河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院呼吸科，河北 石家莊050051

艾瑞昔布抑制肺腺癌A549細胞裸鼠移植瘤侵襲和轉(zhuǎn)移及其機制

王玲嬋，崔立靜，王東昌，趙云霞，趙志芳，陳 剛

河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院呼吸科，河北 石家莊050051

背景與目的：環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)與肺癌血管生成、淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，COX-2抑制劑能夠抑制肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移。該研究探討COX-2抑制劑艾瑞昔布能否抑制肺腺癌A549細胞裸鼠移植瘤侵襲和轉(zhuǎn)移及其機制，以及與洛鉑聯(lián)合應(yīng)用的療效。方法：將肺腺癌A549細胞接種于30只BALB/c雄性裸鼠右側(cè)腋部皮下，建立移植瘤模型。將造模成功裸鼠(n=29)隨機分為4組：對照組(n=7)、艾瑞昔布組(n=8)、洛鉑組(n=7)和艾瑞昔布聯(lián)合洛鉑組(n=7)。對照組灌胃等量滅菌蒸餾水及尾靜脈注射等量0.9%NaCl溶液，治療組分別給予灌胃艾瑞昔布片每日40 mg/kg及尾靜脈注射洛鉑每周7.5 mg/kg相應(yīng)處理。每日觀察裸鼠飲食、活動等一般情況。給藥6周后處死裸鼠，剝?nèi)∫浦擦鼋M織。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法和real-time PCR分別檢測各組腫瘤PTEN、cortactin蛋白及相應(yīng)mRNA表達水平。采用單因素方差分析及非參數(shù)檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果：最后1周發(fā)現(xiàn)所有裸鼠飲食、活動較之前減少，逐漸消瘦，洛鉑組及聯(lián)合組變化較明顯。與對照組相比，艾瑞昔布組及聯(lián)合組PTEN蛋白及其mRNA表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.001)；與對照組相比，艾瑞昔布組及聯(lián)合組cortactin蛋白及其mRNA表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.001)。PTEN與cortactin蛋白、PTEN mRNA與cortactin mRNA均呈顯著負相關(guān)(r=-0.660、-0.983，P均<0.001)。結(jié)論：艾瑞昔布能夠抑制非小細胞肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移，其作用機制可能與上調(diào)PTEN蛋白及下調(diào)cortactin蛋白表達有關(guān)。艾瑞昔布對洛鉑化療可能具有增敏作用。

非小細胞肺癌；侵襲轉(zhuǎn)移；艾瑞昔布；PTEN；皮層肌動蛋白

肺癌的發(fā)病率、死亡率均居全球惡性腫瘤首位，5年生存率僅10% ～15%。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占85%，約70%的NSCLC確診時處于晚期，對放化療不敏感及耐藥性的出現(xiàn)使肺癌療效不理想［1］。干預(yù)肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移是肺癌治療的突破點。有研究表明，環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)與NSCLC血管生成、淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)［2］，COX-2抑制劑塞來昔布、尼美舒利等能夠抑制肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移［3-4］。PTEN是目前發(fā)現(xiàn)的第一個具有蛋白磷酸酶活性和脂質(zhì)磷酸酶活性的新型抑癌基因，其N端序列與張力蛋白同源且參與細胞之間黏附，其脂質(zhì)磷酸酶能夠影響細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用，參與NSCLC侵襲和轉(zhuǎn)移［5］。皮層肌動蛋白(cortactin)是一種聚集在皮質(zhì)亞細胞且能與絲狀肌動蛋白(F-actin)結(jié)合的蛋白質(zhì)，通過影響細胞外基質(zhì)降解、細胞黏附等多種機制參與NSCLC侵襲和轉(zhuǎn)移［6］。

