王曉丹，王 婧，朱國軍，雷安亮，胡鵬剛，邱樹毅*

（1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽，550025；2.貴州珍酒釀酒有限責(zé)任公司，貴州遵義，563003；3.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽，550025；4.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽，550025）

醬香大曲中產(chǎn)四甲基吡嗪細菌的分離鑒定及其功能性研究

王曉丹1,3,4，王 婧1,4，朱國軍2，雷安亮2，胡鵬剛1,4，邱樹毅1,4*

（1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽，550025；2.貴州珍酒釀酒有限責(zé)任公司，貴州遵義，563003；3.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽，550025；4.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽，550025）

采用稀釋平板涂布法從醬香型白酒大曲中分離篩選出細菌菌株19株，模擬醬香型白酒生產(chǎn)發(fā)酵工藝，獲得2株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物具有濃郁醬香氣味的菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201。結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實驗和分子生物學(xué)方法，鑒定其為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。研究發(fā)現(xiàn)，菌株FBKL1.0199具有高產(chǎn)蛋白酶的特性，其中性蛋白酶活力達3 925.80 U/g，酸性蛋白酶活力也相對較高，達139.27 U/g。同時，利用固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201模擬白酒固態(tài)發(fā)酵的揮發(fā)性香味物質(zhì)進行分析，發(fā)現(xiàn)其中吡嗪類物質(zhì)相對含量較高，分別為46.01%和48.32%，且均以四甲基吡嗪為主，含量分別為44.11%和47.41%。分離得到的菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201可以作為產(chǎn)四甲基吡嗪的功能菌。

醬香；功能細菌；四甲基吡嗪

醬香型白酒中國白酒行業(yè)中的一大酒種，其獨特的釀造工藝、地理環(huán)境造就了醬香型白酒獨特的風(fēng)格特征。高溫制曲是醬香型酒特殊工藝之一，許多研究學(xué)者都認為高溫大曲中的香氣，是醬香型白酒中醬香氣的主要來源之一[1]。

四甲基吡嗪是白酒中的主要功能性成分之一，在不同香型白酒中普遍存在[2]，國內(nèi)外酒類的研究者也將這類物質(zhì)看成是構(gòu)成酒類風(fēng)味的重要成分之一。目前，在醬香型白酒中均檢測出較高濃度的吡嗪類物質(zhì)，其中以四甲基吡嗪為主，含量最高[3]。本實驗對醬香大曲中的細菌進行分離純化培養(yǎng)，旨在獲得產(chǎn)四甲基吡嗪的功能菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 大曲

醬香型大曲樣品：貴州某酒廠儲存6個月粉碎后的釀酒車間生產(chǎn)用曲。

1.1.2 試劑

細菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：上海捷瑞生物工程有限公司；其他所需試劑為市售分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0～7.2。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0～7.2。

V-P培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，葡萄糖5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0～7.2。

糖發(fā)酵試驗培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 3 g，NaHPO4·12H2O 2 g，0.2%溴麝香草酚藍溶液12 mL，1%糖，蒸餾水1 000 mL，pH7.4。

檸檬酸鹽試驗培養(yǎng)基：NaCl 5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，（NH4）2PO41 g，檸檬酸鈉5.0 g，K2HPO41g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，0.2%溴麝香草酚藍溶液40 mL，pH6.8。

淀粉營養(yǎng)培養(yǎng)基：牛肉膏2.0 g，蛋白17.5 g，淀粉1.5 g，瓊脂17.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0。

麩皮培養(yǎng)基[4]：麩皮15 g，15 mL水，攪拌均勻，121℃滅菌20 min。

高粱小麥固體發(fā)酵培養(yǎng)基[5]：分別稱取高粱與小麥各15 g，加入10 mL水，攪拌均勻，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

YS100光學(xué)顯微鏡：日本尼康株式會社；S-3400N掃描電鏡：HITACHI（日立）公司；UV-2550紫外可見分光光度計：日本島津公司；手動固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）裝置：美國Supelco公司；HP6890/5975C氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離純化

在無菌條件下稱取樣品大曲10 g，加入已滅菌的生理鹽水90 mL，搖床振蕩30 min混勻制備成菌懸液。再從中取菌懸液1 mL加入無菌生理鹽水，10倍稀釋，逐次稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，從不同稀釋倍數(shù)的菌懸液中取0.2 mL涂布接種于平皿上，其中10-4和10-7倍各做3個平行，10-5和10-6倍各做5個平行，35℃倒置培養(yǎng)1 d[6]。將平皿上長勢良好且菌落形態(tài)上有較大差異的細菌采用平板劃線法將其純化，然后接入固體斜面培養(yǎng)基上，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌株模擬固態(tài)發(fā)酵實驗

