段瑩瑩，曹大鵬，任 峰，張?jiān)惠x，趙 偉*

（山東福洋生物科技有限公司，山東德州253100）

基于DO-stat流加培養(yǎng)控制的海藻糖合成酶發(fā)酵條件研究

段瑩瑩，曹大鵬，任 峰，張?jiān)惠x，趙 偉*

（山東福洋生物科技有限公司，山東德州253100）

溶氧濃度對(duì)重組大腸桿菌的生長(zhǎng)和外源蛋白的高效表達(dá)影響較大，為進(jìn)一步增加菌體量和重組蛋白表達(dá)量，該研究采用DO-stat流加培養(yǎng)進(jìn)行控制，分別研究了溶氧濃度20%、30%、35%和40%條件下大腸桿菌的生長(zhǎng)情況以及海藻糖合成酶的表達(dá)情況。結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵罐中溶氧濃度控制在30%時(shí)，發(fā)酵40 h，菌體干質(zhì)量可達(dá)53.9 g/L，是分批發(fā)酵時(shí)的6倍，海藻糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到80.9%，是分批發(fā)酵時(shí)的2.25倍。

高密度發(fā)酵；DO-stat；海藻糖合成酶

海藻糖（trehalose）是一種二糖，由兩個(gè)葡萄糖分子通過α-1,1-糖苷鍵連接而成，作為一種添加劑、穩(wěn)定劑和甜味劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域[1-2]。海藻糖目前的生產(chǎn)方法主要為酶法，其中較為簡(jiǎn)便的海藻糖生產(chǎn)方法[3]是利用海藻糖合成酶的分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基化作用將麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖。

生產(chǎn)大腸桿菌（Escherichia coli）或以其構(gòu)建的基因工程菌的表達(dá)產(chǎn)物時(shí)采用一般的發(fā)酵工藝，大腸桿菌的菌體生物量、蛋白表達(dá)量、代謝產(chǎn)物在發(fā)酵液中和菌體內(nèi)的濃度都比較低，很難得到理想的生產(chǎn)效率。高密度發(fā)酵重組大腸桿菌可獲得較高的生物量，但對(duì)發(fā)酵條件的要求非常高。影響高密度發(fā)酵的因素非常多，如細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、發(fā)酵過程中積累的生長(zhǎng)抑制物、培養(yǎng)溫度、溶氧濃度、發(fā)酵液的pH值、補(bǔ)料方式、誘導(dǎo)方式等。

在大腸桿菌的高密度發(fā)酵過程中，培養(yǎng)液中的溶氧量對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)過程中的調(diào)控具有重要的作用[4]，能很好的反應(yīng)大腸桿菌的生長(zhǎng)狀態(tài)。DO-stat流加培養(yǎng)控制的基本原理是將由于底物缺失造成的溶氧濃度上升作為補(bǔ)加底物的信號(hào)[5]，是應(yīng)用較多的一種反饋控制方式。重組大腸桿菌發(fā)酵過程中溶解氧濃度過高或過低均會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)代謝，不利于產(chǎn)酶，為進(jìn)一步增加海藻糖合成酶的表達(dá)量，提高海藻糖的轉(zhuǎn)化率，采用了DO-stat法用溶氧濃度作為反饋指標(biāo)來流加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的發(fā)酵方式[6]。當(dāng)發(fā)酵液中的底物消耗到一定程度時(shí)，細(xì)胞由于營(yíng)養(yǎng)缺失而耗氧下降導(dǎo)致溶氧濃度迅速上升，但是，通過補(bǔ)加底物，溶氧濃度又開始下降[7]。通過這種方式，可以維持溶氧濃度在一個(gè)恒定的水平。胡沛臻等[8]采用了溶氧反饋-補(bǔ)料分批技術(shù)在培養(yǎng)基因重組工程菌E.coliBL21/pET-MHM的過程中并取得了很好的效果，菌體的密度達(dá)到了70 g/L以上，目的蛋白的表達(dá)量＞菌體蛋白總量的38%。KORZ D J等[9]通過溶氧值的變化情況進(jìn)行補(bǔ)料控制高密度培養(yǎng)大腸桿菌發(fā)酵過程，在補(bǔ)料培養(yǎng)階段大腸桿菌始終處于碳源限制性生長(zhǎng)的狀態(tài)，保持著恒定的比生長(zhǎng)速率，大腸桿菌的最終菌體密度達(dá)到148 g/L。本研究利用DO-stat流加控制方式探討了不同溶氧濃度對(duì)重組海藻糖合成酶工程菌的發(fā)酵過程的影響，研發(fā)出了穩(wěn)定高效的高密度發(fā)酵工藝，為海藻糖工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