新型適度選擇性COX-2抑制劑艾瑞昔布目前主要用于治療骨性關(guān)節(jié)炎。關(guān)于艾瑞昔布與肺癌的研究較少，本研究應(yīng)用艾瑞昔布對肺腺癌A549細胞裸鼠移植瘤模型進行干預(yù)，觀察PTEN、cortactin及相應(yīng)mRNA表達的變化，從而探討其能否抑制肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移及機制，并觀察其與化療藥物洛鉑聯(lián)合應(yīng)用的療效。

1 材料和方法

1.1 細胞株和實驗動物

肺腺癌A549細胞株購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部。健康清潔級BALB/c雄性裸鼠30只，4 ～5周齡，體重20 ～24g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司(合格證編號：SCXY-京-2009-0004)。在IVC環(huán)境中應(yīng)用無菌飼料及滅菌純凈水飼養(yǎng)裸鼠，環(huán)境溫度、濕度適宜。

1.2 主要試劑

艾瑞昔布片購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司(批準文號：國藥準字H20110041，產(chǎn)品批號：N0083)。注射用洛鉑購自海南長安國際制藥有限公司(批準文號：國藥準字H20080358，產(chǎn)品批號：20140101)。PTEN兔抗人多克隆抗體購自美國Bioworld公司(產(chǎn)品編號BS1305，濃度1∶100)。Cortactin兔抗人單克隆抗體購自英國Abcam公司(產(chǎn)品編號：ab81208，濃度1∶200)。兔SP檢測試劑盒等購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。超純RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mix(With ROX)等購自寶生物工程(大連)有限公司。

使用F12k培養(yǎng)基在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A549細胞。將對數(shù)生長期A549細胞制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×107個/mL，取0.2 mL接種于裸鼠右腋部皮下。

1.4 裸鼠分組與處理

腫瘤平均直徑約4 mm為成瘤標準，將29只造模成功裸鼠隨機分為4組。對照組(n=7)：灌胃等量滅菌蒸餾水和尾靜脈注射等量0.9%NaC溶液；艾瑞昔布組(n=8)：灌胃艾瑞昔布片每日40 mg/kg，尾靜脈注射等量0.9%NaCl溶液；洛鉑組(n=7)：尾靜脈注射洛鉑每周7.5 mg/kg，灌胃等量滅菌蒸餾水；艾瑞昔布聯(lián)合洛鉑組(n=7)：灌胃艾瑞昔布片每日40 mg/kg，尾靜脈注射洛鉑每周7.5 mg/kg。每日觀察裸鼠精神、飲食、活動、皮膚黏膜有無出血及排便等情況。給藥6周后處死裸鼠，將剝?nèi)〉哪[瘤組織保存于4%多聚甲醛溶液中。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織PTEN、cortactin蛋白表達

采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)(SP)法。常規(guī)石蠟切片脫蠟水化，EDTA抗原熱修復(fù)10 min，3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶15 min，正常山羊血清封閉30 min，滴加一抗，4 ℃過夜，滴加二抗，在37 ℃烘箱培育30 min，滴加辣根過氧化酶標記的鏈霉素卵白素，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，以0.01 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液作為陰性對照。于400倍顯微鏡下隨機選取5個視野，對PTEN、cortactin蛋白進行染色評分。標準為染色強度“-”著色同空白對照，“+”為淺染黃色，“++”為棕黃色，“+++”為黃褐色，依次記為0、1、2、3分；陽性細胞比率為陰性、1% ～25%、26% ～50%、51% ～75%、76% ～100%、依次記為0、1、2、3、4分；積分為二者之積。

