吳希，鄧勤，徐志勇，岑舉人，徐靜

(海南大學材料與化工學院，?？?570228)

制備型高效液相色譜在天然產物分離中的應用*

吳希，鄧勤，徐志勇，岑舉人，徐靜

(海南大學材料與化工學院，海口 570228)

制備型高效液相色譜法在天然產物的分離純化中得到廣泛應用。從制備型高效液相色譜法的技術分類及其在天然產物研究中的實際應用方面對目前國內外制備型高效液相色譜技術研究現(xiàn)狀進行了綜述，對其發(fā)展動態(tài)進行了展望。

制備型高效液相色譜；天然產物；分離純化

從植物、動物、微生物等天然材料中發(fā)現(xiàn)結構新穎且具有藥理活性的天然產物并進一步開發(fā)成新藥，是人類預防和治療疾病的重要渠道，也是國際天然產物領域關注的研究方向［1］。采用高效、高分辨、多功能的分離技術是開展天然產物研究的關鍵環(huán)節(jié)之一［2］。近十幾年來，制備型高效液相色譜(preparative high performance liquid hromatography，Prep-HPLC)是天然產物化學研究中應用最普遍、最有效和相關技術發(fā)展最快的分離純化方法［3］。它是通過高負載、高分離度的制備柱來實現(xiàn)高純度分離的色譜分離方法［4］，其特點在于：(1)采用高柱效色譜柱，分離效率高；(2)應用范圍廣，對極性和非極性、離子型和非離子型、小分子和大分子、熱穩(wěn)定性和熱不穩(wěn)定性化合物均具有較好的分離效果，在藥物研究領域具有不可替代的地位；(3)處理量大，能夠滿足不同的分離需求；(4)根據(jù)分離化合物的性質可配備不同類型的檢測器，如紫外檢測器(UV)、蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)、二極管陣列檢測器(DAD)；(5)具有重現(xiàn)性好、毒性小、經(jīng)濟環(huán)保等優(yōu)點［5–7］。筆者對近年來Prep-HPLC方法在各類天然產物分離純化中的應用進行綜述，為該方法的進一步推廣應用提供參考。

1 制備型高效液相色譜技術的分類

制備型HPLC 是在分析型HPLC 的基礎上發(fā)展起來的一種高效分離純化技術。按照制備規(guī)模分有3種類型：(1)半制備色譜，其柱內徑為5～20 mm，長度為15～50 mm，一般用10 μm或20～30 μm粒度的填料，通常在不超載的條件下操作，可以說是一種放大的分析分離。(2)克級制備色譜，當分離的樣品量較大時，使用50 mm左右內徑、20～70 cm長度的色譜柱，填料粒度40～60 μm，可裝200～500 g固定相，在超載條件下操作。(3)工業(yè)用制備色譜，色譜柱尺寸及填料粒徑更大［8］。表1列出了制備性高效液相色譜柱的級別和處理量。

表1 制備性高效液相色譜柱的級別和處理量

在天然產物分離純化中，如果所得的純化合物只是為了結構解析，使用半制備色譜即可很容易獲得毫克級的單組分；如果所得的純化合物是為了進行藥理活性實驗或進一步進行結構改造，則需要用到克級制備色譜。

