陳恩生 崔明珠 趙曉峰 余焙佳 肖長虹 顧為望

(南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣州510515)

合成環(huán)瓜氨酸化蛋白短肽的免疫原性和致關(guān)節(jié)炎性研究①

陳恩生②③崔明珠②趙曉峰 余焙佳②肖長虹②顧為望③

(南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣州510515)

目的：構(gòu)建環(huán)瓜氨酸化蛋白短肽誘導(dǎo)性小鼠關(guān)節(jié)炎模型,探討該短肽的免疫原性、致關(guān)節(jié)炎性。方法：36只DBA/1小鼠隨機(jī)分為3組，于第0天、第21天分別以Ⅱ型膠原(CⅡ，CIA)、環(huán)瓜氨酸化波形蛋白短肽(CCit-Vim，CCV-IA)和偶聯(lián)血藍(lán)蛋白(KLH)的環(huán)瓜氨酸化波形蛋白短肽(CCit-Vim+KLH，CCV+K-IA)皮下注射。ELISA檢測血清抗CⅡ抗體、抗CCit-Vim抗體、抗CCP抗體及TNF-α,間接免疫熒光法(IIF)檢測抗大鼠食管角蛋白抗體(AKA),對關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)、足容積、踝關(guān)節(jié)病理學(xué)進(jìn)行評價。結(jié)果：CCV+K-IA小鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病率為25%(3/12)，但關(guān)節(jié)炎出現(xiàn)時間晚，持續(xù)時間短，發(fā)病率及關(guān)節(jié)炎程度均低于CIA；CCV-IA無關(guān)節(jié)炎發(fā)生。CCV+K-IA產(chǎn)生抗CCit-Vim抗體高于CIA(P=0.031)，產(chǎn)生抗CCP抗體反而低于CIA(P=0.007)。CCV+K-IA、CCV-IA產(chǎn)生的抗CⅡ抗體水平均低于CIA(P<0.05)。CCV+K-IA與CIA的TNF-α高于CCV-IA(P<0.05)。CCV+K-IA的AKA陽性率高于其余兩組(50% vs CCV-IA 25%、CIA 16.67%)。CCV-IA和CCV+K-IA踝關(guān)節(jié)病理顯示輕度滑膜增生，無滑膜血管翳形成及炎性細(xì)胞浸潤。結(jié)論：偶聯(lián)KLH的CCit-Vim短肽不僅具有強(qiáng)的免疫原性，而且具有致關(guān)節(jié)炎性；與CⅡ比較，CCit-Vim+KLH能誘導(dǎo)出更高的AKA陽性率。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；瓜氨酸化短肽；膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎；動物模型

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthiritis，RA)是一種以全身多關(guān)節(jié)對稱性腫痛為特點的慢性炎癥性自身免疫病。近些年來，隨著RA發(fā)病機(jī)制研究的進(jìn)展，瓜氨酸化蛋白及抗瓜氨酸化蛋白抗體(Anti-citrullinated protein antibody,ACPAs)在RA發(fā)病機(jī)制各個環(huán)節(jié)中的作用逐漸被重視，它們在RA的免疫炎癥反應(yīng)啟動和維持過程中都能發(fā)揮重要作用。一些學(xué)者甚至認(rèn)為瓜氨酸化蛋白就是誘導(dǎo)RA啟動炎癥反應(yīng)的靶抗原，并且以瓜氨酸化蛋白為誘導(dǎo)劑成功建立關(guān)節(jié)炎鼠模型[1-5]。但是由于瓜氨酸化蛋白種類、誘導(dǎo)方式、注射劑量及實驗動物遺傳背景的不同，這些模型間表現(xiàn)出不盡相同的關(guān)節(jié)炎特點，而且與人類RA也存在諸多差異。因此，尋找一種合適的瓜氨酸化蛋白或短肽、采用統(tǒng)一的造模方法來研制更接近人類RA病情特點的瓜氨酸化蛋白誘導(dǎo)性RA模型具有重要的實用意義。

