限公司；細(xì)菌生化微量鑒定管購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、Taq 聚合酶及配套 dNTP 等試劑均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雞只：55 日齡海蘭褐母雞購(gòu)于寧夏曉鳴農(nóng)牧股份有限公司。

1.4 細(xì)菌分離和鑒定

無(wú)菌剖檢雞只，采集腸道后段、肝臟、膽囊、肺臟、腎臟、輸卵管各部分，分別接種于緩沖蛋白胨水中，37℃培養(yǎng)20時(shí)，預(yù)增菌；將預(yù)增菌的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)分別接到 SC 增菌液和氯化鎂孔雀綠肉湯中 37℃增菌24時(shí)，增菌后分別劃線(xiàn)于 SS 瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基、SS 瓊脂平板、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，分別挑取優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，得到的純培養(yǎng)物命名為 NX-1，將得到的純培養(yǎng)物涂片后進(jìn)行革蘭氏染色和硝酸銀染色，顯微鏡（40×100）觀察。

1.5 生化鑒定

將 NX-1 分別接種到沙門(mén)氏菌微量生化鑒定管，37℃培養(yǎng) 24小時(shí)，觀察記錄結(jié)果。

1.6 16S rRNA 的擴(kuò)增及序列測(cè)定

挑取 NX-1 少許，移入 LB 肉湯液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng) 10h，取新鮮菌液 1毫升，離心收集菌體，用 DNA 提取試劑盒抽提 NX-1 細(xì)菌的基因組 DNA。采用細(xì)菌通用引物序列 27F/1492R（由上海生工合成）。

反應(yīng)體系為 50uL 反應(yīng)體系：10 X Buffer 5uL， dNTP（10 mmol/L） 4uL，Taq DNA 聚合酶 0.5uL，上、下游引物各 2uL，模板 DNA2uL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5分鐘；94℃ 45秒，57℃ 45秒，72℃ 2分鐘，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10分鐘。

取 5uL PCR 產(chǎn)物用 0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，用 DNA Marker 作為參照。選取目的條帶送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定。

1.7 病例復(fù)制

將 50 只 55 日齡海蘭褐母雞隨機(jī)分為2大組，第 1 組內(nèi)分成注射組、飼喂組和對(duì)照組；第2組分為注射組和對(duì)照組，每小組10只健康雞只，用雞白痢雞傷寒多價(jià)抗原平板凝集實(shí)驗(yàn)剔除陽(yáng)性雞只，單獨(dú)飼養(yǎng)10天后再次剔除陽(yáng)性雞只。

第1組內(nèi)每小組間隔3米，不做隔離；第 2 組注射組和對(duì)照組嚴(yán)格隔離。注射組每只接種 NX-1 濃縮液1mL（菌液濃度均調(diào)整到9×1010 cfu/mL的生理鹽水）；對(duì)照組每只接種 1mL 生理鹽水；飼喂組飼喂含NX-1的飼料2天（菌液濃度均調(diào)整到9×1010cfu/g）；接種后每天觀察記錄。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離及染色觀察

僅從雞只的腸道中分離到該菌，其他組織均無(wú)此菌生長(zhǎng)，37℃培養(yǎng) 16小時(shí)，普通瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈擴(kuò)散狀生長(zhǎng)布滿(mǎn)整個(gè)平皿。在麥康凱平板上，長(zhǎng)出均勻一致的圓形、透明、無(wú)色菌落。在 SS 培養(yǎng)基上形成中間黑色周?chē)鸁o(wú)色透明的菌落。 XLT4 上面形成黑色中心的透明菌落。

鏡檢結(jié)果顯示：革蘭氏陰性、桿菌，多為單個(gè)存在（有短鏈狀，2～4 個(gè)菌體鏈），短桿狀；硝酸銀染色可見(jiàn)周身鞭毛。

2.2 細(xì)菌生化鑒定

在三糖鐵斜面培養(yǎng)基上，底部產(chǎn)酸，斜面產(chǎn)堿，硫化氫強(qiáng)陽(yáng)性；氧化酶陰性、分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、不分解乳糖、苯丙氨酸脫氨酶陽(yáng)性、氰化鉀抑制試驗(yàn)陽(yáng)性，鳥(niǎo)氨酸脫竣酶陽(yáng)性；靛基質(zhì)、賴(lài)氨酸脫竣酶、甘露醇、山梨醇 ONPG 均為陰性，與說(shuō)明書(shū)對(duì)比判斷該菌非沙門(mén)氏菌。

2.3 16Sr RNA 鑒定

該菌 16S rRNA 基因 PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示，均擴(kuò)增出約 1400bp 的片段，與預(yù)期片段大小一致。測(cè)序結(jié)果顯示，該 NX-1 分離菌的16S rRNA擴(kuò)增片段為1368bp，經(jīng) Blast 分析比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與其匹配度最高的幾種全序列均是奇異變形桿菌各株系的 16S rRNA 序列，其匹配度高達(dá) 99%，進(jìn)一步證實(shí)該分離菌為奇異變形桿菌。

2.4 病例復(fù)制實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未見(jiàn)雞只死亡，在接種12時(shí)，雞只出現(xiàn)輕度腹瀉，20小時(shí)后逐漸好轉(zhuǎn)；實(shí)驗(yàn)第11天剖檢第2組雞只出現(xiàn)陽(yáng)性轉(zhuǎn)為陰性，因此剖檢注射組5只（3只轉(zhuǎn)陰性雞只、2 只陽(yáng)性雞只）、對(duì)照組4只進(jìn)行對(duì)比，未發(fā)現(xiàn)明顯剖檢變化。雞白痢雞傷寒多價(jià)平板凝集實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)表1。

3 結(jié)語(yǔ)

雞奇異變形桿菌病是近年來(lái)國(guó)內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的一種急性細(xì)菌性傳染病，主要引起禽類(lèi)腹瀉、菌血癥、泌尿系統(tǒng)感染等疾病。本研究從雞白痢雞傷寒假陽(yáng)性健康雞只中分離到 1 株奇異變形桿菌，雞群無(wú)明顯腹瀉等癥狀；人工感染實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制出與自然感染相同的病例，在人工感染后 12小時(shí)出現(xiàn)輕度腹瀉，但很快就會(huì)好轉(zhuǎn)（8小時(shí)），無(wú)其他癥狀，剖檢未發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組有明顯差異，水平傳播能力強(qiáng)。該菌株在 SS 培養(yǎng)基上傳代 10 次以后毒力減弱，接種健康雞只后僅見(jiàn) 20%弱陽(yáng)性雞只。

參考文獻(xiàn)

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[2]衣菲，于申業(yè)，田秋豐，等.禽源奇異變形桿菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2015（01）：121-122，126，216.

[3]王錦彤，鐘廣輝，熊定凱，等.珠江水中檢出與沙門(mén)氏菌具有共同抗原的奇異變形桿菌[J].口岸衛(wèi)生控制，2008（02）：23-24.

作者簡(jiǎn)介：周云鋒，碩士，主任助理，研究方向：疾病診斷和家禽養(yǎng)殖。