1.6 Real-time PCR檢測腫瘤組織PTEN、cortactin mRNA表達

取50 mg腫瘤組織加入1 mL TRIzol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA。GAPDH基因上游引物：5’-TGGAGTCTACTGGCGTCTT-3’，下游引物：5’-TGTCATATTTCTCGTGGTTCA-3’；PTEN基因上游引物：5’-ATGACAGCCATCATC AAAGA-3’，下游引物：5’-CACCTTCAAGTCTT TCTGCA-3’；cortactin基因上游引物：5’GGAGTACTATTTATATTAGC-3’，下游引物：5’-TGCTAATGAACGGATCATTC-3’。PCR熱循環(huán)首先為95 ℃10 min，隨后為95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，68 ℃ 40 s，進行4個循環(huán)。按照2-△△ct相對定量計算公式即ΔΔCt=(Ct實驗組目的基因平均值-Ct實驗組管家基因平均值) (Ct對照組目的基因平均值-Ct對照組管家基因平均值)計算出各樣品目的基因mRNA相對含量。

pH計在1～10pH 以外不具備良好的線性關(guān)系, 在強酸性溶液中易形成大量水合氫離子(H3O+)，使到達電極表面的氫離子數(shù)目相對減少，pH 值增大；而在強堿介質(zhì)中的鈉離子也會參加溶液中的氫離子與電極水化層上的氫離子的交換過程(鈉差)[5], 導(dǎo)致玻璃電極電位升高，致使pH值偏低，應(yīng)在實驗過程中注意。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)分布數(shù)據(jù)以非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)(最小值，最大值)表示。正態(tài)分布且方差齊資料采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LS檢驗。非正態(tài)分布資料采用非參數(shù)檢驗，采用Pearson或Spearman相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠成瘤及一般情況

接種30只裸鼠，29只成瘤，成瘤時間集中在第7 ～12天。隨著腫瘤體積不斷增大，最后1周發(fā)現(xiàn)各組裸鼠飲食、活動較前減少，逐漸消瘦，洛鉑組及艾瑞昔布聯(lián)合洛鉑組變化較明顯。實驗期間所有裸鼠皮膚黏膜均未出血，排便未見異常(圖1)。

圖 1 6周后各組肺腺癌A549細胞裸鼠移植瘤生長比較Fig. 1 Comparison of the growth of lung adenocarcinoma A549 cell xenografts in nude mice of different groups after 6 weeks

2.2 艾瑞昔布對腫瘤PTEN、cortactin蛋白達的影響

PTEN蛋白陽性表達產(chǎn)物主要為細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒(圖2)。PTEN蛋白表達在艾瑞昔布組、洛鉑組及聯(lián)合組均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義［2(1,3)、2(2,3)、4(2,4)和1(0,1)，Z=-2.773、-1.275、-3.220，P=0.006、0.001、0.001］；聯(lián)合組表達高于艾瑞昔布組、洛鉑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義［4(2,4)、2(1,3)和2(2,3)，Z=-2.726、-2.453，P=0.006、0.014］；艾瑞昔布組表達較洛鉑組降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義［2(1,3)和2(2,3)，Z=-1.275，P=0.202，表1］。Cortactin蛋白陽性表達產(chǎn)物為細胞質(zhì)或細胞核(少量)出現(xiàn)棕黃色顆粒(圖2)。Cortactin蛋白表達在艾瑞昔布組、聯(lián)合組均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義［4(3,4)、1(0,2)和6(4,6)，Z=-2.442、-3.202，P=0.015和P=0.001］；洛鉑組低于對照組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義［4(2,6)和6(4,6)，Z=-1.214，P=0.225］；聯(lián)合組表達低于艾瑞昔布組、洛鉑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義［1(0,2)、4(3,4)和4(2,6)，Z=-3.228、-3.071，P=0.001、0.002］；艾瑞昔布組表達較洛鉑組輕度升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義［4(3,4)和4(2,6)，Z=-1.120，P=0.263，表1］。

圖 2 PTEN和cortactin蛋白在各組腫瘤組織陽性表達Fig. 2 Positive expression of PTEN and cortactin protein in tumor tissues of different groups

表 1 各組腫瘤組織PTEN和cortactin蛋白表達［中位數(shù) (最小值，最大值)］Tab. 1 Expression of PTEN and cortactin protein in tumor tissues of different groups [Medium (Min, Max)]