早在1998年，Schellekens等[6]便揭示瓜氨酸化絲聚蛋白短肽具有免疫原性，能促進(jìn)瓜氨酸特異性T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)及細(xì)胞因子的釋放；隨后他首次合成環(huán)瓜氨酸短肽(Cyclic citrullinated peptide,CCP)，揭示CCP比線性形式具有更強(qiáng)的免疫原性，而且能被RA患者血清中的抗CCP抗體識別，首次揭示瓜氨酸化蛋白短肽在RA中的重要意義[7]。隨著研究的深入，人們不斷發(fā)現(xiàn)來源于瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化纖維蛋白的短肽能誘導(dǎo)特異性的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子，具有抗原性[8，9]。但是，這些瓜氨酸化蛋白短肽是否有致關(guān)節(jié)炎性，目前國內(nèi)外尚無系統(tǒng)報道。雖然申洪波[10]于2010年使用合成的CCP短肽抗原(抗原分子結(jié)構(gòu)未說明)與完全弗氏佐劑混合后于SD大鼠雙側(cè)足底部進(jìn)行注射免疫，誘導(dǎo)出產(chǎn)生抗CCP抗體、抗大鼠食管角質(zhì)蛋白抗體(Anti-Keratin antibodies,AKA)等自身抗體的關(guān)節(jié)炎模型，但該模型關(guān)節(jié)炎的發(fā)生是否由CCP直接引起尚不能確認(rèn)，因為從報道的免疫方法及關(guān)節(jié)炎發(fā)病特點來看，似乎更像是一個佐劑誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎。

2010年Feitsma等[8]篩選到瓜氨酸化波形蛋白第 26～44位氨基酸序列SSXSYVTTSTXTYSLGSAL的短肽(X為瓜氨酸)具有較強(qiáng)免疫原性，是人類RA ACPAs的候選靶抗原，然而這一短肽究竟是否有致關(guān)節(jié)炎作用目前尚沒有明確結(jié)論。為此，我們參照CCP的合成方法[7]合成環(huán)狀瓜氨酸化波形蛋白短肽(Cyclic citrullinated vimentin,CCit-Vim)，通過免疫DBA/1小鼠來探討該短肽的免疫原性及誘發(fā)關(guān)節(jié)炎模型的可行性，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 36只雌性DBA/1小鼠，SPF級，8～10周，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[ SCXK(京)2012-0001]。飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學(xué)東莞松山湖實驗動物科技園SPF級小動物房?？刂茥l件為：溫度(23±2)℃、濕度(55±2)%，每日光照/黑暗各12 h，自由進(jìn)食、飲水；飼料由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心生產(chǎn)提供，更換墊料2次/周。

1.1.2 主要試劑與儀器 雞Ⅱ型膠原蛋白(Type Ⅱ Collange,CⅡ)、完全/不完全弗氏佐劑(Sigma,美國)，AKA間接免疫熒光(Indirect Immunofluore-scence,IIF)檢測試劑盒(歐蒙，德國)，抗CⅡ抗體、抗CCP抗體、TNF-α等ELISA檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，單組分TMB顯色液(HyClone，美國)；精密勻漿器(PRO200，美國)，酶標(biāo)儀(Thermo SCIENTIFIC，美國)，生化培養(yǎng)箱(一恒科技有限公司，上海)，足趾容積測量儀(PV-200，成都泰盟軟件有限公司)，包埋機(jī)(LEICA EG1160，德國)，全自動脫水機(jī)(LEICA TP1020，德國)，石蠟輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(LEICA RM2245，德國),熒光顯微鏡及成像系統(tǒng)(OLYMPUS BX43)。

1.2 方法

1.2.1 模型制作

1.2.1.1 短肽乳化液制備 4 mg 雞CⅡ,加入0.1 mol/L乙酸溶液2 ml，4℃攪拌過夜，配制成2 mg/ml 的CⅡ溶液；4 mg CCit-Vim粉末,溶于2 ml 1×PBS中，配成2 mg/ml 的CCit-Vim溶液。在超凈臺中，使用精密勻漿器分別將2 mg/ml的CⅡ溶液、CCit-Vim溶液與CCit-Vim+KLH溶液2 ml與等體積的完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑混勻乳化,終濃度為1 mg/ml。乳化條件為冰浴上操作，勻漿器25 000 r/min,2.0 min,暫停2.0 min，反復(fù)4次，至形成油包水白色乳液，滴至水中不擴(kuò)散為好。

