王 倩 羅 微 屈子璐 陳鐵龍

(天津市海河醫(yī)院病理科，國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥防治傳染病重點研究室，天津300350)

結核分枝桿菌Rv3245蛋白抗原免疫學特性的研究①

王 倩 羅 微②屈子璐③陳鐵龍④

(天津市海河醫(yī)院病理科，國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥防治傳染病重點研究室，天津300350)

目的：研究結核分枝桿菌Rv3425蛋白免疫學特性，評估其診斷應用價值及在結核致病性中的作用。方法：將Rv3425基因克隆至pET28a載體中，誘導表達Rv3425融合蛋白并進行純化；利用ELISA、Western blot分析其抗原性與特異性；流式檢測該抗原對巨噬細胞凋亡的影響。結果：獲得了可溶性原核表達融合蛋白Rv3425，Rv3425蛋白能刺激滅活結核分枝桿菌免疫小鼠脾細胞產生高水平的特異性IFN-γ、純化的Rv3425蛋白能與結核感染小鼠血清特異性結合，其特異性血清抗體IgG及IgM在結核病人中的水平明顯高于健康人，發(fā)現(xiàn)該蛋白能誘導巨噬細胞的凋亡。結論：本研究發(fā)現(xiàn)結核分枝桿菌Rv3425蛋白具有較強的抗原性且能促進巨噬細胞的凋亡，這些發(fā)現(xiàn)對于結核病的診斷及致病機制的研究具有重要價值。

結核分枝桿菌；Rv3425；抗原性；巨噬細胞；凋亡

結核病(Tuberculosis,TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)感染而引起的重大傳染性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織2015年結核病最新流行病學調查顯示，全球每年約960萬的新增病例和150萬的死亡病例，全球1/3的人感染過結核，其中90%～98%為潛伏感染，其中2%～10%會發(fā)展為活動性結核[1]。基因組學研究發(fā)現(xiàn)，結核分枝桿菌基因組中一些片段在牛分枝桿菌或卡介苗(Bacillus calmette guerin,BCG)基因組中缺失，這些片段被稱為差異區(qū)域(Region of differences,RD)，已有研究報道證實結核疫苗BCG在凍干技術尚未發(fā)明之前的傳代保存過程中相對于結核分枝桿菌來說丟失了16個區(qū)域[2]，這導致現(xiàn)有的BCG的保護力已大大下降，僅對嬰幼兒具有保護作用，在成年人中保護力低下。目前，RD區(qū)的研究已引起重視，結核分枝桿菌RD1區(qū)的“明星蛋白”CFP-10、ESAT6已被成功應用于臨床診斷與預防性疫苗的研發(fā)[3,4]。后續(xù)研究也逐漸發(fā)現(xiàn)了其他抗原性及免疫原性較強的RD蛋白諸如RV3873、Rv0222、Rv2645等，RD11區(qū)的Rv3425也逐步引起關注，被發(fā)現(xiàn)具有較強的免疫原性[5-9]。為更深入探究Rv3425蛋白作為抗原的免疫學特異性，本研究將通過分子生物學手段克隆表達Rv3425蛋白并考察其在結核病診斷中的應用價值，同時探討它對巨噬細胞凋亡的影響從而初步探討其在結核病致病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑 pET28a原核及pcDNA3.1真核表達質粒由本實驗室保存，滅活結核分枝桿菌(iH37Rv，ATCC25618)及其基因組、BCG(ATCC35734)菌株、大腸桿菌感受態(tài)DH5α及BL21(DE3)、RAW264.7細胞系(小鼠單核巨噬細胞白血病細胞系)由本實驗室保存。27只6～8周齡雌性BALB/c小鼠購于武漢大學動物實驗中心，100份結核病人(具有結核病臨床癥狀、臨床T-spot檢測陽性、痰培養(yǎng)陽性患者)血清由天津市海河醫(yī)院提供，100份健康人(無結核病臨床癥狀、PPD實驗陰性且無其他相關疾病的健康體檢人群)血清由天津醫(yī)科大學總醫(yī)院檢驗科提供。PCR引物由英駿公司合成，BamHⅠ及HindⅢ限制性內切酶購于Promega公司，高效T4連接酶購自TOYOBO公司，Ni-NTAAgarose購自QIAGEN公司，咪唑購自Sigma公司，IFN-γELISA檢測試劑盒購自于北京達科為公司，細胞培養(yǎng)基RPMI1640及DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司，His-Tag鼠多克隆抗體、Myc-標簽鼠多克隆抗體購自于Sungene公司，HRP-羊抗鼠IgG抗體購自Affinity公司，HRP-羊抗人IgG、IgM抗體購自于CoWin公司，結核菌素純蛋白衍生物PPD購自于北京祥瑞生物制品有限公司，NeofectTMDNA轉染試劑購自于零客創(chuàng)智(北京)生物技術有限公司，PI/AnnexinV凋亡檢測試劑盒購自于聯(lián)科生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計 根據(jù)Pubmed網站Genbank報道H37Rv菌株Rv3425基因編碼序列及pET28a質粒上限制性內切酶位點設計特異性引物，引物兩端分別引入BamHⅠ及HindⅢ限制性內切酶位點。上游引物P1：5′GCGGATCCATGCATCCAATGAT-ACC3′；下游引物P2：5′TTGAAGCTTCCCGCCCCT-GTAG ATC3′(下劃線部分為所加酶切位點)。因pcDNA3.1上多克隆位點上也含BamHⅠ及HindⅢ且編碼方向同pET28a，因而構建真核表達重組質粒的引物同上所述。

