盧 敏 黃珊萍 鄭林媚 許 艷

(海南省人民醫(yī)院產(chǎn)科，?？?70311)

ADMA/NOS/NO/cGMP通路系統(tǒng)在子癇前期患者母胎界面的表達(dá)及意義①

盧 敏 黃珊萍 鄭林媚 許 艷

(海南省人民醫(yī)院產(chǎn)科，?？?70311)

目的：探討ADMA/NOS/NO/cGMP通路系統(tǒng)在子癇前期患者母胎界面的表達(dá)及意義。方法：分別選取重度子癇前期、輕度子癇前期、妊娠期高血壓患者各20例，另選同期行剖宮產(chǎn)的單胎初產(chǎn)健康妊娠婦女20例作為對(duì)照。檢測(cè)并比較各組胎盤(pán)組織NO和cGMP水平、總NOS活性，免疫組化SP法檢測(cè)胎盤(pán)組織eNOS和iNOS表達(dá)。高效液相色譜法檢測(cè)各組臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)內(nèi)ADMA水平。結(jié)果：重度、輕度子癇前期組胎盤(pán)組織NO水平分別為(7.6±3.6) μmol/g、(11.4±4.3) μmol/g，均顯著低于對(duì)照組(均P<0.05)；重度、輕度子癇前期組胎盤(pán)組織cGMP水平分別為(3.26±0.31)pmol/g、(4.53±0.42)pmol/g，均顯著低于對(duì)照組(均P<0.05)，且4組胎盤(pán)組織cGMP水平與NO水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.672)；重度、輕度子癇前期組胎盤(pán)組織總NOS活性分別為(10.4±3.0)、(14.8±1.6 )U/mg蛋白質(zhì)，顯著低于對(duì)照組(均P<0.05)，4組胎盤(pán)組織總NOS活性與NO水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.785)；重度、輕度子癇前期組胎盤(pán)組織eNOS表達(dá)顯著低于對(duì)照組(均P<0.05)，重度子癇前期組iNOS表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；重度子癇前期、輕度子癇前期及妊娠期高血壓3組HUVECs內(nèi)ADMA水平均顯著高于對(duì)照組(均P<0.05)，且4組患者HUVECs內(nèi)ADMA水平與胎盤(pán)組織NO水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.582)。結(jié)論：ADMA/NOS/NO/cGMP通路系統(tǒng)可能在子癇前期的發(fā)病中起重要作用。

子癇前期；非對(duì)稱(chēng)二甲基精氨酸；一氧化氮合酶；一氧化氮；環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷

子癇前期(Preeclampsia,PE)是妊娠期特有的疾病，威脅母嬰健康。在各種發(fā)病機(jī)制中，免疫遺傳因素，特別是母胎界面的免疫耐受異常是目前的研究熱點(diǎn)[1]。一氧化氮(Nitric oxide,NO)是最重要的內(nèi)源性血管舒張因子，NO彌散進(jìn)入血管平滑肌細(xì)胞后，可激活產(chǎn)生環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)，啟動(dòng)一系列胞內(nèi)生物學(xué)過(guò)程。一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,NOS)和其主要內(nèi)源性抑制物非對(duì)稱(chēng)二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine,ADMA)在調(diào)節(jié)NO的表達(dá)和活性方面起重要作用。本篇通過(guò)研究子癇前期患者ADMA/NOS/NO/cGMP通路系統(tǒng)的表達(dá)，探討該通路在子癇前期發(fā)病中的作用和意義，以及免疫遺傳因素在其中所起的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2015年12月在本院產(chǎn)科住院并符合入組條件的孕婦60例，按分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)分為3組，每組20例。入組條件：符合相應(yīng)診斷標(biāo)準(zhǔn)，單胎初產(chǎn)婦，剖宮產(chǎn)終止妊娠，排除標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性高血壓、肝腎疾病、心臟疾病，急性炎癥、糖尿病等合并癥，胎盤(pán)早剝、前置胎盤(pán)等病理妊娠。A組為重度子癇前期組；B組為輕度子癇前期組；C組妊娠期高血壓組。另選行剖宮產(chǎn)分娩的單胎初產(chǎn)健康妊娠婦女20例作為對(duì)照組(N組)。診斷和分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)按人民衛(wèi)生出版社第七版《婦產(chǎn)科學(xué)》。4組在年齡、孕周等方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組病例均為海南地區(qū)漢族居民，無(wú)異族通婚史。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)同意，研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本采集與準(zhǔn)備 胎盤(pán)標(biāo)本：胎盤(pán)娩出后即刻取胎盤(pán)母體面組織2塊(重分別為10 g、2 g)，冷鹽水沖洗，其中1塊(10 g)濾紙吸干后準(zhǔn)確稱(chēng)重，置勻漿機(jī)中按比例制成10%的組織勻漿，2 000 r/min低溫離心20 min后取上清液，置凍存管中-80℃保存；另1塊置10%福爾馬林溶液中固定備用。臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)：無(wú)菌狀態(tài)下獲取18～20 cm新生兒臍帶，置4℃滅菌含雙抗的PBS溶液中，4 h內(nèi)參照常規(guī)方法[2]分離HUVECs，然后將其凍存于液氮備用。

