韓玉清 俞黎黎 周 鷹 楊 李 張承伯 崔玉寶

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鹽城醫(yī)院檢驗(yàn)科，鹽城224006)

·免疫學(xué)技術(shù)與方法·

塵螨變應(yīng)原Der f 6/pET32a(+)重組質(zhì)粒構(gòu)建、表達(dá)、純化及其產(chǎn)物血清IgE結(jié)合率①

韓玉清 俞黎黎②周 鷹 楊 李②張承伯②崔玉寶③

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鹽城醫(yī)院檢驗(yàn)科，鹽城224006)

目的：獲得塵螨變應(yīng)原第6組分Der f 6原核表達(dá)產(chǎn)物并檢測(cè)其與塵螨過敏性哮喘患兒血清抗體IgE結(jié)合率。方法：酶切質(zhì)粒pET28a(+)-Der f 6獲得目的基因Der f 6，將其與pET32a(+)載體連接成質(zhì)粒pET32a (+)-Der f 6，轉(zhuǎn)化BL21細(xì)菌后，用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，用Ni+離子親和層析柱純化表達(dá)產(chǎn)物，用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)和蛋白質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF)鑒定純化產(chǎn)物。以純化獲得的產(chǎn)物為包被抗原建立間接ELISA法檢測(cè)塵螨過敏性哮喘患兒血清抗體反應(yīng)情況。結(jié)果：成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a (+)-Der f 6，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21誘導(dǎo)表達(dá)，親和層析純化后，SDS-PAGE顯示獲得目的蛋白，Western blot驗(yàn)證其能夠與載體的組氨酸標(biāo)簽結(jié)合，質(zhì)譜鑒定其Der f 6結(jié)構(gòu)一致。以此產(chǎn)物為包被抗原建立間接ELISA檢測(cè)塵螨過敏性哮喘患兒血清，陽性率為41.3% (19/46)。結(jié)論：成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a (+)-Der f 6，親和純化獲得的目的蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

塵螨；變應(yīng)原；基因表達(dá)；蛋白質(zhì)純化

長期以來，臨床采用塵螨粗提浸液混合物診治過敏性哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎等Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病[1]。隨著人們對(duì)變應(yīng)原化學(xué)性質(zhì)的深入了解，塵螨粗提浸液質(zhì)量得到不斷改進(jìn)，塵螨變應(yīng)原的標(biāo)準(zhǔn)化不再依賴于蛋白氮單位、質(zhì)量/體積比，歐美權(quán)威部門都已引進(jìn)生物和免疫化學(xué)方法改善變應(yīng)原產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化[2-4]。測(cè)定主要變應(yīng)原的濃度也被臨床認(rèn)為是較好的方法，能夠?yàn)榱俗儜?yīng)原免疫治療提供更佳的方案[2-4]。盡管如此，采用純培養(yǎng)的塵螨制備變應(yīng)原仍然含有許多非過敏性蛋白質(zhì)及其他大分子物質(zhì)，不同批次產(chǎn)品中變應(yīng)原組成、含量不同，還有可能被其他物質(zhì)(甚至于蛋白水解酶)污染，而這些酶類物質(zhì)可能具有過敏原性，也可能不具有變應(yīng)原性，但是會(huì)引起變應(yīng)原性物質(zhì)的降解或者效價(jià)下降。絕大多數(shù)的變應(yīng)原粗提制品含有多組主要變應(yīng)原和次要變應(yīng)原成分，即使采用最新技術(shù)也很難對(duì)此混合物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