1.2.2pET28a-Rv3425重組質粒的構建 以H37Rv基因組為模板，PCR法擴增獲取Rv3425基因序列，PCR產物BamHⅠ及HindⅢ限制性內切酶雙酶切后回收，以高效T4連接酶將其克隆至原核表達質粒pET28a上，連接產物轉化DH5α感受態(tài)擴增提質粒后用BamHⅠ及HindⅢ酶進行雙酶切鑒定，雙酶切鑒定結果正確者送予英駿公司測序。

1.2.3Rv3425融合蛋白的表達、純化與鑒定 將測序結果正確的pET28a-Rv3425質粒轉化大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)中，在含有卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)上挑取陽性克隆并轉移至YT液體培養(yǎng)基中，37 ℃振搖培養(yǎng)至OD600達0.5左右，加入終濃度為0.8mmol/L的IPTG進行誘導表達，溫度28 ℃，時間10h。離心收集沉淀PBS洗滌2次后超聲破碎，碎菌后離心8 000r/min30min棄碎菌沉淀，于上清中加入Ni-NTAAgarose冰上結合1h。1h后1 000r/min離心，收集Ni-NTAAgarose，梯度濃度的咪唑緩沖液20、40、80、100mmol/L洗滌結合后的Ni-NTAAgarose，收集洗滌液并作12%濃度的SDS-PAGE檢測，最純的Rv3425蛋白用PolymyxinB-agarose試劑盒去內毒素，于4 ℃層析柜中透析后以BCA蛋白濃度檢測法測量Rv3425蛋白濃度，取0.5μg的Rv3425蛋白作利用His標簽鼠多克隆抗體及羊抗鼠抗體作Westernblot鑒定。

1.2.4IFN-γ釋放水平的檢測 將27只BALB/c小鼠隨機分為3組，每組作PBS、BCG、iH37Rv免疫。H37Rv及BCG菌株65 ℃水浴1h滅活后(iH37Rv)尾靜脈注射進行預免疫。初次免疫劑量為1×108，逐日遞加1×108，連續(xù)免疫7次，間隔7d后進行實驗[7]。處死小鼠取脾臟細胞，用1640培養(yǎng)基制備細胞懸液濃度為1×106個/ml。按100μl/孔的量接種細胞到IFN-γ抗體預包被的ELISA板中培養(yǎng)，各免疫組9只小鼠的脾臟細胞隨機分為3份，用PBS(陰性對照)、PPD及Rv3425蛋白刺激，其中PPD及Rv3425的刺激終濃度為1μg/ml。將加入刺激蛋白的細胞置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)37 ℃、24h后按達科為IFN-γELISA檢測試劑盒說明書完成檢測步驟。