1.2.2 NO檢測(cè) 采用Griess法測(cè)定胎盤(pán)組織勻漿NO水平。按照NO檢測(cè)試劑盒(南京建成)說(shuō)明，測(cè)定管依次加入待測(cè)10%胎盤(pán)組織勻漿上清液、反應(yīng)液振蕩混勻，37℃水浴反應(yīng)15 min，再加入終止液，紫外分光光度儀在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。然后根據(jù)公式計(jì)算出NO2-含量，以此來(lái)反映胎盤(pán)組織NO水平。

1.2.3 cGMP檢測(cè) 取待測(cè)10%胎盤(pán)組織勻漿，用放射免疫法按照cGMP試劑盒(南京建成)說(shuō)明，測(cè)定NO的第二信使cGMP水平。

1.2.4 胎盤(pán)組織總NOS活性測(cè)定 采用Griess法測(cè)定胎盤(pán)組織勻漿NO水平，此即間接代表胎盤(pán)組織總NOS活性。按照NOS檢測(cè)試劑盒(南京建成)要求，測(cè)定管依次加入10%胎盤(pán)組織勻漿上清液、反應(yīng)液振蕩混勻，37℃水浴反應(yīng)15 min，再加入終止液，分光光度儀在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。BCA蛋白定量試劑盒(Hycline,USA)測(cè)定組織勻漿上清液的蛋白含量。酶的活性定義為每毫克組織蛋白每分鐘生成的1 nmol NO為一個(gè)活性單位。

1.2.5 胎盤(pán)組織eNOS和 iNOS的表達(dá) 采用免疫組化SP法。取各組胎盤(pán)標(biāo)本，包埋、切片、脫蠟，3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性酶，修復(fù)抗原，加山羊封閉血清，滴加一抗(eNOS 1∶150，iNOS 1∶100)，漂洗后依次添加生物素標(biāo)記二抗(羊抗兔IgG)和SABC試劑，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。結(jié)果判定：參照Fromowitz[3]綜合計(jì)分法，以胞漿出現(xiàn)明顯的棕褐色顆粒或胞漿呈棕褐色為陽(yáng)性，無(wú)著色或與背景顏色一致為陰性；隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，得出陽(yáng)性細(xì)胞百分率并計(jì)分，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，陽(yáng)性細(xì)胞占1～25%為1分，26～49%為2分，≥50%為3分；并根據(jù)多數(shù)細(xì)胞的著色強(qiáng)度計(jì)算強(qiáng)度得分，無(wú)著色0分，淺棕褐色為1分，棕褐色為2分，深棕褐色為3分；陽(yáng)性率和強(qiáng)度計(jì)分相乘的結(jié)果:0～1分為(-)，2分為(+)，3～4分為(++)，6分為(+++)，9分(++++)。

1.2.6 測(cè)定HUVECs內(nèi)ADMA水平 取HUVECs解凍復(fù)蘇后，培養(yǎng)傳代，鏡下觀(guān)察細(xì)胞貼壁后，消化收集細(xì)胞，離心后取沉淀，加入同體積細(xì)胞裂解液，加入5-磺基水楊酸沉淀蛋白，混勻后離心，取上清液，用高效液相色譜(High-performance liquid chromatography,HPLC)法測(cè)定ADMA水平(HPLC系統(tǒng)：LC-10Advp；色譜柱：Nova-Pak C18)。取10 μl待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma，USA)加入100 μl衍生試劑混勻，室溫下反應(yīng)3 min后進(jìn)樣分析。然后用線(xiàn)性梯度洗脫的方式將樣品從色譜柱中洗脫，經(jīng)預(yù)柱處理后，用熒光檢測(cè)器對(duì)其及內(nèi)標(biāo)ADMA進(jìn)行檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)338nm；吸收波長(zhǎng)425nm)，并比較各組HUVECs內(nèi)ADMA水平。