正因?yàn)樯鲜鲈?，采用重組DNA技術(shù)制備重組變應(yīng)原、改善變應(yīng)原質(zhì)量成為變態(tài)反應(yīng)學(xué)研究的主流方向之一。過去20年里，幾乎所有主要變應(yīng)原的核酸序列都已經(jīng)得到測(cè)定，細(xì)菌、酵母、昆蟲病毒和植物表達(dá)體系都已經(jīng)用于制備重組變應(yīng)原，其產(chǎn)物純度高，被認(rèn)為有可能替代過敏原粗提混合物用于臨床診治疾病[2-4]。本研究將粉塵螨變應(yīng)原第6組分Der f 6與原核表達(dá)載體pET32a(+)連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21 (DE3)中表達(dá)，用純化獲得的重組融合蛋白與血清進(jìn)行ELISA驗(yàn)證其反應(yīng)原性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清 塵螨過敏性哮喘患兒血清均由我院檢驗(yàn)科保存提供，所有患者未接受任何治療。哮喘診斷符合WHO標(biāo)準(zhǔn)，即患兒有咳嗽、哮喘，肺部有明顯的喘鳴音、濕羅音以及其他臨床癥狀，X-線顯示肺部紋理、充氣過度[5]。所有患兒均經(jīng)過敏原特異性IgE抗體檢測(cè)顯示血清粉塵螨特異性IgE陽性，并結(jié)合病史確診。共有46例塵螨過敏性哮喘患兒入選，平均年齡(7.1±3.5) 歲，男25例、女21例。健康體檢合格兒童5例，均無過敏史，為對(duì)照組，平均年齡(5.4±2.4)歲，男2例、女3例。

1.1.2 質(zhì)粒、菌株、試劑 本室保存的pET28a(+)-Der f 6[6]。工具酶BamHⅠ和XhoⅠ、DNA ladder、E.coli Competent Cells JM109 (Code No.D9052)由大連TaKaRa公司生產(chǎn)；E.coli BL21 (DE3) Stratagene公司生產(chǎn)；pET32a(+) (Kit Lot No.N72770)由Novagen公司生產(chǎn)。過敏原特異性IgE抗體檢測(cè)試劑盒由蘇州浩歐博生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)(YZB/國1450-2012)。

1.2 方法

1.2.1 原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-Der f 6構(gòu)建 使用BamH I/Xho I雙酶切載體pET28a(+)-Der f 6，切膠回收小片段即為目的基因Der f 6；使用BamH I/Xho I雙酶切空質(zhì)粒pET32a(+)，切膠回收大片段；使用T4 DNA連接酶將Der f 6與pET32a(+)載體連接后，轉(zhuǎn)化至E.coli Competent Cells JM109感受態(tài)細(xì)胞中，涂布平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜；挑取單菌落，進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定結(jié)果陽性者進(jìn)行質(zhì)粒抽提。

1.2.2 質(zhì)粒pET32a(+)-Der f 6表達(dá) 取0.1 μl質(zhì)粒pET32a(+)-Der f 6轉(zhuǎn)化50 μl BL21感受態(tài)細(xì)胞中，使用LB/Amp抗生素平板，取50 μl轉(zhuǎn)化液涂布，37℃倒置培養(yǎng)。種培養(yǎng)：挑取單菌落至1 ml LB/Amp抗生素培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)；再轉(zhuǎn)接到5 ml LB/抗生素培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)。主培養(yǎng)誘導(dǎo)：在400 ml LB/Amp抗生素培養(yǎng)基中，添加4 ml種培養(yǎng)菌液，37℃培養(yǎng)至OD600nm值約為0.6～0.7，添加1 mol/L IPTG 400 μl(最終濃度為1 mmol/L)，28℃誘導(dǎo)4～5 h。菌體收集及破碎：置4℃、5 000 r/min離心10 min，去掉上清培養(yǎng)基。菌體沉淀加lysis buffer(10 mmol/L咪唑、50 mmol/L PBS、0.3 mol/L NaCl、5%甘油)超聲破碎；12 000 r/min離心，棄上清；沉淀加變性裂解液(lysis buffer，10 mmol/L咪唑、50 mmol/L PBS、0.3 mol/L NaCl、8 mol/L尿素)重懸，12 000 r/min離心，取上清過Ni柱親和純化蛋白。

1.2.3 質(zhì)粒pET32a(+)-Der f 6表達(dá)產(chǎn)物純化與復(fù)性 蛋白質(zhì)純化過程包括平衡、上樣、洗雜和洗脫。取Ni柱用裂解液(lysis buffer，10 mmol/L咪唑、50 mmol/L PBS、0.3 mol/L NaCl、8 mol/L尿素)平衡5～10個(gè)柱體積，上樣：將離心后的細(xì)胞培養(yǎng)液上清以1 ml/min通過Ni柱收集流穿液4℃保存，再用洗雜液 1(20 mmol/L咪唑、50 mmol/L PBS、0.3 mol/L NaCl、8 mol/L尿素)洗5～10個(gè)柱體積收集洗雜液1，4℃保存；用洗雜液 2(50 mmol/L咪唑、50 mmol/L PBS、0.3 mol/L NaCl、8 mol/L尿素)洗4～5個(gè)柱體積收集洗雜液2，4℃保存。用洗脫buffer(250 mmol/L咪唑、50 mmol/L PBS、0.3 mol/L NaCl、8 mol/L尿素)洗4～5個(gè)柱體積，收集洗脫液，4℃保存。取10 μl樣本+5 μl上樣緩沖液混勻100℃水浴煮沸10 min，離心，得純化產(chǎn)物。蛋白質(zhì)復(fù)性：取上述純化產(chǎn)物，加10 mmol/L裂解液(10 mmol/L咪唑、50 mmol/L PBS、0.3 mol/L NaCl、5%甘油)稀釋4倍，攪拌4 h。將蛋白透析到PBS+5%甘油 buffer中，濃縮蛋白。