1.2.1.2 小鼠分組 36只雌性DBA/1小鼠隨機(jī)分為3組，每組12只，分別為CⅡ組(CIA)，CCit-Vim組(CCV-IA)和CCit-Vim+KLH組(CCV+K-IA)。各組周齡、體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),于SPF級環(huán)境條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2.1.3 造模 三組小鼠均于第0天進(jìn)行初次免疫及第21天進(jìn)行強(qiáng)化免疫。免疫前，將小鼠按40 mg/kg予0.3%的戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，背部脫毛處理后，于鼠背部及尾根部多點皮下注射乳化劑。初次免疫時，分別注射CⅡ、CCit-Vim和CCit-Vim+KLH乳化液各0.2 ml/只。強(qiáng)化免疫時注射方法、部位同初次注射，劑量各為0.1 ml/只。

1.2.2 模型評價

1.2.2.1 關(guān)節(jié)炎指數(shù)及關(guān)節(jié)腫脹程度評價 造模前及造模后每周觀察小鼠關(guān)節(jié)紅腫情況，并測量小鼠足容積。①計算關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Arthritic index,AI)評分。AI的評分標(biāo)準(zhǔn)如下[11]：各足根據(jù)關(guān)節(jié)紅腫程度評為0～4分。0分：無關(guān)節(jié)紅腫；1分：踝關(guān)節(jié)或足趾的輕度紅腫；2分：踝關(guān)節(jié)的中度紅腫；3：包括趾關(guān)節(jié)在內(nèi)的全足明顯紅腫；4分：多足明顯紅腫伴關(guān)節(jié)變形、功能障礙。每只小鼠的AI評分最高為16分?！?分為造模成功。②使用專用的小鼠足趾容積測量儀測量小鼠雙后足足容積變化。

1.2.2.2 血清學(xué)檢測 第13周，小鼠麻醉后，摘眼球采血法取血，3 500 r/min離心15 min后獲取血清置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。抗CⅡ抗體、抗CCP抗體、TNF-α水平：根據(jù)相關(guān)抗體的ELISA檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作?？笴Cit-Vim短肽抗體：ELISA法檢測：pH7.4的1×PBS溶解CCit-Vim短肽(等電點5.51)至終濃度20 μg/ml，先用100 μl短肽抗原包被96孔酶標(biāo)板，采用HRP標(biāo)記的羊抗鼠通用型二抗，TMB顯色，酶標(biāo)儀讀取450nm的OD值。AKA：根據(jù)試劑盒說明書操作，IIF檢測法定性檢測，待測血清5倍稀釋,熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2.3 病理學(xué)檢測 獲取小鼠后踝關(guān)節(jié)，常規(guī)固定脫鈣、脫水和石蠟包埋，切片厚度4 μm，進(jìn)行HE染色。半定量評分法評價滑膜增生程度,評分標(biāo)準(zhǔn)如下[12]：滑膜增生程度分為0～4分；0分：無滑膜增生；1分：滑膜增生,滑膜成纖維細(xì)胞密度低,未能侵犯到皮下組織；2分：滑膜成纖維細(xì)胞密度較高，并侵犯到小鼠皮下組織；3分：在2分的基礎(chǔ),滑膜組織內(nèi)或侵犯區(qū)出現(xiàn)纖維化壞死結(jié)節(jié)；4分：除有3分的表現(xiàn)外,還見到至少一個以上類似生發(fā)中心的滑膜細(xì)胞簇集區(qū)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的臨床表現(xiàn) 如圖1 A1～A3所示，CIA小鼠于首次免疫后第4周陸續(xù)出現(xiàn)足關(guān)節(jié)紅腫，前后足均發(fā)病，以雙后足為主，逐漸加重，約第8周紅腫達(dá)高峰，部分關(guān)節(jié)出現(xiàn)活動受限，隨后逐漸消退；其發(fā)病率為100%(12/12)，AI值最高達(dá)14分。CCV-IA小鼠在整個觀察周期內(nèi)均未見明顯足關(guān)節(jié)紅腫及關(guān)節(jié)活動受限，其發(fā)病率為0(0/12)。而CCV+K-IA小鼠于首次免疫后第5周開始觀察到1只小鼠單個后足趾中度紅腫，逐漸減輕，持續(xù)2周余，后恢復(fù)正常；另2只小鼠于第6周才出現(xiàn)輕微的后足跖部紅腫，持續(xù)至第8周急速加重，以雙后足明顯紅腫為主，伴關(guān)節(jié)活動受限，隨后又快速減輕，約1周后紅腫基本消退，其發(fā)病率為25%(3/12)，AI值最高8分。其中，AI分析顯示，CIA小鼠的AI明顯高于其余兩組(P<0.05),而CCV+K-IA和CCV-IA組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.543)；雙后足關(guān)節(jié)足容積變化情況分析與AI的統(tǒng)計分析相似(如圖2所示)。