2 結(jié)果

2.1 4組患者胎盤(pán)組織中NO和cGMP濃度水平 重度子癇前期(A)組、輕度子癇前期(B)組患者胎盤(pán)組織NO水平分別為(7.6±3.6) μmol/g、(11.4±4.3) μmol/g，均顯著低于對(duì)照(N)組(18.3±3.5) μmol/g(t=2.633、3.857，均P<0.05)。A、B組患者胎盤(pán)組織cGMP水平分別為(3.26±0.31)pmol/g、(4.53±0.42)pmol/g，均顯著低于N組(7.26±0.31)pmol/g(t=2.846、3.824，均P<0.05)。4組胎盤(pán)組織中cGMP水平與NO水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.672)。見(jiàn)表1。

2.2 4組患者胎盤(pán)組織總NOS活性測(cè)定 重度子癇前期(A)組胎盤(pán)組織總NOS活性為(10.4±3.0) U/mg蛋白質(zhì)，輕度子癇前期(B)組為(14.8±1.6)U/mg蛋白質(zhì)，妊娠期高血壓(C)組為(17.8±1.6)U/mg，A、B組胎盤(pán)組織總NOS活性顯著低于對(duì)照(N)組(t=3.157、2.352，均P<0.05)，A組胎盤(pán)組織總NOS活性也顯著低于B組(t=2.136，P<0.05)，見(jiàn)圖1。4組胎盤(pán)組織總NOS活性與NO水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.785)。

2.3 4組患者胎盤(pán)組織eNOS和iNOS的表達(dá) 免疫組化切片顯示4組胎盤(pán)絨毛血管內(nèi)皮細(xì)胞、絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的胞漿中均可見(jiàn)eNOS和iNOS抗原的陽(yáng)性表達(dá)。4組胎盤(pán)絨毛血管內(nèi)皮細(xì)胞中的eNOS表達(dá)明顯強(qiáng)于合體滋養(yǎng)細(xì)胞，而iNOS在絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)較其他細(xì)胞更明顯(尤其是重、輕度子癇前期組)。重度子癇前期(A)組、輕度子癇前期(B)組胎盤(pán)組織的eNOS表達(dá)明顯弱于對(duì)照(N)組(χ2=14.29、9.69，P<0.05)，見(jiàn)表2。N組、B組及妊娠期高血壓(C)組胎盤(pán)各部分組織中iNOS表達(dá)均較弱，A組的iNOS表達(dá)顯著強(qiáng)于N組(χ2=13.28，P<0.05)，見(jiàn)表3。

GroupsnNO(μmol/g)cGMP(pmol/g)Agroup2076±361)326±0311)Bgroup20114±431)453±0421)Cgroup20138±26586±025Ngroup20183±35726±031

Note：Compared to N group，1)P<0.05.

2.4 4組HUVECs內(nèi)ADMA水平測(cè)定 重度子癇前期(A)組、輕度子癇前期(B)組及妊娠期高血壓(C)組3組HUVECs內(nèi)ADMA水平分別為(3.91±0.27)、(3.08±0.31)、(2.46±0.26 ) μmol/L，與對(duì)照(N)組比較均有顯著性差異(t=4.542、3.815、2.808，均P<0.05)，見(jiàn)表4。4組患者HUVECs內(nèi)ADMA水平與胎盤(pán)組織NO水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.582)。

圖1 4組胎盤(pán)組織總NOS活性比較Fig.1 Activities of total NOS in placenta of four groupsNote: Compared to N group，△.P<0.05.

表2 4組胎盤(pán)組織eNOS表達(dá)比較

Tab.2 Expression of eNOS in placenta of four groups

Groupsn-++++++++++Agroup1)2067520Bgroup1)2038540Cgroup2024662Ngroup2003683

Note：Compared to N group,1)P<0.05.

表3 4組胎盤(pán)組織iNOS表達(dá)比較

Tab.3 Expression of iNOS in placenta of four groups

Groupsn-++++++++++Agroup1)2013592Bgroup2065720Cgroup2069320Ngroup2078410

Note：Compared to N group,1)P<0.05.

GroupsnADMA(μmol/L)Agroup20391±0271)Bgroup20308±0311)Cgroup20246±0261)Ngroup20136±012

Note：Compared to N group,1)P<0.05.