2.3 艾瑞昔布對腫瘤PTEN mRNA、cortactin mRNA表達的影響

PTEN mRNA的表達在艾瑞昔布組、洛鉑組及聯(lián)合組均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(2.340±0.043、2.371±0.021、3.105±0.071和1.080±0.046，P均<0.001)；聯(lián)合組高于艾瑞昔布組、洛鉑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(3.105±0.071、2.340±0.043和2.371±0.021，P均<0.001)；艾瑞昔布組低于洛鉑組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(2.340±0.043和2.371±0.021，P=0.242，表2)。Cortactin mRNA的表達在艾瑞昔布組、洛鉑組及聯(lián)合組均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(0.549±0.011、0.556±0.014、0.388±0.014和1.039±0.026，P均<0.001)；聯(lián)合組低于艾瑞昔布組、洛鉑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(0.388±0.014、0.549±0.011和0.556±0.014，P均<0.001)；艾瑞昔布組含量較洛鉑組輕度降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(0.549±0.011和0.556±0.014，P=0.418，表2)。

表 2 各組腫瘤組織PTEN和cortactin mRNA表達Tab. 2 Expression of PTEN and cortactin mRNA in tumor tissues of different groups

表 2 各組腫瘤組織PTEN和cortactin mRNA表達Tab. 2 Expression of PTEN and cortactin mRNA in tumor tissues of different groups

*: P<0.05, as compared with control group;△: P<0.05, as compared with imrecoxib combined with lobaplatin group

?

2.4 PTEN與cortactin相關(guān)性分析

各組腫瘤組織中PTEN與cortactin蛋白呈顯著負相關(guān)(r=-0.660，P<0.001)；PTEN mRNA與cortactin mRNA呈顯著負相關(guān)(r=-0.983，P<0.001)。

3 討論

新型適度選擇性COX-2抑制劑艾瑞昔布能夠保持COX-1和COX-2動態(tài)平衡，在抗炎鎮(zhèn)痛基礎(chǔ)上維持前列環(huán)素和血栓烷A2之間功能平衡，減少胃腸道出血及嚴重心血管血栓性不良事件、心肌梗死和中風的風險［7］。洛鉑作為第3代鉑類抗腫瘤藥物，不與順鉑和卡鉑產(chǎn)生交叉耐藥，具有減少順鉑腎臟毒性、奧沙利鉑神經(jīng)毒性等優(yōu)勢［8］。目前關(guān)于艾瑞昔布及其聯(lián)合洛鉑與肺癌的研究少見，本課題對艾瑞昔布及其聯(lián)合洛鉑能否抑制肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移及作用機制進行了研究。

目前手術(shù)、放化療治療肺癌的療效仍不理想，分子靶向治療抑制肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移是肺癌治療的新途徑。肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是由多個因子、多種信號傳導(dǎo)通路共同參與的復(fù)雜過程，包括肺癌細胞從原發(fā)部位脫落、細胞外基質(zhì)降解、失巢凋亡和肺癌細胞黏附等多種生理功能的失調(diào)。PTEN和cortactin蛋白異常表達均可導(dǎo)致肺癌細胞之間黏附性降低，從而從原發(fā)灶脫落，更易發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果表明，與對照組相比，艾瑞昔布組裸鼠飲食、活動、重量無明顯變化，說明艾瑞昔布的胃腸道反應(yīng)等不良反應(yīng)較少，洛鉑組及聯(lián)合組裸鼠一般情況較差，可能與洛鉑較強的不良反應(yīng)有關(guān)。