1.2.5 融合蛋白Rv3425血清抗體的Westernblot(WB)鑒定 取純化的Rv3425融合蛋白稀釋成1mg/ml母液，各取5μl與上樣Buffer混合煮沸變性5min后進行12%濃度SDS-PAGE，再轉膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1h后，依次以上文中各免疫組小鼠的血清(1∶200稀釋)、TBST洗滌、HRP標記的羊抗鼠IgG抗體37 ℃孵育1h，TBST再次洗滌后ECL法顯色。

1.2.6 結核病人血清Rv3425特異性抗體IgG及IgM的檢測 調整Rv3425蛋白濃度10μg/ml，包被96孔板，100μl/well，4 ℃過夜后PBS洗滌2次，扣干。2%的BSA封閉，200μl/孔，37 ℃孵育1h，PBS洗滌2次，扣干。TB病人血清1∶200稀釋，100μl/孔，37 ℃孵育1h，PBST洗滌5次，扣干。加入各HRP-羊抗人IgG、IgM、IgG2、IgG4抗體(稀釋比按各自說明書進行)，37 ℃孵育1h，PBST洗滌5次，扣干。PBST洗滌5次，扣干。加入TMB顯色液100μl/孔，室溫顯色10～20min。終止反應：50μl/孔加入2mol/L的H2SO4來終止反應。讀板：終止后10min內，450nm波長檢測其吸光度。以健康人血清作為陰性對照。

1.2.7Rv3425蛋白對巨噬細胞凋亡作用的檢測RAW264.7細胞用DMEM培養(yǎng)基接種于6孔板中，1×106個細胞/孔；12h后待細胞生長至對數(shù)期(細胞約占視野70%左右時)，將細胞分組，組別為不作轉染、轉染pcDNA3.1空載質粒及pcDNA3.1-Rv1768重組質粒，轉染步驟按NeofectTMDNA轉染試劑說明書進行。轉染72h后用預冷PBS將細胞反復沖洗并收集(未脫落的細胞用細胞刮輕輕刮拭沖洗下來，動作輕柔勿刮傷細胞)。各組取約105個細胞用細胞裂解液裂解后作myc標簽抗體的Westernblot檢測，檢測轉染后觀察在分子量大小為20kD左右的Rv3425融合蛋白是否表達；剩下的細胞用PI/AnnexinV試劑盒按說明書染色處理后作FCM檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，以P<0.05為有統(tǒng)計學差異；結果中的ROC曲線及Cutoff值由GraphPadPrism軟件生成。

2 結果

2.1pET28a-Rv3425重組質粒的構建及其蛋白的表達與純化 重組質粒pET28a-Rv3425的BamHⅠ及HindⅢ雙酶切鑒定結果如圖1A所示，雙酶切結果初步證實構建成功。咪唑洗脫純化蛋白后，其相應的表達及洗脫純化蛋白的SDS-PAGE結果如圖1B所示，發(fā)現(xiàn)Rv3425誘導后表達量高，在100mmol/L咪唑洗脫時能獲取純度較高的蛋白。純化Rv3425蛋白上融合了pET28a質粒上的His標簽，可利用His標簽抗體作WB鑒定，結果進一步證實了Rv3425蛋白的成功表達，如圖1C所示。

2.2 結核感染小鼠中存在高水平的Rv3425特異性IFN-γ及血清抗體 在各免疫組小鼠的IFN-γ釋放水平的ELISA檢測結果中，我們發(fā)現(xiàn)Rv3425能刺激iH37Rv免疫的小鼠產生高水平的IFN-γ，然而在BCG、PBS等對照組小鼠中并未檢測到Rv3425能刺激產生高水平的IFN-γ，如圖2A所示。WB結果證實結核免疫組小鼠中存在Rv3425特異性血清抗體IgG，而BCG及PBS免疫組未能檢測到，如圖2B所示。這些結果進一步證實了Rv3425是結核分枝桿菌特有抗原，在BCG中發(fā)生了缺失。