大腸桿菌（E.coli）：山東福洋生物科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，氨芐西林鈉0.01%，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%，NaH2PO40.3%，K2HPO41%，MgSO4·7H2O 0.12%，NH4Cl 0.1%，CaCl20.001%，玉米漿0.2%，氨芐西林鈉0.01%，pH 7.0。

1.1.3 試劑

海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；乙腈（色譜純）：西隴化工股份有限公司；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、酵母粉、蛋白胨：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖：山東西王糖業(yè)有限公司；氯化鈉、氯化銨、氯化鈣、硫酸鎂：天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；氨芐西林鈉：山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

15L發(fā)酵罐和過程參數(shù)檢測(cè)與控制系統(tǒng)：上海國(guó)強(qiáng)生化工程；PAS7000型生物尾氣分析系統(tǒng)：重慶哈特曼科技有限公司；Waters515泵、Waters2414型示差折光檢測(cè)器的高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：美國(guó)Waters公司；TP-114型電子天平：丹佛儀器有限公司；FE-20型pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；AH-BASIC型勻漿機(jī)：ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司；DHZ-DA型冷凍恒溫振蕩器：太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；SW-CJ-2D型凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)方法

將甘油保存液中保存的菌株以1%的接種量接到含有150 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)6 h。

1.3.2 分批發(fā)酵培養(yǎng)方法

15 L全自動(dòng)發(fā)酵罐，裝液量10 L，接種量10%，接種前發(fā)酵罐內(nèi)加入氨芐西林鈉至100 μg/mL，設(shè)定發(fā)酵罐溫度37℃，空氣通量300 L/h，罐壓0.02 MPa，流加25%的氨水調(diào)節(jié)pH使其維持在7.0±0.2。

1.3.3 DO-stat流加控制培養(yǎng)方法

在分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，當(dāng)發(fā)酵液中的葡萄糖濃度下降且溶氧濃度上升時(shí)，通過蠕動(dòng)泵自動(dòng)向發(fā)酵罐內(nèi)流加500 g/L的葡萄糖溶液。據(jù)報(bào)道，溶氧量維持在30%～40%[10]有利于重組大腸桿菌的生長(zhǎng)和外源蛋白的高效表達(dá)，所以考察了20%、30%、35%和40%這幾個(gè)溶氧水平對(duì)重組海藻糖合成酶工程菌發(fā)酵過程的影響。

1.3.4 測(cè)定方法

菌體干質(zhì)量：取不同發(fā)酵時(shí)間的菌液15mL，10000r/min離心10 min，蒸餾水清洗2次，105℃烘干至質(zhì)量恒定，用微量分析天平稱量菌體干質(zhì)量。

殘?zhí)牵翰捎渺沉衷噭┓y(cè)殘?zhí)呛浚粯悠纷銎叫袑?shí)驗(yàn)3次。

殘?zhí)呛浚?）=[空白消耗葡萄糖溶液體積（mL）－樣品消耗葡萄糖溶液體積（mL）]×2×標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的質(zhì)量濃度（1 g/L）×樣品稀釋倍數(shù)

海藻糖轉(zhuǎn)化率：準(zhǔn)確稱取轉(zhuǎn)化液1.000 0 g，超純水定容至100 mL，搖勻后超聲混勻20 min，進(jìn)樣前用0.22 μm的濾膜過濾。HPLC測(cè)定轉(zhuǎn)化液中的海藻糖含量。

式中：C1為轉(zhuǎn)化液中海藻糖的含量，g/mL；C2為發(fā)酵底物中麥芽糖的含量，g/100g。

2 結(jié)果與分析

2.1 分批發(fā)酵培養(yǎng)方法

在分批發(fā)酵過程中，初始糖度為25 g/L，當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度＜10 g/L時(shí)，開始手動(dòng)補(bǔ)加葡萄糖，使發(fā)酵液中葡萄糖濃度維持在10 g/L左右，其分批發(fā)酵過程曲線見圖1。

圖1 重組海藻糖合成酶工程菌分批發(fā)酵過程曲線Fig.1 Process curve of batch fermentation with trehalose synthase recombinant engineering strain