圖1 三組小鼠的足紅腫表現(xiàn)和組織病理學(xué)HE染色(×200)Fig.1 Swelling and HE staining of ankle joints of three groups of mice(×200)Note:CIA.A1，B1；CCV-IA.A2，B2;CCV+K-IA.A3，B3.

圖2 不同時間點的關(guān)節(jié)炎指數(shù)(A)和雙后足足容積(B)變化Fig.2 Changes of AI (A)and volume of double hind paw(B) at different time points in three groups of mice

2.2 血清抗體及TNF-α結(jié)果 三組小鼠均產(chǎn)生不同水平的抗CⅡ、抗CCit-Vim短肽抗體以及抗CCP抗體(如圖3所示)，這提示經(jīng)CCit-Vim或CCit-Vim+KLH短肽誘導(dǎo)，即使無臨床可見關(guān)節(jié)炎的小鼠，也存在對短肽產(chǎn)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)。其中抗CⅡ抗體水平,CCV-IA和CCV+K-IA均明顯低于CIA[ (15.73± 2.10)、(16.71 ± 3.03) vs (19.50 ± 2.36) μg/L,P<0.05]提示CCit-Vim與CⅡ可能有共同抗原決定簇。我們檢測了2種瓜氨酸化表位特異性抗體水平，一是抗CCit-Vim短肽抗體，CCV+K-IA高于CIA[ (1.32 ± 0.59) vs (0.78 ± 0.27),P=0.031]，但與CCV-IA差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.157)。二是抗CCP抗體：CCV+K-IA反而明顯低于CIA[ (54.73 ± 7.33) vs(64.37 ± 9.91) ng/L,P=0.007]，與CCV-IA抗體水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.119)。這說明CCit-Vim短肽能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生特異性的抗CCit-Vim抗體，但由于單純的短肽免疫原性弱，而偶聯(lián)KLH的短肽免疫原性明顯增強(qiáng)，免疫應(yīng)答增強(qiáng)，產(chǎn)生更高水平特異性抗體(與CIA比較)。同時也提示，CⅡ可能含有CCP抗原決定簇，而CCit-Vim短肽與CCP的抗原性差異較大。

為進(jìn)一步證實是否產(chǎn)生抗瓜氨酸抗體，我們又采用IIF法觀察血清中AKA情況。如圖4所示，CCV+K-IA有6份小鼠血清AKA陽性(陽性率50%)，而CCV-IA僅有3份血清陽性(陽性率25%)，CIA僅2份血清陽性(16.67%)。未出意外的是，CCV+K-IA的3只發(fā)病小鼠血清AKA均出現(xiàn)陽性，說明CCit-Vim與誘導(dǎo)AKA的絲聚蛋白可能有相似的抗原決定簇。盡管CⅡ能誘導(dǎo)更多的抗CCP抗體產(chǎn)生，但并不能誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的AKA，提示AKA與抗CCP抗體針對的靶抗原有差異。

圖3 血清抗體和TNF-α水平Fig.3 Levels of serum antibody and TNF-αNote: *.P<0.05 vs CIA;#.P<0.05 vs CCV-IA.