3 討論

子癇前期的基本病理變化是全身小血管痙攣，血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活與損傷，以及各組織、器官灌流量減少。關(guān)于其病因和發(fā)病機(jī)理，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究[4,5]，認(rèn)為可能與遺傳易感性、免疫失衡、胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞缺血缺氧等原因有關(guān)。其中免疫學(xué)說(shuō)和遺傳學(xué)說(shuō)相互影響和滲透，逐漸形成了免疫遺傳學(xué)說(shuō)[6,7]，并以免疫遺傳因素，特別是母胎界面的免疫耐受異常作為子癇前期發(fā)病的起始因子。我們推測(cè)由于母胎界面的免疫耐受異常導(dǎo)致ADMA/NOS/NO/cGMP通路表達(dá)的改變，造成胎盤(pán)血管舒縮機(jī)制的紊亂，胎盤(pán)微小血管痙攣或收縮，最終出現(xiàn)子癇前期的病理生理改變。

NO是最重要的內(nèi)源性血管舒張因子，廣泛存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，它能抑制血管疾病的關(guān)鍵步驟[8,9]，如白細(xì)胞黏附、血小板聚集、血管平滑肌細(xì)胞增生等，也能抑制內(nèi)皮素等縮血管物質(zhì)的分泌，在穩(wěn)定內(nèi)皮功能、調(diào)節(jié)母體和胎兒胎盤(pán)循環(huán)中都起重要作用[10]。內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，NO合成不足時(shí)，血管收縮、血壓升高、內(nèi)皮功能不全、血小板聚集、血管平滑肌細(xì)胞增生，與子癇前期的病理生理改變極為類(lèi)似。NO彌散進(jìn)入血管平滑肌細(xì)胞后，可通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生cGMP，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)一系列蛋白磷酸化反應(yīng)，發(fā)揮舒張血管、調(diào)節(jié)血壓、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞等廣泛的生理作用[11]。本研究驗(yàn)證了子癇前期患者胎盤(pán)組織中NO水平顯著降低，其降低程度與子癇前期病情輕重密切相關(guān)，且胎盤(pán)組織中的cGMP水平與NO水平呈正相關(guān)關(guān)系。

NOS作為NO生成唯一、關(guān)鍵的限速因子[12]，它和其抑制物對(duì)NO生物學(xué)功能的發(fā)揮起著重要的作用。胎盤(pán)是妊娠時(shí)內(nèi)源性NO合成的主要場(chǎng)所，含有大量具有NOS活性的滋養(yǎng)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞。NOS有三個(gè)亞型[13]，分別為內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)，nNOS和eNOS通常參與生理狀態(tài)下NO生成，而iNOS病理狀態(tài)下可在細(xì)胞因子、免疫炎癥等因素作用下產(chǎn)生大量iNOS，進(jìn)而生成過(guò)量的NO發(fā)揮毒性效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示妊娠期高血壓組、輕度子癇前期組、重度子癇前期組胎盤(pán)組織總NOS活性均低于對(duì)照組，且活性依次下降，提示NOS活性降低程度可能與子癇前期病情輕重相關(guān)。免疫組化分別研究eNOS和iNOS表達(dá)，結(jié)果顯示：重度、輕度子癇前期組胎盤(pán)組織中eNOS的表達(dá)均較對(duì)照組明顯下降，推測(cè)子癇前期時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞受損，eNOS活性降低；而重度子癇前期組胎盤(pán)組織iNOS表達(dá)顯著高于對(duì)照組，提示免疫炎癥因素可能參與子癇前期的發(fā)病過(guò)程。我們推測(cè)可能是子癇前期時(shí)母胎界面的免疫耐受狀態(tài)異常，免疫細(xì)胞或因子等被異常激活所致。

ADMA是主要的內(nèi)源性NOS抑制物，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，其在局部組織和細(xì)胞內(nèi)濃度遠(yuǎn)高于血漿中[14]，所以本實(shí)驗(yàn)僅檢測(cè)HUVECs內(nèi)ADMA 水平，以判斷其對(duì)胎盤(pán)組織NOS活性的抑制程度，研究結(jié)果顯示重度、輕度子癇前期組及妊娠期高血壓組3組HUVECs內(nèi)ADMA水平均顯著高于對(duì)照組，且HUVECs內(nèi)ADMA水平與胎盤(pán)組織NO水平呈負(fù)相關(guān)，表明ADMA水平變化可能與子癇前期的發(fā)病有關(guān)，且其變化程度與病情輕重相關(guān)。ADMA可以通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)eNOS活性，減少NO生成，影響內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張功能，被認(rèn)為是子癇前期早期的預(yù)測(cè)標(biāo)志[15]。