在無菌條件下，將菌株接到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，35℃倒置培養(yǎng)24 h后，然后從平板上的單菌落挑取一環(huán)移至液體培養(yǎng)基中，35℃搖床培養(yǎng)24 h制備成菌懸液。以10%的接種量將菌懸液加到高粱小麥固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，按照35℃→40℃→45℃→50℃→55℃的24 h梯度升溫靜置培養(yǎng)5 d[5]。對照組為接入不含細菌的液體培養(yǎng)液，培養(yǎng)方法相同。菌株固態(tài)發(fā)酵完成后，對其發(fā)酵產(chǎn)物從酸味、醬味和異味等三個方面進行感官評價，篩選出醬香味較濃郁的進行下一步實驗。

1.3.3 功能菌株的鑒定

菌株形態(tài)學(xué)觀察：將篩選出產(chǎn)醬香味較濃郁的細菌在平板上活化，再以點接法接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，觀察其單菌落形態(tài)。染色后顯微鏡觀察其菌體形態(tài)。

菌株生理生化實驗：按《伯杰氏細菌鑒定手冊》[7]及《一般細菌常用鑒定方法》[8]對細菌進行生理生化試驗。

菌株分子生物學(xué)鑒定：根據(jù)細菌DNA提取試劑盒說明書，采用細菌16S rDNA通用PCR引物27f（5′-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3′）和1 492r（5′-GGT-TACCTTGTTACGACTT-3′）進行擴增，在25.0 μL聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)體系中，加上、下游引物1 492r和27f各1.0 μL，Mix 12.5 μL，細菌DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR擴增條件為初始變性94℃、5 min，然后變性94℃、0.5 min，退火55℃、0.5 min，復(fù)性72℃、1.5 min，30個循環(huán)，最后延伸72℃、10 min。取2 μL DNA溶液于1%瓊脂糖凝膠100 V電泳40 min左右。

測序由上海生物工程有限公司完成，采用16S r DNA測序方法對菌株進行分子鑒定。所得測序結(jié)果輸入美國國家生物信息技術(shù)中心（national center of biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，用Neighbor-Joining構(gòu)建目標菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 菌株功能性研究實驗

產(chǎn)蛋白酶活性研究：模擬生產(chǎn)發(fā)酵工藝，將篩選出的菌株做菌種產(chǎn)蛋白酶性能實驗。先將菌株接到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，35℃倒置培養(yǎng)24 h后，從平板上的單菌落挑取一環(huán)移至液體培養(yǎng)基中，35℃搖床培養(yǎng)24 h制備成菌懸液。以10%的接種量將菌懸液加到麩皮培養(yǎng)基中。按照35℃、45℃、55℃，24 h梯度升溫靜置培養(yǎng)3 d[9]。稱取10 g固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物于250 mL三角瓶中，加入90 mL蒸餾水，40℃水浴鍋中水浴1 h，其中每隔15 min攪拌一次，經(jīng)濾紙過濾后獲得粗酶液。分別配制乙酸乙酸鈉緩沖液（pH 3.0）和磷酸緩沖液（pH 7.2），測定其酸性和中性蛋白酶活力。

1.3.5 測定方法

采用福林-酚法測蛋白酶活力，具體操作步驟參見商業(yè)行業(yè)標準SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》。

固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物GC-MS分析：取篩選出菌株經(jīng)模擬固態(tài)發(fā)酵后的發(fā)酵產(chǎn)物進行GC-MS分析，取樣品約1 g，置于4 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMSStableFlex纖維頭的手動進樣器，在100℃左右頂空萃取30 min取出，快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口（溫度250℃）中，熱解吸3 min進樣。

氣相色譜條件：色譜柱為ZB-5MSI5%Phenyl-95%Di-Methylpolysiloxane（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱，柱溫45℃（保留2 min），以4℃/min升溫至220℃，保持2 min；汽化室溫度250℃；載氣為高純He（99.999%）；柱前壓7.62psi，載氣流量1.0 mL/min；不分流進樣；溶劑延遲時間1.5 min。

質(zhì)譜檢測條件：電離方式為電子電離（electronic ionization，EI）源，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，電子能量70 eV，發(fā)射電流34.6 μA，倍增器電壓1 125 V，接口溫度280℃，質(zhì)量掃描范圍20～450 amu。

定性定量方法：對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist2005和Wiley275標準質(zhì)譜圖，確定了揮發(fā)性化學(xué)成分，用峰面積歸一化法測定了各化學(xué)成分的相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化

通過平板稀釋涂布法，從醬香大曲中分離得到19株菌落形態(tài)上有較大差異的細菌，所得結(jié)果如表1所示。

表1 細菌菌落形態(tài)描述Table 1 Morphological description of bacterial colonies

由表1可知，通過菌落觀察能夠得到19株形態(tài)有明顯區(qū)別的菌株，用于下一步固態(tài)發(fā)酵實驗的發(fā)酵菌株。

2.2 菌株模擬固態(tài)發(fā)酵實驗

菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物感官評定如表2所示。

由表2可知，細菌進行固態(tài)發(fā)酵完成后，經(jīng)感官初步評定篩選出醬香較突出的菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201進行后續(xù)實驗。