圖4 血清AKA(×200)Fig.4 Serum AKA with IIF(×200)Note: A.AKA positive from positive control serum;B.AKA positive from CCV+K-IA；C.AKA negative from CIA;D.The positive rate of AKA in three groups.

血清TNF-α水平在發(fā)生關(guān)節(jié)炎的CCV+K-IV與CIA相當(dāng)(P=0.276)，而且均高于無關(guān)節(jié)炎的CCV-IA，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[ (645.61 ± 35.26)、(618.98 ± 53.32) vs (533.63 ± 79.49) ng/L,P<0.05]。

2.3 關(guān)節(jié)組織病理學(xué) 三組小鼠踝關(guān)節(jié)HE染色(圖1 B1～B3)顯示：CIA的小鼠踝關(guān)節(jié)腔周圍滑膜組織明顯增生并突入關(guān)節(jié)腔，滑膜血管翳形成，侵蝕軟骨表面或骨膜，增生的滑膜組織侵犯皮下，部分形成纖維硬化灶，伴滑膜內(nèi)大量的炎性細(xì)胞浸潤。而CCV-IA和CCV+K-IA小鼠踝關(guān)節(jié)僅見輕度的滑膜增生向關(guān)節(jié)腔內(nèi)生長，滑膜細(xì)胞在3～5層間，少數(shù)可見侵犯軟骨表面，無明顯滑膜血管翳形成及炎性細(xì)胞浸潤。如圖5所示,CIA小鼠踝關(guān)節(jié)在滑膜增生程度上明顯高于CCV-IA和CCV+K-IA[ (1.33±0.49)、(1.33±0.65) vs(2.58±1.16),P<0.05],CCV-IA和CCV+K-IA組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=1.00)。

圖5 踝關(guān)節(jié)滑膜增生評分Fig.5 Score of ankle synovial hyperplasiaNote: *.P<0.05 vs CIA.

3 討論

本實驗偶聯(lián)KLH的CCV+K-IA有3只小鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎，而單純短肽的CCV-IA小鼠無關(guān)節(jié)炎發(fā)生，說明偶聯(lián)短肽抗原性增強(qiáng)，具有致關(guān)節(jié)炎性。CCV+K-IA的發(fā)病率僅為25%，與瓜氨酸化纖維蛋白原誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型接近(35.5%)[2]，但遠(yuǎn)低于其余幾個瓜氨酸化蛋白誘導(dǎo)性鼠模型及陽性對照組CIA的發(fā)病率(100%)[1，3-5]。CCV+K-IA關(guān)節(jié)炎小鼠以雙后足受累關(guān)節(jié)為主，典型關(guān)節(jié)炎特征于首次免疫后第8周才出現(xiàn)，而且呈急速加重、快速緩解、持續(xù)時間短的特點，這與既往的瓜氨酸化蛋白誘導(dǎo)性鼠模型及CIA的特點不相同。踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)可見滑膜組織缺乏明顯的炎性細(xì)胞浸潤，與瓜氨酸化纖維蛋白原和瓜氨酸化α烯醇酶誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因鼠模型的病理學(xué)特點相似[2，3]，提示該模型的病理過程中應(yīng)該出現(xiàn)一個發(fā)生在我們獲取關(guān)節(jié)病理檢查前的短暫的急性炎性細(xì)胞浸潤過程，足以導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎發(fā)生，而又快速消退。這與該組小鼠關(guān)節(jié)紅腫呈急速加重、快速緩解的臨床特點也相符合。但其輕度滑膜增生、無明顯骨質(zhì)破壞的病理學(xué)特點，與CIA也存在較大差異。