有關(guān)研究顯示子癇前期患者體內(nèi)ADMA水平升高與胎盤(pán)組織中ADMA水解酶，即二甲基精氨酸二甲胺水解酶(Dimethylarginine dimethylaminohyd-rolase,DDAH)低表達(dá)有關(guān)[16]，胎盤(pán)組織中DDAH表達(dá)下降，通過(guò)調(diào)節(jié)ADMA代謝，影響eNOS活性，導(dǎo)致NO合成減少。人類(lèi)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)是參與移植免疫應(yīng)答調(diào)控的最主要基因系統(tǒng)。而DDAH基因恰好位于MHC Ⅲ區(qū)域，有可能在調(diào)節(jié)宿主防御反應(yīng)和免疫耐受中發(fā)揮重要作用。妊娠是一個(gè)半同種異體移植過(guò)程，胎兒攜帶父源性基因，卻不被母體免疫細(xì)胞識(shí)別，此過(guò)程有賴(lài)于母胎間的免疫耐受，而此免疫耐受異常，則可能引起子癇前期等病理妊娠。

據(jù)此，我們推測(cè)母胎界面的免疫耐受異常導(dǎo)致位于MHC區(qū)域的DDAH基因異常表達(dá)和活性改變，通過(guò)影響體內(nèi)ADMA的濃度，調(diào)節(jié)NOS活性及NO、cGMP水平，從而改變胎盤(pán)和全身微小血管的緊張性和內(nèi)皮細(xì)胞功能，造成子癇前期相關(guān)病理生理改變。綜上所述，ADMA/NOS/NO/cGMP通路系統(tǒng)可能在子癇前期病因和發(fā)病機(jī)理中的起著重要作用。今后，有待進(jìn)一步明確DDAH的表達(dá)和調(diào)控機(jī)制，以完善該通路理論。

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[收稿2016-07-24 修回2016-10-10]

(編輯 張曉舟)

Expression and significance of ADMA/NOS/NO/cGMP pathway in maternal-fetal interface of patients with preeclampsia

LUMin,HUANGShan-Ping,ZHENGLin-Mei,XUYan.

DepartmentofObstetrics,HainanGeneralHospital,Haikou570311,China

Objective:To study the expression and significance of ADMA/NOS/NO/cGMP pathway in the maternal-fetal interface of patients with preeclampsia.Methods: 60 patients were selected and divided into severe preeclampsia group,mild preeclampsia group and gestational hypertensive group according to the disease condition,meanwhile 20 healthy pregnant women of singleton receiving cesarean section were chosen as control group.Levels of NO and cGMP in placenta of the four groups were detected and compared,and activities of total NOS in placenta were measured and compared.The expression of eNOS and iNOS in placental tissue was detected by immunohistochemistry SP method.High-performance liquid chromatography was used to detect the level of ADMA in HUVECs.Results: The levels of NO in placenta of severe and mild preclampsia groups were (7.6±3.6) and (11.4±4.3) μmol/g,which were statistically significantly lower than that in control group(P<0.05).The levels of cGMP in placenta of severe and mild preclampsia groups were (3.26±0.31) and (4.53±0.42)pmol/g,which were aslo significantly lower than that in control group(P<0.05).In the four groups,the level of cGMP in placenta was positively correlated with the level of NO in placenta(r=0.672).The activities of total NOS in placenta of severe and mild preeclampsia groups were (10.4±3.0)and (14.8±1.6)U/mg protein,which were statistically significantly lower than that in control group(P<0.05).In placenta of the four groups,the activity of total NOS was positively correlated with the level of NO(r=0.785).The expression of eNOS in placenta of severe and mild preeclampsia groups was statistically significantly lower than that in control group(P<0.05),the expression of iNOS in severe preeclampsia group was significantly higher than that in the control group(P<0.05).The levels of ADMA in HUVECs of severe preeclampsia group,mild preeclampsia group and gestational hypertensive group were statistically significantly higher than that in the control group(P<0.05).The level of ADMA in HUVECs was negatively correlated with the level of NO in placenta of the four groups(r=-0.582).Conclusion: ADMA/NOS/NO/cGMP pathway may play an important role in the pathogenesis of preeclampsia.

Preeclampsia；Asymmetric dimethylarginine；Nitric oxide synthase；Nitric oxide；cGMP

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.019

①本文受海南省自然科學(xué)基金(瓊科814320)、海南省衛(wèi)生廳普通科研項(xiàng)目(瓊衛(wèi)13A210303)資助。

盧 敏(1978年-)，女，碩士，副主任醫(yī)師， 主要從事病理產(chǎn)科基礎(chǔ)與臨床研究，E-mail： qiyoufei@aliyun.com。

R714.7

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1000-484X(2017)01-0094-05