2 制備型高效液相色譜的應用

2.1 生物堿類化合物

生物堿是生物體內一類除蛋白質、肽類、氨基酸及維生素B以外的含氮有機化合物，它們結構復雜且大多具有生理活性，如抗腫瘤活性［9–10］。在生物堿分離制備中,反相制備是制備型高效液相色譜應用最普遍的方法。根據(jù)樣品的不同其流動相有很大差異。目前紫杉醇的制備是高效液相中比較成熟的應用［11］，專用制備柱以D956樹脂為填料(250 mm×200 mm)，丙酮–水(40∶60～58∶42)為流動相，純度可達到99%，回收率在80%以上。朱云霞［12］等利用Agilent 1100系列半制備型高效液相色譜對三尖杉總堿進行分離制備，色譜條件為Kromasil KR100–5 C18(10 mm×250 mm，5μm)，流動相為0.02 mol／L乙酸銨溶液–甲醇(65∶35)，用氨水調節(jié)pH為8.5左右，流速為5.0 mL／min，檢測波長為284 nm，柱溫為35℃，進樣量為600 μL，可得到4種含量較高的三尖杉生物堿。王倩等［13］采用半制備高效液相色譜法對紅毛七中的化學成分進行研究，對紅毛七浸膏的6個洗脫部分進行制備，色譜條件為YMC–Actus Triart C18半制備色譜柱(20 mm×250 mm，5 μm)，當流動相為甲醇–水(80∶20)、流速為8 mL／min時得到臭豆堿；當流動相為甲醇–水(50∶50)、流速為6 mL／min時得到穿葉贗靛堿。魏鼎華等［14］利用Waters系列高效液相從鐵棒錘中得到3個二萜生物堿，色譜條件為YMC–Pack R＆D ODS–A半制備色譜柱(20 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇–水(70∶30)。陳艷等［15］采用Waters 600型半制備型高效液相色譜儀Kromasil–C18(250 mm×10 mm，5 μm)，從小花清風藤莖葉的石油醚萃取部位分離純化得到2種生物堿N-formyl-annonain(Z)和N-formyl-O-methylisopiline。尹元元等［16］利用日本Shimadzu LC–6A高效液相色譜儀，采用YMC C18色譜柱(20 mm×250 mm，5 μm)，從吳茱萸得到11種生物堿類化合物，其中1-甲基-2-正十一烷基-4(1H)-喹諾酮、二氫吳茱萸卡品堿等具有抑制斑馬魚血管生物活性。制備型高效液相色譜法在生物堿純化中的應用見表2。

表2 制備型高效液相色譜法在生物堿純化中的應用

2.2 黃酮類化合物

黃酮類化合物是由兩個苯環(huán)通過三碳鏈相互連接而成的，具有C6–C3–C615個碳原子基本骨架的一類物質，其廣泛分布于各種藥用植物中。目前已知的具有生物活性的黃酮類化合物有很多，其活性主要包括抗心血管疾病、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等［17］。萬近福等［18］利用MCl gel柱層析，得到羅布麻花的總黃酮提取物，結合Varian Prostar制備型高效液相色譜進行純化，色譜條件為反相C18柱(Merck，250 mm×25 mm，12 μm)，流動相為0.1%甲酸的乙腈和水梯度洗脫，其中乙腈在180 min內從5%增加到50%。通過優(yōu)化流速、樣品進樣量、洗脫梯度的變化，一次可從羅布麻花中制備分離得到9個黃酮類化合物，純度均超過90%。此研究將高效液相色譜、紫外和蒸發(fā)光散色檢測器聯(lián)用分析羅布麻花總黃酮提取物的主要化學成分。該分離技術給天然產物黃酮類的分離、純化提供了一種直接有效的方法。朱玲玲［19］利用高效液相色譜儀Shimadzu LC–20AT建立了對白鵑梅乙酸乙酯相快速分離純化的方法，色譜條件為流動相甲醇–水(45∶55)，流速為1.0 mL／min，進樣量為40 μL，檢測波長為267 nm，柱溫為40℃，得到黃酮類化合物蘆丁18 mg。易美玲［20］利用Agilent 1100型液相半制備色譜儀結合大孔吸附樹脂、聚酰胺柱、正相硅膠柱、Sephadex LH–20柱色譜從翠云草75%乙醇提取物中得到9種黃酮類化合物，其中4’-甲氧基穗花杉雙黃酮為首次從翠云草中分離得到。龔俊強等［21］采用硅膠、Sephadex LH–20柱色譜及半制備型高效液相色譜法，對黃杞葉中的黃酮類成分進行分離純化，得到6種黃酮類化合物，其中(2R，3R)5，7，4’-三羥基二氫黃酮-3-氧-α-L-鼠李糖(3→1)-β-D-葡萄糖苷為首次從該植物中得到，為新化合物。應瑞峰等［22］對錢柳葉中化學成分進行研究，利用Waters-1525高效液相色譜儀從青錢柳葉中得到3個黃酮類化合物，其中絲桃甙和山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖甙是首次從青錢柳葉中提取得到。青錢柳黃酮是青錢柳主要有效成分之一，但目前關于青錢柳黃酮單體的制備報道較少。制備型高效液相色譜法在黃酮類純化中的應用見表3。