表2 菌株固態(tài)發(fā)酵感官評定結(jié)果Table 2 Sensory evaluation results of strains solid-state fermentation

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察

對篩選出的FBKL1.0199和FBKL1.0201以點接法接種進行培養(yǎng)，觀察其菌落形態(tài)，結(jié)果如圖1所示。菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201經(jīng)染色后，其細胞形態(tài)均為桿狀，如圖2所示。

圖1 菌株FBKL1.0199（A）和菌株FBKL1.0201（B）的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strain FBKL1.0199(A)and FBKL1.0201(B)

圖2 菌株FBKL1.0199（A）和菌株FBKL1.0201（B）細胞形態(tài)Fig.2 Cell morphology of strain FBKL1.0199(A)and FBKL1.0201(B)

2.3.2 生理生化實驗

菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201生理生化實驗結(jié)果如表3所示。

表3 菌株生理生化實驗結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical tests results of strains

由表3可知，菌株FBKL1.0199和菌株FBKL1.0201接觸酶反應(yīng)呈陽性，V-P實驗呈陽性，能利用葡萄糖、甘露糖產(chǎn)酸，可利用檸檬酸鹽，兼性厭氧。參照《伯杰細菌鑒定手冊》[7]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[8]，初步認定菌株FBKL1.0199和菌株FBKL1.0201為芽孢桿菌屬（Bacillussp.），利用分子生物學(xué)手段對其進行進一步的鑒定。

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定

采用16S rDNA測序方法對菌株FBKL1.0199和FBKL 1.0201菌株進行分子鑒定，對DNA進行序列擴增，擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR擴增片段長度約為1500bp。將所得測序結(jié)果輸入NCBI中進行BLAST比對，用Neighbor-Joining法構(gòu)建目標菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3，根據(jù)比對結(jié)果菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201與地衣芽孢桿菌相似性達到99%，結(jié)合菌落形態(tài)及生理生化實驗，將其鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

圖3 菌株FBKL1.0199、FBKL1.0201系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain FBKL1.0199 and FBKL1.0201

2.4 菌株功能性試驗

2.4.1 產(chǎn)蛋白酶活性研究

白酒生產(chǎn)中，蛋白酶是至關(guān)重要的一種酶，可將原料中的粗蛋白降解成各種氨基酸，使得大曲中的氨基酸種類和數(shù)量增多。豐富的氨基酸是微生物通過代謝合成四甲基吡嗪的前體物質(zhì)。同時，蛋白酶在白酒的釀造過程中可以促進微生物繁殖以及分解蛋白質(zhì)、降解微生物菌體蛋白等多種功能，高活力的蛋白酶可以提高白酒的產(chǎn)量和質(zhì)量[10-15]。因此對菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201進行產(chǎn)蛋白酶活性研究，其產(chǎn)酶活力如表4所示。

表4 蛋白酶活力測定結(jié)果Table 4 Determination results of protease activity

由表4可以看出，菌株FBKL1.0199其產(chǎn)蛋白酶能力優(yōu)于FBKL1.0201，兩株菌產(chǎn)中性蛋白酶的能力均優(yōu)于酸性蛋白酶，菌株FBKL1.0199中性蛋白酶活力高達3 925.80 U/g，酸性蛋白酶活力也相對較高，達139.27 U/g，菌株FBKL 1.0199具有高產(chǎn)蛋白酶的特性。

2.4.2 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物GC-MS分析

對菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201進行了模擬發(fā)酵實驗，通過固相微萃取與GC-MS聯(lián)用技術(shù)，對其發(fā)酵產(chǎn)物的揮發(fā)性香味成分進行了測定，其檢測結(jié)果如圖4、表5和表6所示。

圖4 菌株FBKL1.0199（A）和菌株FBKL1.0201（B）發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.44 Totalion chromatograms of volatile components in fermentation products of strain FBKL1.0199(A) and FBKL1.0201 (B) by GC-MS

由圖4A、表5可知，菌株FBKL1.0199發(fā)酵產(chǎn)物中，吡嗪類化合物相對百分含量最高，達到了46.01%，其中以四甲基吡嗪為主，含量為44.11%。其次是酮類化合物，含量為29.95%，其中以3-羥基-2-丁酮（乙偶姻）為主，含量為19.547%。醇類化合物百分含量為13.27%，以1,3-丁二醇為主，含量為10.814%。酚類物質(zhì)含量為2.57%，醛類物質(zhì)含量為0.50%，酯類物質(zhì)含量為0.22%，沒有酸類物質(zhì)，還有一些其他的烷烴類和雜環(huán)類和未測定出的化合物，總含量為7.48%。