1.2.4 SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證純化產(chǎn)物 取1 μg樣本，加入5×SDS sample buffer，95℃加熱10 min，上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳條件為：濃縮膠(12%)恒壓90 V，約20 min，溴酚藍(lán)到分離膠(5%)界面，分離膠恒壓160 V，約30 min。將PVDF膜剪切成與Gel相同大??；放于甲醇中浸泡15 s；再放于轉(zhuǎn)膜液中浸泡5～10 min。濾紙放于轉(zhuǎn)膜液中浸泡5～10 min。采用半干法轉(zhuǎn)膜，在轉(zhuǎn)膜儀上按從上到下的順序依次放置：(負(fù)極)濾紙-PAGE Gel-PVDF膜-濾紙(正極)。電壓20 V，轉(zhuǎn)膜時(shí)間90 min。將膜完全浸沒在5%的脫脂奶粉-PBST溶液中，室溫下?lián)u擺封閉1 h。用5%的脫脂奶粉-PBST稀釋一抗(His-tag；稀釋比例：1∶2 000)，室溫孵育1 h，放到4℃冰箱孵育一抗過夜。第2天從4℃冰箱拿出來后，室溫放置30 min，0.1%PBST洗膜3次，每次10 min。用5%的脫脂奶粉-PBST稀釋二抗[羊抗鼠IgG(H+L) HRP；稀釋比例：1∶2 000]，室溫孵育1 h。用0.1%PBST洗膜3次，每次10 min。將顯色混合液加到膜上后，反應(yīng)3～5 min，膠片曝光，顯影2 min，定影。

1.2.5 質(zhì)譜鑒定純化產(chǎn)物 取純化后的蛋白質(zhì)，用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀(Applied Biosystem，4800型)按中國藥典2010版二部附錄Ⅸ J鑒定。

1.2.6 重組融合蛋白特異性IgE檢測(cè) 用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)pET32a(+)-Der f 6表達(dá)產(chǎn)物的免疫反應(yīng)性。取100 μl純化獲得的原核表達(dá)產(chǎn)物(1 μg/ml)，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(Phosphate-buffer saline，PBS)進(jìn)行稀釋，然后加入酶標(biāo)板中，8℃過夜孵育。取300 μl PBST緩沖液封閉抗原，再加入1∶4稀釋后的患者血清每孔100 μl，4℃過夜孵育。加入50 μl二抗(辣根過氧化酶標(biāo)記的鼠抗人IgE，1∶5 000 稀釋)，37℃ 孵育1 h。加100 μl四甲基聯(lián)苯胺(Tramethylbenzidine，TMB)，室溫孵育15 min，加入50 μl NH2SO4終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀讀取每孔光密度值(Optical density，OD)，波長為405nm。每患者測(cè)3次，取平均值，若高于陽性閾值即判為陽性。健康體檢合格兒童5名同時(shí)進(jìn)行ELISA檢測(cè)，其平均OD值±3 SD作為閾值。

2 結(jié)果

2.1 原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-Der f 6鑒定 用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切質(zhì)粒pET28a(+)-Der f 6，切膠回收目的基因(圖1)，目的片段大小約在840 bp；用T4 DNA連接酶將目的基因與pET32a(+)載體連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR鑒定結(jié)果表明成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-Der f 6，見圖2。