表3 制備型高效液相色譜法在黃酮類純化中的應用

2.3 萜類化合物

萜類化合物是由異戊二烯或異戊烷以各種方式連接而成的天然化合物，具有祛痰、止咳、鎮(zhèn)痛等生理活性［23–24］。此類化合物的制備通常采用以C18為填料的反相色譜柱、甲醇–水溶液為流動相，調節(jié)洗脫強度時加入異丙醇、正己烷溶液，流速控制在3～10 mL／min。朱玲娟等［25］利用Shimadzu LC–6A高效液相色譜和Phenomenex Gemini C18反相色譜柱(250 mm×10 mm，5 μm)從莢果蕨中分離出了9種高純度的倍半萜類單體化合物，均為首次從莢果蕨屬植物中分離得到。此項研究發(fā)展了分離純化莢果蕨中倍半萜類的分離方法。石柳柳等［26］對黑老虎中的萜類成分進行了系統(tǒng)研究，采用丙酮提取，半制備高效液相JASCO PU–2089色譜等方法分離純化，得到4種倍半萜類化合物。鞠愛華等［27］利用Prep-HPLC從蒙藥大梔子中分離純化其主要化學成分環(huán)烯醚萜苷類和西紅花苷類，建立了純化工藝。色譜條件Ⅰ為Shmadzu色譜柱(20 mm×50 mm，5 μm)，選擇220 nm為檢測波長，以流動相甲醇–水進行線性梯度洗脫0～15 min，甲醇10%～40%；15～18 min，甲醇40%；18～45 min，甲醇40%～100%；流速為15 mL／min，進樣量為1.5 mL。色譜條件Ⅱ為Shmadzu色譜柱(20 mm×50 mm，5 μm)，選擇440 nm為檢測波長，以流動相甲醇–水進行線性梯度洗脫0～25 min，甲醇 40%～100%；流量為15 mL／min，進樣量為0.5 mL。此項研究對分離這兩類基本骨架完全相同、化學性質相似的化合物提供了可行方法。郎俊慧等［28］對豆莢軟珊瑚中二萜類成分進行研究，利用Waters 1525／2998 高效液相色譜儀，色譜條件為YMC C18半制備柱(250 mm×10 mm，5 μm)，流動相為乙腈–水(70∶30，65∶30，60∶40)，分別制備得到6種半萜類化合物，其中豆莢內酯B為新化合物，其余均為首次從該屬軟珊瑚中分離得到，該研究豐富了軟珊瑚的二萜類化學成分。表4列出了制備型高效液相色譜法在萜類純化中的應用。

表4 制備型高效液相色譜法在萜類純化中的應用

2.4 甾體化合物

甾體類化合物(steroids)是基本母核為環(huán)戊稠多氫化菲的一類天然化合物，其在維持生命、調節(jié)性功能、治療皮膚疾病及控制生育等方面具有重要的生理、藥理作用［29–30］。季改等［31］利用半制備高效液相色譜儀LC–20AT、硅膠柱色譜和Sephadex LH–20色譜柱，對緋紅南五味子莖的化學成分進行研究，分離制備出10個甾體化合物。陳玉等［32］為研究靈芝的化學成分，利用多種柱層析和半制備高效液相色譜儀Ultimate 3000，VWD，DAD檢測器，采用半制備型色譜柱5C18–MS–II(250 mm×10 mm，5 μm)對其進行了分離純化，得到ganoderic acid B9等3個甾體化合物。徐瑞蘭等［33］利用硅膠柱色譜、ODS反相柱色譜、Sephadex LH–20柱色譜和制備高效液相色譜儀對劉寄奴乙醇浸膏進行反復洗脫，得到schleicheol2等6個甾體化合物，其中一個為首次從菊科植物中分離得到。張?zhí)鹛鸬龋?4］對牛白藤的化學成分進行研究，利用高效液相色譜儀，YMC–Pack ODS–A半制備柱(20 mm×250 mm，5 μm)，采用不同流動相，分離制備得到β–谷甾醇。Wang等［35］采用Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀，對消癌平化學成分研究，色譜條件為Agilent Technologies BDS C18column(50 mm×9.4 mm，5 μm)流動相甲醇–水(2∶1；3∶1；1∶1)，從烏骨藤(消癌平)注射液中間體的氯仿提取物中分離得到11個甾體類化合物，其中3-O-β-D oleandropyranosyl 17β-tenacigenin B為新化合物。表5列出了制備型高效液相色譜法在甾體類純化中的一些應用。