2.3 結核病人中Rv3425血清特異性抗體IgG及IgM明顯高于健康人 在100例結核病人及健康人Rv3425血清特異性抗體的IgG及IgM的檢測中，我們發(fā)現(xiàn)結核病人相對于健康人來說其水平明顯高于健康人，且具有統(tǒng)計學差異。其中IgG檢測的cutoff值為0.68，其ROC圖曲線下面積AUC為0.86；IgM檢測的Cutoff值為0.41，其ROC圖曲線下面積AUC為0.79，如圖3所示。根據(jù)其Cutoff值判讀陰陽性后計算相應的靈敏度與特異度結果，其中IgG分別為78%與79%；IgM分別為73%與75%(圖中未顯示)。這些結果提示，Rv3425血清特異性抗體IgG與IgM的檢測可作為結核病的輔助診斷手段。

圖1 Rv3425蛋白的表達及鑒定Fig.1 Expression and identification of Rv3425Note: A.Double enzyme digestion of pET28a-Rv3425,"p" and "i" represent post-induced,"c"represents the control of pre-induced;B.Purification and SDS-PAGE of Rv3425;C.Western blot identification of Rv3425.

圖2 Rv3425小鼠特異性IFN-γ及血清抗體的檢測Fig.2 Detection of specific IFN-γ and serum antibody in miceNote: A.Detcetion of specific IFN-γ in different groups of mice by ELISA;B.Detcetion of Rv3425 specific IgG in different groups by Western blot.

圖3 結核病人與健康人群中Rv3425特異性血清抗體IgG、IgM水平Fig.3 IgG and IgM antibodies responses to Rv3425

圖4 Rv3425誘導巨噬細胞凋亡Fig.4 Rv3425 induced apoptosis of macrophageNote: A.Identification of pcDNA3.1-Rv3425 by double enzyme digestion；B.Identification of transfection by Western blot method；C.Detection of RAW264.7 cells apoptosis by FCM method.

2.4 Rv3425能誘導巨噬細胞的凋亡 將Rv3425基因克隆至真核表達載體pcDNA3.1上(如圖4A所示)，進一步測序成功后將質粒瞬時轉染至RAW264.7細胞，72 h后鑒定WB鑒定是否表達，結果顯示轉染后表達成功，如圖4B所示。巨噬細胞的凋亡檢測流式結果圖發(fā)現(xiàn)，轉染pcDNA3.1-Rv3425重組質粒的較轉染空載pcDNA3.1及未作轉染的RAW264.7細胞凋亡的比例明顯增多(流式圖右上象限凋亡細胞比例高達30%)，其典型流式圖如圖4C所示。

3 討論

目前，結核病的診斷技術仍需要改進。結核病的臨床診斷技術主要以傳統(tǒng)的結核菌素(PPD)皮膚試驗、抗酸染色、細菌培養(yǎng)為主。這些技術仍存在一定的局限性，如PPD試驗的假陽性高，無法區(qū)別結核感染與BCG接種；抗酸染色靈敏度低；細菌培養(yǎng)周期長且易污染。后續(xù)研發(fā)的以RD1區(qū)CFP10與ESAT6為刺激抗原的Quanti-FERON-TB Gold In-Tube a及T-SPOT.TB檢測法能將靈敏度提升至80%以上[3]，但仍存在一定程度的漏檢[10,11]?？偟膩碚f，單個或少數(shù)聯(lián)合的抗原靶標已不能滿足TB的檢測，這是目前抗體檢測、IFN-γ檢測靈敏度有待提高的原因，聯(lián)合抗原無論對于血清抗體還是細胞免疫水平的檢測都至關重要[12]。因此，篩選新的、抗原性較強的結核特異性蛋白對于結核病的研究至關重要。