表5 菌株FBKL1.0199發(fā)酵產(chǎn)物GC-MS成分分析結(jié)果Table 5 Analysis results of components in the fermentation products of strain FBKL1.0199 by GC-MS

由圖4B、表6可知，菌株FBKL1.0201發(fā)酵產(chǎn)物所測揮發(fā)性成分中，吡嗪類化合物含量最高，達48.32%，以四甲基吡嗪為主，含量達47.41%。其次是酮類物質(zhì)，含量為30.42%，以2,3-戊二酮主，含量達21.75%，乙偶姻含量僅為0.172%。醇類物質(zhì)含量為10.98%，2,3-丁二醇和1,3-丁二醇為主。酚類物質(zhì)含量為1.71%。其他物質(zhì)占6.34%。

表6 菌株FBKL1.0201發(fā)酵產(chǎn)物GC-MS成分分析結(jié)果Table 6 Analysis results of components in the fermentation products of strain FBKL1.0201 by GC-MS

綜合以上結(jié)果，菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性成分中吡嗪類物質(zhì)含量都較高，均以四甲基吡嗪為主。結(jié)合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物感官評價，其發(fā)酵產(chǎn)物醬香濃郁，因此，可將菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201作為重要的產(chǎn)四甲基吡嗪功能菌。

3 結(jié)論

通過稀釋涂布法，從醬香大曲中分離得到19株菌落形態(tài)上有較大差異的細菌。模擬醬香型白酒生產(chǎn)發(fā)酵工藝，通過梯度升溫發(fā)酵，獲得兩株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物具有濃郁醬香氣味的菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201。結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實驗和分子生物學(xué)方法，鑒定其為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201產(chǎn)蛋白酶活性研究發(fā)現(xiàn)，兩株菌產(chǎn)中性蛋白酶的能力均優(yōu)于酸性蛋白酶。菌株FBKL1.0199中性蛋白酶活力高達3 925.80 U/g，酸性蛋白酶活力也相對較高，達139.27 U/g，菌株FBKL1.0199具有高產(chǎn)蛋白酶的特性。菌株FBKL1.0201中性蛋白酶活力達1 377.23 U/g，不產(chǎn)酸性蛋白酶。

對菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中的揮發(fā)性成分采用GC-MS檢測，發(fā)現(xiàn)其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中吡嗪類物質(zhì)相對含量非常高，以四甲基吡嗪為主。同時，結(jié)合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物感官評價，其發(fā)酵產(chǎn)物醬香濃郁，這與醬香型白酒中醬香風(fēng)味的特征性成分以吡嗪類等物質(zhì)為主的說法相符。

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Isolation and identification of functional bacteria with high yield of tetramethyl pyrazine from Moutai-flavor high-temperatureDaqu

WANG Xiaodan1,3,4,WANG Jing1,4,ZHU Guojun2,LEI Anliang2,HU Penggang1,4,QIU Shuyi1,4*(1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.Guizhou Zhenjiu Brewing Co.,Ltd.,Zunyi 563003,China;3.School of Life Sciences,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 4.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

By the methods of spread plate from Moutai-flavor high-temperatureBaijiu Daqu,19 bacterial strains were isolated and screened.Two strains of FBKL1.0199 and FBKL1.0201 with rich Moutai-flavor were obtained by simulation of the Moutai-flavorBaijiu(liquor)fermentation process.Combining with the morphology,physiology of strain with biochemical and molecular biology,the strain was identified asBacillus licheniformis.It was found that strain FBKL1.0199 had the characteristics of high yield protease,the protease activity was as high as 3 925.80 U/g, and the acid protease activity was also relatively high,reaching 139.27 U/g.At the same time,the volatile flavor compounds produced by strains FBKL1.0199 and FBKL1.0201 were analyzed using HS-SPME and GC-MS.Results showed that the fermentation products had high relative content of pyrazine compounds,which was 46.01%and 48.32%,respectively.The primary components were tetramethyl pyrazine,and the contents were 44.11%and 47.41%,the strains FBKL1.0199 and FBKL1.0201 can be used as the functional bacteria for tetramethyl pyrazine production.

Moutai-flavor;functional bacteria;tetramethyl pyrazine

TS261.1

0254-5071（2017）01-0055-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.011

2016-02-10

貴州省工業(yè)攻關(guān)項目（黔科合GZ字[2014]3012）；貴州省省校合作計劃項目（黔科合LH字[2014]7672）

王曉丹（1980-），女，工程師，博士，研究方向為應(yīng)用生物技術(shù)。

*通訊作者：邱樹毅（1963-），男，教授，博士，研究方向為應(yīng)用生物技術(shù)。