表5 制備型高效液相色譜法在甾體類純化中的應用

2.5 其它類型天然產物

皂苷是苷元為三萜或螺旋甾烷類化合物的一類結構復雜的苷類化合物，一些皂苷類成分有明顯的藥理作用［36–37］。潘敏翔等［38］用硅膠柱色譜和示差檢測器的半制備反相高效液相色譜儀從南海龐海星中制備得到一種新的多羥基甾醇皂苷。康俊霞等［39］采用半制備反相高效液相色譜儀Agilent 1100從銀邊海星中分離純化得到皂苷，并建立純化的色譜條件為Zorbax 300 SB–C18柱(250 mm×9.4 mm，5 μm)，RID示差檢測器，柱溫30℃，流動相甲醇–水(47∶53)，流速1.5 mL／min，進樣量110μL，收集到白色粉末狀皂苷化合物。香豆素是一類由順式羥基桂皮酸分子內脫水環(huán)合而成的內酯化合物，實驗研究發(fā)現(xiàn)香豆素類化合物具有抗HIV、抗癌、降壓、抗心律失常、抗骨質疏松、鎮(zhèn)痛、平喘及抗菌等多方面生物學活性［40］。李寶媛等［41］對蒙藥沙蓬的化學成分進行研究，利用半制備高效液相色譜分離純化得到2種香豆素類化合物。木脂素是一類由兩分子苯丙素衍生物(即C6–C3單體)聚合而成的天然化合物，具有降壓和防治絕經(jīng)后骨質疏松等作用［42］。南澤東等［43］對新疆塔中栽培荒漠肉蓯蓉Cistanche deserticola干燥肉質莖的化學成分進行研究，利用Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀，半制備色譜柱為Agilent Eclipse XDB–C18(10 mm×250 mm，5 μm)，以不同比例的流動相制備純化得到11種木脂素。蒽醌類化合物的基本母核為蒽醌，母核上常有羥基、羥甲基、甲基、甲氧基和羧基等取代基，具有抗菌消炎、抗病毒、抗癌等藥理作用［44］。李鈞等［45］利用Agilent 1200半制備液相色譜儀，色譜條件為ZORBAX EclipseXDB－C18(9.4×250 mm，5 μm)，柱溫為30℃，檢測波長為250 nm，流動相為甲醇–水(55∶45)，流速為4 mL／min，進樣量為100 μL，從青龍衣中制備高純度的醌類化合物。制備型高效液相色譜法在其它類純化中的應用見表6。

表6 制備型高效液相色譜法在其它類純化中的應用

3 結論與展望

目前在天然產物分離純化過程中，一般先結合傳統(tǒng)的分離方法如蒸餾、結晶、沉淀、萃取以及各種經(jīng)典的色譜分離法(如大孔吸附樹脂、聚酰胺柱色譜、硅膠柱色譜等)針對目標物質進行分離，然后采用制備型高效液相色譜法制備單體化合物。制備型高效液相色譜具有產率高、速度快等優(yōu)點，未來很可能會成為天然產物分離的重要手段之一。由于天然產物分離純化的核心目標是從天然生物資源中獲取具有生物功能或活性的天然產物，因此建立高效液相色譜分離純化天然產物的技術集成和樣品庫，是今后利用高效液相色譜分離純化研究的發(fā)展趨勢。

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Application of Preparative High Performance Liquid Chromatography in Separation of Natural Product

Wu Xi，Deng Qin，Xu Zhiyong，Cen Juren，Xu Jing
(Department of Materials Science and Engineering，Hainan University，Haikou 570228，China)

Preparation of high performance liquid chromatography (Prep-HPLC) was widely applied in the separation and purifcation of natural products. Research status of preparative high permormance liquid chromatography at home and abroad were summarized in respect of the classifcation and advances of prep-HPLC technique and practical application in natural products research. The development trend of it was put forward.

prep-high performance liquid chromatography; natural products; separation and purifcation

O657.7

：A

：1008–6145(2017)01–0113–05

10.3969／j.issn.1008–6145.2017.01.029

*教育部“新世紀優(yōu)秀人才支持計劃”項目（NCET-13-0760)；自然科學基金地區(qū)基金項目（81660584）；海南省科協(xié)青年科技人才學術創(chuàng)新計劃項目（201509）

聯(lián)系人：徐靜；E-mail: happyjing3@163.com

2016–10–12