2.2 質(zhì)粒pET32a-Der f 6原核表達(dá)及其產(chǎn)物純化 將原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Der f 6轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli BL21誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳顯示其正常表達(dá)，但表達(dá)為包涵體。從2 000 ml發(fā)酵液收集到菌體，超聲波破碎后，離心收集沉淀即為粗制的包涵體，經(jīng)洗滌、溶解、過濾后，上清液經(jīng)過鎳瓊脂糖凝膠FF親和柱，并用不同濃度咪唑溶液洗脫并收集產(chǎn)物，SDS-PAGE電泳分析顯示獲得較純凈的目的蛋白(圖3A)，用Western blot驗(yàn)證其與His-tag結(jié)合(圖3B)。得到蛋白純度80%，濃度1 mg/ml。取純化出來的融合蛋白質(zhì)，質(zhì)譜鑒定認(rèn)為Der f 6結(jié)構(gòu)一致。

2.3 融合蛋白ELISA檢測(cè)結(jié)果 以純化獲得的pET32a(+)-Der f 6原核表達(dá)產(chǎn)物為包被抗原進(jìn)行ELISA檢測(cè)，5健康體檢合格兒童血清抗體的OD值為0.199，標(biāo)準(zhǔn)差為0.015 9，以(0.199+3×0.019)=0.258為閾值，46份塵螨過敏性哮喘患兒對(duì)此融合蛋白的陽性率為41.3% (19/46)，見圖4。

圖1 質(zhì)粒pET28a(+)-Der f 6 經(jīng)BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切電泳圖Fig.1 Restriction analysis of expression plasmids pET28a(+)-Der f 6 by BamHⅠand XhoⅠNote: Lane M.DL2000 marker;Lane 1.The products of the plasmids pET28a(+)-Der f 6 by BamHⅠand XhoⅠ.

圖2 pET32a(+)-Der f 6菌落PCR鑒定產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretic analysis of colony PCR product of plasmids pET32a(+)-Der f 6Note: Lane M.DL2000 marker;Lane 1-6.The PCR product of the plasmids pET32a(+)-Der f 6.

圖3 SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證純化后pET32a(+)-Der f 6原核表達(dá)產(chǎn)物Fig.3 SDS-PAGE analysis and Western blot analysis of expressed products of pET32a(+)-Der f 6 in E.coli BL21 cellsNote: A.SDS-PAGE analysis the recombinant proteins.Lane 1.Supernatant;Lane 2.The flow-through of the His-bind column;Lane 3.The washing;Lane 4.The elution.B.Lane 5.TaKaRa protein marker(Broad);Lane M2.Thermo scientific pierce prestained protein molecular molecular weight marker.

圖4 純化后的pET32a(+)-Der f 6原核表達(dá)產(chǎn)物IgE反應(yīng)性Fig.4 IgE-binding reactivity of expressed products of pET32a(+)-Der f 6 in E.coli BL21 cellsNote: The cutoff ELISA value (mean ELISA value of healthy donors ±3SD,0.199+3×0.019=0.258) was indicated as a horizontal line.*.P<0.05.

3 討論

我們?cè)谝郧暗膶?shí)驗(yàn)中成功構(gòu)建了質(zhì)粒pMD19-T-Der f 6[6,7]，測(cè)序結(jié)果表明Der f 6全長基因大小約840 bp，與本次實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增出來的目的基因大小一致。采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)Der f 6全長cDNA編碼蛋白質(zhì)由279個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為30 370.59 Da。本次實(shí)驗(yàn)將Der f 6全長cDNA與pET32a(+)連接，構(gòu)建出的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得成功，進(jìn)一步鑒定其純化產(chǎn)物，SDS-PAGE和Western blot顯示出清晰的條帶。因?yàn)閜ET32a空載體表達(dá)出來的蛋白質(zhì)分子量約為21 kD，Der f 6前體蛋白30 kD，所以pET32a(+)-Der f 6表達(dá)產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)在51 kD左右，與此次SDS-PAGE和Western blot顯示出來的條帶大小一致，說明本次實(shí)驗(yàn)成功獲得了Der f 6的重組融合蛋白。