實驗顯示三組小鼠均產(chǎn)生不同水平的抗CⅡ抗體、抗CCit-Vim短肽抗體、抗CCP抗體，提示CCit-Vim短肽引起了免疫系統(tǒng)的應(yīng)答反應(yīng)。有研究表明針對瓜氨酸化蛋白的ACPAs具有致關(guān)節(jié)炎的作用[13]。本實驗CCV+K-IA產(chǎn)生抗CCit-Vim短肽抗體的能力高于CCV-IA和CIA，表明CCit-Vim+KLH偶聯(lián)肽免疫原性增強(qiáng)，顯著增強(qiáng)免疫系統(tǒng)針對短肽中瓜氨酸抗原表位的應(yīng)答能力，產(chǎn)生較大量的ACPAs足以產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎。針對血清中的抗CCP抗體，卻出現(xiàn)與抗CⅡ抗體相似的結(jié)果即CCV+K-IA明顯低于CIA，提示CⅡ可能含有CCP的抗原決定簇，誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的抗CCP抗體，揭示CⅡ與CCP存在較多的同源性?？笴CP抗體識別的靶抗原是來源于瓜氨酸化絲聚蛋白的CCP短肽[7]，而本實驗的抗CCit-Vim短肽抗體識別的靶抗原是來源于瓜氨酸化波形蛋白的CCit-Vim；CCV+K-IA與CIA的血清抗CCit-Vim短肽抗體與抗CCP抗體水平的不對應(yīng)，正好說明它們識別的靶抗原不同，揭示CCit-Vim與CCP同源性相差較遠(yuǎn)，抗原性差異較大。有趣的是，血清AKA的陽性率，CCV+K-IA明顯高于CIA(50% vs 16.67%)，與抗CCit-Vim短肽抗體結(jié)果類似，揭示CCit-Vim與誘導(dǎo)AKA的角質(zhì)蛋白可能有相似的抗原決定簇，抗CCit-Vim短肽抗體與AKA具有更近的同源性。盡管CⅡ能誘導(dǎo)更多的抗CCP抗體產(chǎn)生，但并不能誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的AKA，提示AKA與抗CCP抗體針對的瓜氨酸化絲聚蛋白靶抗原依然存在差異。未出意外的是，3只發(fā)生關(guān)節(jié)炎的CCV+K-IA小鼠血清AKA均陽性，這個臨床表現(xiàn)與血清學(xué)表現(xiàn)相對應(yīng)正好證明這個關(guān)節(jié)炎模型的可靠性，提示那些血清AKA陽性而未發(fā)生關(guān)節(jié)炎的小鼠已經(jīng)對短肽發(fā)生特異性免疫應(yīng)答，如果隨著觀察周期的延長也可能出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎，當(dāng)然，這有待進(jìn)一步的實驗研究證實。目前已有許多研究表明多種來源于瓜氨酸化纖維蛋白α、β鏈、瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化絲聚蛋白的短肽能被RA患者血清中的抗瓜氨酸化蛋白短肽抗體特異性識別，這些短肽抗體具有類似同源ACPAs的功能，在RA的診斷及疾病預(yù)測上發(fā)揮重要作用[14-16]。因此，上述這些結(jié)果表明，在RA的臨床診斷過程中，特別是對于那些抗CCP抗體陰性的RA患者，多種ACPAs聯(lián)合檢測對提高RA的診斷效能具有重要的意義。

本研究首次以人工合成的環(huán)瓜氨酸化波形蛋白短肽為抗原誘導(dǎo)劑研制環(huán)瓜氨酸化蛋白短肽誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型。盡管目前該模型尚達(dá)不到我們預(yù)期的目標(biāo)，其關(guān)節(jié)炎發(fā)病特點、免疫學(xué)、病理學(xué)特征與CIA以及人類RA尚存在諸多差異，但是我們已能確定偶聯(lián)KLH的環(huán)狀瓜氨酸化蛋白短肽不僅具有較強(qiáng)免疫原性，而且具有致關(guān)節(jié)炎性。這對我們接下來如何去提高該模型的發(fā)病率、延長關(guān)節(jié)炎持續(xù)時間等方面的研究提供新的方向和思路：①優(yōu)化瓜氨酸化蛋白短肽結(jié)構(gòu)。短肽雖不具有復(fù)雜的三、四級空間結(jié)構(gòu)，但其一級、二級結(jié)構(gòu)同樣影響短肽的性能。研究已經(jīng)證實β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的環(huán)狀短肽具有更好的誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的性能[7，17]，因此環(huán)狀短肽合成過程中確保類似β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)是研究的一個關(guān)鍵點。另外，適當(dāng)增加短肽的氨基酸數(shù)目以增加短肽的分子量并擴(kuò)展短肽中更多的瓜氨酸抗原表位，也是確保短肽具有強(qiáng)抗原性的方法之一。②偶聯(lián)蛋白的選擇。KLH是抗體工程最常用的一種偶聯(lián)蛋白，能增強(qiáng)相關(guān)短肽的免疫性。本實驗驗證了偶聯(lián)KLH的短肽抗原性增強(qiáng)，并且成功誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎。③實驗動物遺傳背景選擇。遺傳背景對制作RA的實驗動物模型至關(guān)重要，選擇特定遺傳背景的實驗動物是確保環(huán)瓜氨酸化蛋白短肽誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型成功的關(guān)鍵。