由圖1可知，0～8 h為菌體生長(zhǎng)延遲期，此時(shí)菌體正慢慢適應(yīng)外界環(huán)境，糖耗速率較慢，基本不產(chǎn)酸；9～22 h為菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)菌體的生長(zhǎng)速率達(dá)到最大值并保持較大值，糖耗速率明顯加快，溶氧迅速下降，15 h時(shí)發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度下降到最低值，此階段開始周期性補(bǔ)加葡萄糖；23～32 h為菌體減速生長(zhǎng)期，25 h時(shí)加入乳糖降溫誘導(dǎo)表達(dá)海藻糖合成酶；33～40 h為細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)期，此間糖耗速率減慢，溶氧回升，分批發(fā)酵結(jié)束，下罐后菌體干質(zhì)量為8.85 g/L，海藻糖轉(zhuǎn)化率為35.9%。

2.2 DO-stat流加控制培養(yǎng)方法

2.2.1 不同溶氧量對(duì)菌體干質(zhì)量的影響

從圖2可知，溶氧量對(duì)菌體干質(zhì)量影響較大，發(fā)酵初期即菌體生長(zhǎng)延遲期同分批發(fā)酵過程，控制不同溶氧水平后菌體生長(zhǎng)差異較大。30%溶氧條件下菌體生長(zhǎng)最快，明顯優(yōu)于20%、35%和40%這三個(gè)溶氧水平，發(fā)酵40 h時(shí)，菌體干質(zhì)量可達(dá)53.9 g/L。

圖2 不同溶氧量對(duì)菌體干質(zhì)量的影響Fig.2 Effect of different dissolved oxygen concentration on cell growth

2.2.2 不同溶氧量對(duì)海藻糖轉(zhuǎn)化率的影響

圖3 不同溶氧量下產(chǎn)生的海藻糖合成酶隨時(shí)間的變化曲線Fig.3 Change curve of trehalose synthase at different dissolved oxygen concentrations

由圖3可知，發(fā)酵對(duì)數(shù)中期約25 h時(shí)加入乳糖降溫誘導(dǎo)表達(dá)海藻糖合成酶，不同溶氧濃度下海藻糖合成酶的表達(dá)量呈現(xiàn)出明顯的差異。當(dāng)溶氧濃度控制在30%，發(fā)酵40 h時(shí)海藻糖轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到80.9%；溶氧濃度控制在20%、35%，發(fā)酵40 h時(shí)海藻糖轉(zhuǎn)化率分別為50.8%和39.8%；溶氧濃度控制在40%，發(fā)酵40 h時(shí)，其海藻糖轉(zhuǎn)化率最低，可能是發(fā)酵液中溶氧濃度過高或過低均不利于海藻糖合成酶的表達(dá)。

3 結(jié)論

通過DO-stat流加策略研究溶氧濃度20%、30%、35%和40%條件下大腸桿菌的生長(zhǎng)情況以及海藻糖合成酶的表達(dá)情況，結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵罐中溶氧濃度控制在30%，發(fā)酵40 h時(shí)，菌體干質(zhì)量可達(dá)53.9 g/L，是分批發(fā)酵（8.85 g/L）時(shí)的6倍，海藻糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到80.9%，是分批發(fā)酵（35.9%）時(shí)的2.25倍。重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖合成酶過程中采用DO-stat流加培養(yǎng)控制方式，一方面可以更好地控制溶氧濃度，滿足菌體生長(zhǎng)及代謝所需的溶氧水平，另一方面可以在較短的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)重組大腸桿菌的高密度高表達(dá)，為工業(yè)化生產(chǎn)海藻糖提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

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Research on trehalose synthase fermentation conditions based on DO-stat culture-feeding strategy

DUAN Yingying,CAO Dapeng,REN Feng,ZHANG Yuehui,ZHAO Wei*(Shangdong Fuyang Biotechnology Co.,Ltd.,Dezhou 253100,China)

Dissolved oxygen concentration has great effect on recombinantEscherichia coligrowth and high-efficiency expression of heterologous protein.In order to further increase the cell content and recombinantE.coliexpression,DO-stat feeding strategy was adopted.The effect of dissolved oxygen concentration(20%,30%,35%and 40%)onE.coligrowth and trehalose synthase expression were investigated respectively.Results showed that the cells dry mass reached 53.9 g/L,which was 6 times of those in fed-batch fermentation,the conversion rate of trehalose reached 80.9%,which was 2.25 times of those in fed-batch fermentation,when dissolved oxygen concentration was controlled at 30%for 40 h fermentation.

high density fermentation;DO-stat;trehalose synthase

TQ920.1

0254-5071（2017）01-0135-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.028

2016-08-10

段瑩瑩(1985-)，女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵。

*通訊作者：趙偉(1979-)，女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵。