陶安福 何 磊 張子寧 傅雅靜 劉 靜 胡清海 姜擁軍

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科 衛(wèi)生部艾滋病免疫學(xué)重點實驗室，沈陽110001)

HIV感染者T細(xì)胞NKG2C/NKG2A表達(dá)及與疾病進展關(guān)系研究①

陶安福 何 磊 張子寧 傅雅靜 劉 靜 胡清海 姜擁軍②

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科 衛(wèi)生部艾滋病免疫學(xué)重點實驗室，沈陽110001)

目的：研究HIV慢性感染者和HARRT治療者T細(xì)胞NKG2C/NKG2A受體的表達(dá)變化，探討其與疾病進展的關(guān)系。方法：選取HIV慢性感染者、接受HAART治療的HIV感染者以及健康人的外周血細(xì)胞，通過熒光抗體染色，利用流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞上表達(dá)的NKG2C/NKG2A受體。結(jié)果：HIV慢性感染者NKG2C+T細(xì)胞，NKG2A+T細(xì)胞和NKG2C+NKG2A-T細(xì)胞百分比明顯高于健康對照組 (P=0.025、P=0.032、P=0.029)，HARRT治療組則明顯低于HIV慢性感染者(P=0.033、P=0.037、P=0.018)，恢復(fù)到正常水平，與健康對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。HIV慢性感染者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞絕對數(shù)和表達(dá)NKG2A、NKG2C+NKG2A+和NKG2C-NKG2A+的T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)(r=-0.697,P<0.000 1；r=-0.463,P=0.015；r=-0.693,P<0.000 1)，HIV慢性感染者外周血T細(xì)胞上表達(dá)的NKG2C與NKG2A的比值與CD4+T淋巴細(xì)胞絕對數(shù)呈正相關(guān)(r=0.476,P=0.012)。結(jié)論：HIV感染者T細(xì)胞表面NKG2C和NKG2A的表達(dá)研究具有重要意義，為HIV感染的臨床預(yù)后評估提供科學(xué)依據(jù)。

HIV感染者；T細(xì)胞；NKG2C；NKG2A

獲得性免疫缺陷綜合征，又稱艾滋病(Acquired immune deficiency syndrome，AIDS)，是由人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染所引起的一種免疫缺陷性疾病，患者以CD4+T細(xì)胞減少為主要特征，同時伴有反復(fù)機會感染、惡性腫瘤及中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，最終導(dǎo)致死亡，對人類的健康造成了極大威脅[1]。胸腺依賴性淋巴細(xì)胞(Thymus dependent lymphocyte)， 又稱 T 細(xì)胞，是來自胚肝或骨髓的始祖 T 淋巴細(xì)胞且在胸腺內(nèi)完成分化發(fā)育和成熟。T 細(xì)胞表面分布一定數(shù)量的T 細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)，用于特異性識別抗原或者輔助相關(guān)功能[2]。NKG2家族屬于C型凝集素家族，包括了NKG2A、NKG2C、NKG2E和NKG2D/F等[3,4]，分布于部分T細(xì)胞和NK細(xì)胞上。這些NKG2受體既有抑制性受體NKG2A/B，又有活化性受體NKG2C、NKG2D和NKG2E。其中NKG2A/B可與CD94形成二聚體，發(fā)揮抑制性作用；NKG2C和NKG2E與CD94、DAP12連接后形成活化性受體，傳遞活化性信號，增強細(xì)胞的殺傷能力[5]。

目前關(guān)于HIV慢性感染者和HARRT治療者T細(xì)胞上NKG2A/NKG2C的研究和報道較少，尚無和疾病進展關(guān)系的研究報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 本實驗共收集了70例受試對象，包括27例HIV慢性感染者(Chronically HIV infection,CHI)，21例HIV感染后進行HARRT治療者以及22例健康對照者(HIV-negative normal control,NC)。健康對照者符合以下標(biāo)準(zhǔn)方可入組：HIV抗體陰性、無免疫系統(tǒng)疾病、血常規(guī)及肝功檢查正常、乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗體陰性。

1.1.2 主要試劑和儀器 單克隆熒光抗體：CD3-FITC(美國BD公司)，NKG2A-PE和NKG2C-APC(美國R&D公司)，溶血素(乙二胺四乙酸二鈉0.037 g、氯化銨8.25 g、碳酸氫鉀1.0 g、去離子水1 000 ml)，流式細(xì)胞儀：FACS Calibur和 FACS Aria(美國BD公司)

1.2 方法

1.2.1 CD4+T細(xì)胞絕對值檢測 CD4+T細(xì)胞絕對值檢測參照1997 年美國疾病預(yù)防控制中心制定的指導(dǎo)方法，應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)進行檢測，使用MultiSET軟件分析得出CD4+T淋巴細(xì)胞絕對值。

1.2.2 HIV病毒載量測定 HIV病毒載量測定使用標(biāo)準(zhǔn)版模板制備法，提取500 μl血漿中的RNA，在COBAS AMPLICOR自動載量儀上采用Roche公司HIV-1 Monitor 1.5試劑盒以RT-PCR方法檢測病毒載量，最低檢測限是400 copies/ml。

1.2.3 外周血T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)及細(xì)胞表面NKG2A、NKG2C受體的檢測 應(yīng)用熒光抗體CD3-FITC(美國BD公司)/NKG2A-PE(美國R&D公司)/NKG2C-APC(美國R&D公司)，加入100 μl EDTA抗凝全血，室溫條件下避光 30 min。加入溶血素3 ml，室溫條件下避光 8 min；洗滌3次，最后加入200 μl含有1%多聚甲醛固定液，應(yīng)用FACS Aria流式細(xì)胞儀上機進行檢測，采用BD FACS DivaTM軟件分析實驗結(jié)果。畫門策略見圖1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS20.0軟件包進行統(tǒng)計分析，全部數(shù)據(jù)采用中位數(shù)表示，采用Mann-WhitneyU檢驗進行各組間的實驗指標(biāo)比較，采用Spearman秩相關(guān)檢驗進行相關(guān)性分析，P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T細(xì)胞上表達(dá)的NKG2C和NKG2A在健康對照者、HIV慢性感染者和HARRT治療者的變化 我們檢測受試對象外周血T細(xì)胞上表達(dá)的NKG2C和NKG2A受體，結(jié)果顯示T細(xì)胞上表達(dá)的NKG2C受體在CHI組有顯著性升高(P=0.025)，HARRT組經(jīng)過治療后出現(xiàn)顯著性下降(P=0.033)。T細(xì)胞上表達(dá)的NKG2A受體在CHI組比健康對照組有顯著升高(P=0.032)，經(jīng)過治療后的HARRT組出現(xiàn)明顯下降，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.037)。我們將NKG2C和NKG2A受體組合起來，觀察在不同人群中的分布情況，發(fā)現(xiàn)CHI組NKG2C+NKG2A-T細(xì)胞出現(xiàn)顯著性升高(P=0.029)，HARRT組經(jīng)過治療后出現(xiàn)明顯下降，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.018)，見圖2。

2.2 HIV慢性感染者外周血T細(xì)胞上表達(dá)的NKG2C和NKG2A受體與CD4+T細(xì)胞數(shù)量的相關(guān)性 為了觀察HIV慢性感染者外周血T細(xì)胞上表達(dá)的NKG2C和NKG2A受體與疾病進展的關(guān)系，本實驗統(tǒng)計了HIV慢性感染者的CD4+T淋巴細(xì)胞絕對數(shù)和病毒載量，并分別和外周血T細(xì)胞上表達(dá)的NKG2C和NKG2A受體進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示外周血CD4+T細(xì)胞數(shù)量和T細(xì)胞上表達(dá)的NKG2A受體百分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.697,P<0.000 1)，進一步觀察NKG2C和NKG2A受體組合的表達(dá)情況，結(jié)果顯示表達(dá)NKG2C+NKG2A+和NKG2C-NKG2A+的T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和CD4+T細(xì)胞數(shù)量均成負(fù)相關(guān)(r=-0.463,P=0.015;r=-0.693,P<0.000 1)，而病毒載量和T細(xì)胞上NKG2C、NKG2A受體的表達(dá)無明顯相關(guān)性(r=0.161,P=0.464;r=0.215,P=0.324)，見圖3。

圖1 畫門策略Fig.1 Gating strategyNote: A.P1 gate is lymphocytes;B.P2 gate is CD3+ lymphocytes;C.The expressions of NKG2C,NKG2A in T cells,respectively.

圖2 T細(xì)胞上表達(dá)NKG2C和NKG2A受體在健康對照者(NC)、HIV慢性感染者(CHI)和HARRT治療者(HARRT)的統(tǒng)計比較Fig.2 Comparisons of NKG2C and NKG2A receptors expression on T cells in NC group,CHI group and HAART groupNote: A.Percentage of NKG2C expressed on T cells in NC group,CHI group and HAART group;B.Percentage of NKG2A expressed on T cells in NC group,CHI group and HAART group;C.Percentage of NKG2C+NKG2A- expressed on T cells in NC group,CHI group and HAART group.*.P<0.05.

圖3 HIV慢性感染者(CHI)外周血T細(xì)胞上表達(dá)的NKG2A和NKG2C受體與CD4+ T細(xì)胞數(shù)量和病毒載量的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation between NKG2A,NKG2C receptors expressed on T cells and absolute counts of CD4+ T cells and HIV viral load in CHI groupNote: A.Correlation between NKG2A+ T cells and the absolute counts of CD4+ T cells in CHI group;B.Correlation between NKG2C+NKG2A+ T cells and the absolute counts of CD4+ T cells in CHI group;C.Correlation between NKG2C-NKG2A+ T cells and the absolute counts of CD4+ T cells in CHI group;D.Correlation between NKG2C+ T cells and HIV viral load in CHI group;E.Correlation between NKG2A+ T cells and HIV viral load in CHI group.

圖4 HIV慢性感染者(CHI)外周血T細(xì)胞上表達(dá)的NKG2C和NKG2A的比值與CD4+ T細(xì)胞數(shù)量的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation between NKG2C/NKG2A expressed on T cells and absolute counts of CD4+ T cells in CHI groupNote: The absolute number of peripheral blood CD4+ T lymphocytes has positive correlation with the ratio of NKG2C and NKG2A expres-sed on T cells receptor in HIV chronically infected individuals.

2.3 HIV慢性感染者外周血T細(xì)胞上表達(dá)的NKG2C和NKG2A的比值與CD4+T細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系 除了分析NKG2C和NKG2A受體單獨表達(dá)以及聯(lián)合表達(dá)與CD4+T淋巴細(xì)胞絕對數(shù)的相關(guān)關(guān)系，我們進一步統(tǒng)計分析了HIV慢性感染者外周血T細(xì)胞上NKG2C/NKG2A的比值和CD4+T細(xì)胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關(guān)(r=0.476,P=0.012)，見圖4。

3 討論

T細(xì)胞是人體適應(yīng)性免疫應(yīng)答的重要效應(yīng)細(xì)胞，成熟的T細(xì)胞經(jīng)血流分布至外周免疫器官的胸腺依賴區(qū)定居，廣泛接觸進入體內(nèi)的抗原物質(zhì)，通過 T 細(xì)胞抗原受體(TCR)的第一信號和共刺激分子第二信號的協(xié)同刺激激活細(xì)胞[6,7]，并可經(jīng)淋巴管、外周血和組織液等發(fā)揮細(xì)胞免疫及免疫調(diào)節(jié)等功能，長期保持免疫記憶能力。NKG2A和NKG2C作為共同作用于配體HLA-E上的一對抑制性受體和活化性受體，除了在NK細(xì)胞上表達(dá)，在T細(xì)胞上亦有一定的表達(dá)，對T細(xì)胞內(nèi)信號的傳遞產(chǎn)生影響。HIV感染之后機體的免疫系統(tǒng)被激活，作為活化性受體的NKG2C，通過識別人類細(xì)胞上表達(dá)的HLA-E以及DAP-12，傳遞活化性信號給靶細(xì)胞，增強T 細(xì)胞的殺傷能力。NKG2A是抑制性受體，通過識別人類細(xì)胞上表達(dá)的HLA-E，NKG2A表達(dá)增加，抑制細(xì)胞的功能。由于NKG2家族受體的報道主要集中于單一受體的表達(dá)，很少對兩種不同作用的受體在同一細(xì)胞表面表達(dá)進行研究，考慮NKG2C和NKG2A作為一對共配體HLA-E的受體分子，單獨研究一種受體只能片面地反映細(xì)胞的功能變化，我們對活化性受體NKG2C和抑制性受體NKG2A同時進行檢測，將會更全面地反映出HIV慢性感染者和HARRT治療者外周血T細(xì)胞在HIV感染后的變化。

我們在實驗中觀察到NKG2C+和NKG2A+以及NKG2C+NKG2A-T細(xì)胞在慢性感染者中出現(xiàn)顯著性增長。NKG2C受體的增多會傳遞更多的活化信號，調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫功能；HIV感染引起全身免疫系統(tǒng)的活化，進而導(dǎo)致抑制性受體NKG2A反饋性增多。NKG2A受體的增多又抑制了細(xì)胞的免疫功能，導(dǎo)致HIV慢性感染者體內(nèi)病毒持續(xù)的存在和擴增。目前關(guān)于T 細(xì)胞上NKG2受體家族有部分報道， Mingari[8]和De Maria[9]研究發(fā)現(xiàn)抑制性受體是通過對細(xì)胞毒性T細(xì)胞的抑制效應(yīng)來降低對病原體的清除。我們觀察的NKG2A是一種抑制性受體，T細(xì)胞上表達(dá)的NKG2A數(shù)量在感染HIV后出現(xiàn)顯著性增長將抑制機體免疫系統(tǒng)對HIV病毒的清除。Magdalena[10]在感染HSV-1的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)CD8+T 細(xì)胞表面表達(dá)NKG2A/C/E受體出現(xiàn)明顯增長，小鼠模型中的實驗結(jié)果有力支持了我們在HIV感染者外周血中看到的結(jié)果，即T細(xì)胞上表達(dá)的NKG2A受體和NKG2C受體在HIV慢性感染者中出現(xiàn)明顯增長。而Miller等[11]在感染淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)在抗原特異性的CD8+T 細(xì)胞表面高表達(dá)NKG2家族，但是當(dāng)疾病進入慢性進展期后，NKG2家族受體數(shù)量出現(xiàn)了下調(diào)。我們分析Miller研究的對象小鼠感染的是淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒，而本實驗的研究對象人感染的是HIV病毒，因此兩個實驗雖然檢測同樣的實驗指標(biāo)，實驗結(jié)果存在一定的差異。

HARRT組經(jīng)治療后出現(xiàn)了顯著性下降，且與健康對照者相比無統(tǒng)計學(xué)差異，說明經(jīng)過治療后機體的免疫系統(tǒng)得以改善。很多接受HARRT治療的患者經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)病毒載量低于檢測下限， CD4+T 細(xì)胞絕對數(shù)也有不同程度增長，其體內(nèi)T細(xì)胞表面表達(dá)的NKG2A和NKG2C以及NKG2C+NKG2A-的數(shù)量隨著疾病進展均出現(xiàn)了顯著性下降，恢復(fù)到正常人水平。Costa[12]在實驗中發(fā)現(xiàn)HIV-Ⅰ型病毒感染者在未治療時CD8+T細(xì)胞CD94/NKG2A表達(dá)升高，經(jīng)6個月的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療表達(dá)未顯著減少，經(jīng)24個月的治療后可恢復(fù)至與健康對照人群無差異的水平。而我們實驗選取的HARRT治療組全部標(biāo)本距離開始治療的時間均小于兩年，經(jīng)過HARRT治療后觀察到T細(xì)胞上表達(dá)的NKG2A受體和NKG2C受體數(shù)量和健康對照組比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異。兩組實驗結(jié)果中NKG2家族受體的恢復(fù)時間有差異，考慮可能是由于兩組實驗收集的人群不同造成的，Costa觀察的是典型HIV感染者，且前期抗病毒感染治療失敗，而我們收集的HARRT組患者都屬于初次治療。

CD4+T細(xì)胞數(shù)量是衡量人體機體免疫力的重要指標(biāo)之一。本實驗通過檢測HIV慢性感染者CD4+T細(xì)胞數(shù)量，并和外周血T細(xì)胞上表達(dá)的NKG2A和NKG2C受體進行相關(guān)性分析時發(fā)現(xiàn)， NKG2A+T細(xì)胞、NKG2C+NKG2A+T細(xì)胞以及NKG2C-NKG2A+T細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞數(shù)量成反比例關(guān)系，提示T細(xì)胞表面NKG2A+，NKG2C+NKG2A+以及NKG2C-NKG2A+的表達(dá)將是研究疾病進展的重要指標(biāo)，對于HIV感染臨床預(yù)后評估具有重要意義。