本研究對已有報道的RD區(qū)蛋白Rv3425的抗原免疫學特性進行了更深入的評估，結果顯示Rv3425蛋白是結核分枝桿菌特異性蛋白，能刺激感染小鼠的IFN-γ水平高表達，其刺激效果不亞于結核菌素PPD，如圖2A所示。PPD作為臨床上結核病初篩抗原，不能區(qū)分結核感染與BCG接種，Rv3425相對于BCG來說缺失，且能刺激感染者產生高水平的IFN-γ，可作為結核病細胞免疫診斷的重要靶標。在體液診斷水平上，本研究的結果顯示Rv3425特異性抗體僅存在于結核感染的小鼠中(圖2B)；結核病人血清特異性抗體IgG與IgM水平明顯高于健康人，其作為診斷靶標的靈敏度與特異度都接近于80%，其ROC曲線下面積AUC都較高，分別為0.86與0.79(ACU值越接近1越具有診斷價值)，這說明Rv3425作為靶標抗原用于結核病抗體診斷的方法可作為結核診斷的輔助或初篩手段。巨噬細胞是結核分枝桿菌寄生的主要宿主細胞[13]。許多研究表明，結核分枝桿菌可以調節(jié)巨噬細胞激活固有免疫與適應性免疫從而使自身能夠在巨噬細胞內長期存在和復制[14,15]。為了進一步探討Rv3245蛋白對巨噬細胞的作用，將Rv3425真核表達重組質粒pcDNA3.1-Rv3425轉染至巨噬細胞RAW264.7后考察其對細胞凋亡的影響。未用純化的蛋白直接刺激巨噬細胞，是因為在相關類似研究中大部分此類抗原蛋白只有進入胞內才能發(fā)揮作用[16,17]。我們的結果顯示，Rv3425蛋白在巨噬細胞中能誘導其凋亡，巨噬細胞是結核感染過程中機體發(fā)揮免疫功能的重要細胞，這暗示著Rv3425蛋白可能在結核病的致病機制中特別是結核病干酪樣壞死、肉芽腫的形成中扮演著重要角色。本研究未能深入探討其凋亡機制，但這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為后續(xù)的研究者提供了更多的參考。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Rv3425蛋白具有較強的抗原性，可作為結核診斷的潛在靶標。此外，Rv3425蛋白能一定程度上引起巨噬細胞的凋亡，可能在結核病的致病機制中扮演著重要角色。

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[收稿2016-03-14 修回2016-04-14]

(編輯 許四平)

Research in immunological characteristics of recombinant Rv3425 protein ofmycobacteriumtuberculosis

WANGQian,LUOWei,QUZi-Lu,CHENTie-Long.

DepartmentofPathology,HaiheHospital;KeyResearchLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionforStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300350,China

Objective:To study the immunological characteristics of recombinant Rv3425 protein,to evaluate its diagnosis value and the role in the pathogenicity.Methods: Rv3425 gene was cloned into pET28a vector,the recombinant protein was induced and purified;we analyzed the antigenicity and specificity of Rv3425 by ELISA (Enzyme-linked immuno sorbent assay) and Western blot methods,apoptosis effect of Rv3425 to macrophage was deteced by FCM (Flow cytometry method).Results: Purified prokaryotic expressed protein Rv3425 was acquired,we found Rv3425 could elicit high level of IFN-γ in spleen cells and combine with the serum of iH37Rv (inactivatedmycobacteriumtuberculosis) immunized mice;the specific IgG and IgM antibodies of TB (Tuberculosis) patients were significantly higher than healthy donors;Rv3425 also could induce the necrosis of macrophage.Conclusion: Our study found that Rv3425 had strong antigenicity and could induce the apoptosis of macrophage,these findings were very important for the research of TB diagnosis and pathogenicity.

Mycobacteriumtuberculosis;Rv3425;Antigenicity;Macrophage;Apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.006

王 倩(1984年-)，女，碩士，醫(yī)師，主要從事結核感染免疫的研究，E-mail:115049520@qq.com。

R392

A

1000-484X(2017)01-0031-05

①本文為2014年湖北省科技廳面上項目(2014CFB392)。

②并列第一作者，天津醫(yī)科大學總醫(yī)院檢驗科，天津300350。

③武漢大學基礎醫(yī)學院，武漢430071。

④通訊作者，武漢大學中南醫(yī)院感染科，武漢430071，E-mail: tielong.chen@gmail.com。