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[收稿2016-04-22 修回2016-06-05]

(編輯 張曉舟)

Study on immunogenicity and arthritogenicity of a synthetic cyclic citrullina-ted peptide

CHENEn-Sheng,CUIMing-Zhu,ZHAOXiao-Feng,YUBei-Jia,XIAOChang-Hong，GUWei-Wang.

TCM-IntegratedHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515，China

Objective:To establish a synthetic cyclic citrullinated peptide induced arthritis model in mice,explore immunogenicity and arthritogenicity of this peptide.Methods: 36 DBA/1 mice were randomly divided into three groups,which were injected the type Ⅱ collagen(CⅡ,CIA)emulsion,cyclic citrullinated vimentin peptide (CCit-Vim,CCV-IA)emulsion,cyclic citrullinated vimentin peptide conjugated KLH (CCit-Vim+KLH,CCV+K-IA)emulsion on day 0 and 21,respectively.Using arthritis index(AI),paw swelling to evaluate the incidence of arthritis;ELISA tested serum anti-CCit-Vim antibody,anti-CⅡantibody,anti-CCP antibody and TNF-α,IIF detected AKA;Histopathology of the ankle joint was obsearved.Results: There were three mice appeared arthritis in CCV+K-IA,the incidence rate of 25%,but arthritis occurs later time,short duration,and the incidence and extent of arthritis were lower than the CIA.CCV-IA no arthritis performance.CCV+K-IA produce anti-CCit-Vim antibody were significantly higher than those in CIA (1.32±0.59 vs 0.78±0.27,P=0.031).While Anti-CCP antibody of CCV+K-IA were significantly lower than CIA (54.73±7.33 vs 64.37±9.91,P=0.007).The anti-CⅡ antibody in CCV+K-IA and CCV-IA were lower than the CIA(15.73±2.10，16.71±3.03 vs 19.50±2.36,P<0.05).The TNF-α produced by CCV+K-IA and CIA were both significantly higher than the CCV-IA (645.61±35.26，618.98±53.32 vs 533.63±79.49,P<0.05).The AKA positive rate of CCV+K-IA is 50% (6/12),significantly higher than CCV-IA 25% (3/12) and CIA 16.67% (2/12).Histopathology of the ankle showed that the CCV-IA and CCV+K-IA have a mild synovial hyperplasia,no obvious synovial pannus formation and inflammatory cell infiltration.Conclusion: The cyclic citrullinated peptide conjugated KLH not only has stronger immunogenicity but also has arthritogenicity.It induced a higher positive rate of AKA than CⅡ.

Rheumatoid arthiritis；Citrullinated peptide；Collagen induced arthritis；Animal model

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.005

陳恩生(1983年-)，男，主治醫(yī)師，主要從事風(fēng)濕病的臨床與基礎(chǔ)研究，E-mail:chenensheng1@163.com。

及指導(dǎo)教師：肖長虹(1964年-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事風(fēng)濕病的基礎(chǔ)與臨床研究及風(fēng)濕病疾病動物模型研制，E-mail:chnghngxiao@aliyun.com。 顧為望(1956年-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事實驗動物培育、人類疾病動物模型制備與比較醫(yī)學(xué)方面的研究，E-mail:guww100@163.com。

R392.9

A

1000-484X(2017)01-0025-06

①本文為廣東省科技計劃項目(No.2014A030304025)。

②南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣州510515。

③南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(比較醫(yī)學(xué)研究所)，廣州510515。