本實驗進一步統(tǒng)計分析了HIV慢性感染者外周血T細(xì)胞上NKG2C/NKG2A的比值和與CD4+T淋巴細(xì)胞絕對數(shù)的關(guān)系，結(jié)果提示兩者呈正相關(guān)關(guān)系。由于HIV進入人體后在靶細(xì)胞中復(fù)制增殖，可通過直接或者間接途徑攻擊和破壞CD4+T 淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致CD4+T 淋巴細(xì)胞絕對數(shù)顯著減少，功能嚴(yán)重障礙。實驗結(jié)果顯示HIV慢性感染者外周血T細(xì)胞上NKG2C/NKG2A的比值越低，CD4+T淋巴細(xì)胞絕對數(shù)越少，機體的免疫功能越低下，NKG2C/NKG2A的比值可作為臨床上預(yù)后評估判斷的依據(jù)之一。

綜上所述，本實驗研究了HIV慢性感染者和HARRT治療者外周血中T細(xì)胞表達(dá)的NKG2C和NKG2A受體的變化，首次分析了NKG2A和NKG2C受體與CD4+T 淋巴細(xì)胞絕對數(shù)的相關(guān)性，提示T細(xì)胞表面NKG2C/NKG2A受體表達(dá)在HIV感染中具有重要意義，為臨床上治療HIV感染和預(yù)后評估判斷提供科學(xué)依據(jù)。而人體感染HIV后表達(dá)NKG2C和NKG2A受體的T細(xì)胞功能如何變化目前尚無報道，還有待后續(xù)進一步的實驗去探索和研究。

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[收稿2016-06-01]

(編輯 倪 鵬)

Research on expression of NKG2C/NKG2A receptors on T cells in HIV infected individuals and relationship with disease progression

TAOAn-Fu，HELei，ZHANGZi-Ning，F(xiàn)UYa-Jing，LIUJing，HUQing-Hai，JIANGYong-Jun.

KeyLaboratoryofAIDSImmunologyofMinistryofHealth，DepartmentofLaboratoryMedicine，theFirstHospitalofChinaMedicalUniversity，Shenyang110001，China

Objective:To study the changes of NKG2C/NKG2A expressed on T cells in HIV chronically infected individuals and HAART-treatment AIDS patients and the relationship with disease progression of HIV.Methods: We collected peripheral blood from HIV chronically infected individuals,HAART-treatment AIDS patients and healthy human and used the flow cytometry by staining fluorescent antibody to detect the NKG2C/NKG2A receptors expressed on T cells.Results: NKG2C+,NKG2A+and NKG2C+NKG2A-expressed on T cells in HIV chronically infected individuals were significantly higher than the healthy control group (P=0.025，P=0.032，P=0.029),while in HAART-treatment AIDS patients were significantly lower than that in HIV chronically infected individuals (P=0.033，P=0.037，P=0.018),returned to the normal levels with no significant difference compared with the healthy control group.The absolute number of peripheral blood CD4+T lymphocytes in HIV chronically infected individuals was negative correlation with T cells which expressing NKG2A+，NKG2C+NKG2A+and NKG2C-NKG2A+(r=-0.697,P<0.000 1；r=-0.463,P=0.015；r=-0.693,P<0.000 1).What was more,the absolute number of peripheral blood CD4+T lymphocytes had positive correlation with the ratio of NKG2C and NKG2A expressed on T cells receptor in HIV chronically infected individuals(r=0.476,P=0.012).Conclusion: Studying the expression of NKG2C and NKG2A receptors on T cell has great significance in HIV infected individuals,which may provide a scientific basis for clinical prognosis of HIV infection.

HIV infected individuals;T cells;NKG2C;NKG2A

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.018

陶安福(1991年-)，男，在讀碩士，主要從事艾滋病免疫學(xué)研究，E-mail：taftaf@163.com。

R512.91

A

1000-484X(2017)01-0090-05

①本文為十二五科技重大專項(2014ZX10001002-001-004)和基礎(chǔ)臨床緊密結(jié)合平臺項目(醫(yī)大發(fā)字[2013]5號)。

②通訊作者，E-mail：jiangjun55555@163.com。