眾所周知，塵螨是室內(nèi)最重要的變應(yīng)原來源物質(zhì)之一。但是作為一種生物體，塵螨可以產(chǎn)生許多種蛋白質(zhì)和其他的大分子物質(zhì)。使用免疫印跡法和放射交叉免疫電泳等技術(shù)檢測(cè)到塵螨粗提浸液中有30多條與過敏性哮喘患者血清IgE發(fā)生結(jié)合的條帶，也就是說塵螨可能含有30多種變應(yīng)原[8-10]。塵螨種類繁多，能夠引起過敏反應(yīng)的螨類主要隸屬于羽螨總科(Analgoidea)的麥?zhǔn)瞅?Pyroglyphidae)，也有食甜螨總科(Glycyphagoidea)和粉螨總科(Acaroidea)等儲(chǔ)藏物螨類(Storage mites)[11,12]。來自不同螨種的同一組分變應(yīng)原具有高度同源性，進(jìn)化關(guān)系很近，具有相同的生物化學(xué)功能，如屋塵螨變應(yīng)原第1組分Der p 1、粉塵螨變應(yīng)原第1組分Der f 1和梅氏嗜霉螨變應(yīng)原第1組分Eur m 1均為塵螨變應(yīng)原第1組分。國際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)(The Inter-national Union of Immunological Societies，IUIS)下設(shè)過敏原命名數(shù)據(jù)庫(nomenclature database，http://www.allergen.org/)已公布33組不同的螨類過敏原，其中第1、2組分為主要過敏原，可與50%以上螨粗提浸液陽性者血清IgE發(fā)生反應(yīng)，因此被認(rèn)為是塵螨變應(yīng)原主要組分，受到國內(nèi)外學(xué)者的重視，而對(duì)其余組分的研究報(bào)道較少[8-10]。我們?cè)谝郧暗难芯砍晒?gòu)建了Der f 6的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a (+)-Der f 6，轉(zhuǎn)化E.coli BL21 細(xì)菌進(jìn)行原核表達(dá)，取純化產(chǎn)物與20例哮喘患兒血清進(jìn)行ELISA，陽性結(jié)合率為45%[7]。本次實(shí)驗(yàn)，我們成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a (+)-Der f 6，取純化獲得的原核表達(dá)產(chǎn)物與46例哮喘患兒血清進(jìn)行ELISA，陽性結(jié)合率為41.3%。依次這兩次ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)第6組分是引起塵螨過敏性哮喘的重要組分之一。

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[收稿2016-07-10 修回2016-08-25]

(編輯 張曉舟)

Construction of recombinant plasmids Der f 6/pET32a(+)and its expression,purification,IgE-binding reactivity

HANYu-Qing,YULi-Li,ZHOUYing,YANGLi,ZHANGCheng-Bo,CUIYu-Bao.

DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedYanchengHospital,SchoolofMedicine,SoutheastUniversity,Yancheng224001，China

Objective:To obtain the prokaryotic expression product for the group 6 allergen of Dermatophagoides farine (Der f 6) and detect its IgE-binding rates with sera from asthmatic children.Methods: By enzyme digestion of pET28a(+)-Der f 6 with BamHⅠ plus XhoⅠ,the target gene Der f 6 was obtained and linked into the vector pET32a (+) to construct the recombinant plasmid pET32a(+)-Der f 6,which was then transfected into E.coli BL21 cells for expression,induced with isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG),purified by affinity chromatography and identified by SDS-PAGE,Western blot and AMLDI-TOF,and tested by ELISA for IgE reactivity with sera from asthmatic children.Results: The plasmids pET32a(+)-Der f 6 were constructed,transformed into E.coli BL21 and expressed successfully.SDS-PAGE of the purification product showed a specific band,Western blot showed the successful binding between the purification product and the His-tag in the plasmids,and MALDI-TOF/TOF identified the identical structure to the allergen Der f 6.Using the ELISA method developed with the recombinant proteins as coating antigen,the positive rate was 41.3% (19/46) in asthmatic children allergic to dust mite.Conclusion: The plasmids pET32a (+)-Der f 6 were constructed successfully,expressed in E.coli BL 21 (DE3).The recombinant fusion protein has a good reactivity with sera from asthmatic children.

House dust mites;Allergen;Gene expression;Protein purification

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.015

①本文為國家自然科學(xué)基金(NSFC30060166,NSFC81001330,NSFC31272369,NSFC31572319)。

韓玉清(1977年-)，女，主管檢驗(yàn)師，主要從事免疫學(xué)研究，E-mail：15189200700@163.com。

R384.4

A

1000-484X(2017)01-0076-05

②江蘇鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，鹽城224006。

③通訊作者，E-mail：ybcui1975@hotmail.com。