有研究表明，在NSCLC中，PTEN與COX-表達呈負相關(guān)，PTEN蛋白低表達或不表達者更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且生存期短于高表達或陽性表達者［9-10］。Cortactin陽性表達與NSCLC分化程度呈負相關(guān)，與TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)［11］。本研究結(jié)果表明，與對照組相比，艾瑞昔布組PTEN蛋白及其mRNA表達上調(diào)同時cortactin及其mRNA表達下調(diào)(P<0.05)，艾瑞昔布組與洛鉑組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示艾瑞昔布可能促進PTEN蛋白的表達同時抑制cortactin蛋白的表達，從而抑制NSCLC侵襲和轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果同時表明，與艾瑞昔布及洛鉑單藥組相比，艾瑞昔布聯(lián)合洛鉑組PTEN蛋白及其mRNA表達明顯增加(P<0.05)，cortactin蛋白及其mRNA表達明顯減少(P<0.05)，提示艾瑞昔布可能增加洛鉑抗腫瘤療效，艾瑞昔布對洛鉑化療具有增敏作用。該結(jié)果與COX-2抑制劑塞來昔布聯(lián)合多西他賽和順鉑可增加肺癌化療的敏感性報道相一致［12］。

根據(jù)本研究推測艾瑞昔布能夠抑制NSCL侵襲和轉(zhuǎn)移的可能機制：通過抑制PTEN蛋白的失活，干擾PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，使細胞周期阻滯在G1期或促使細胞凋亡［13］；調(diào)節(jié)FAK和Shc的磷酸化，使細胞與細胞外基質(zhì)黏附性增加腫瘤細胞不易從原發(fā)灶脫離［5］；通過下調(diào)cortactin目的基因CTTN3’端的miRNA-182，同時細胞程序性死亡因子4表達增加使腫瘤細胞停留在G0/G1期，抑制細胞侵襲和轉(zhuǎn)移［14］。艾瑞昔布對洛鉑化療可能具有協(xié)同作用，其具體分子生物學(xué)機制尚不明確。艾瑞昔布能否聯(lián)合化療藥物應(yīng)用于臨床治療肺癌還需進一步研究。

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Inhibition of invasion and metastasis by imrecoxib and its mechanisms in lung adenocarcinoma A549cell xenograft in nude mice

WANG Lingchan, CUI Lijing, WANG Dongchang, ZHAO Yunxia, ZHAOZhifang,
CHEN Gang (Department of Respiratory Medicine, the Third Affiliated Hospital, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China)

CHEN Gang E-mail: chengang.8@hotmail.com

Background and purpose:Cyclooxygenase-2 (COX-2) participates in angiogenesis and lymph node metastasis of lung cancer. COX-2 inhibitors could inhibit invasion and metastasis of lung cancer. This study aimed to investigate the inhibition of invasion and metastasis by COX-2 inhibitor imrecoxib in xenograft tumor of lung adenocarcinoma A549 cell in nude mice and to explore its possible mechanisms, in addition, to observe the efficacy of imrecoxib combined with lobaplatin.Methods:Thirty male BALB/c nude mice were injected subcutaneously with A549 cells into the right axillary region to establish xenograft models. Twenty-nine successfully modeled mice were randomly divided into four groups: control group (n=7), imrecoxib group (n=8), lobaplatin group (n=7), imrecoxib combined with lobaplatin group (n=7). The control group was treated with the same amount of sterile distilled water and injected with the same amount of 0.9% sodium chloride solution via caudal vein. The treatment group was treated with imrecoxib tablets 40 mg/kg per day through gavage and injected with lobaplatin 7.5 mg/kg per week via caudal vein respectively. The diet, physical activity and other normal conditions of nude mice were observed everyday. After 6 weeks, 29 mice were sacrificed and transplanted tumor tissues were cut off. The expression of PTEN, cortactin protein and mRNA were detected by immunohistochemistry and real-time PCR. The data were analyzed with one-way anova and non-parametric test.Results:In the last week, the dietand physical activity of all nude mice were less than before, and they became thinner, which were more obvious among the mice in lobaplatin group and imrecoxib combined with lobaplatin group. Compared with the control group, the expression of PTEN protein and mRNA were significantly increased in imrecoxib group and imrecoxib combined with lobaplatin group (P<0.001, respectively). Compared with the control group, the expression of cortactin protein and mRNA were significantly decreased in imrecoxib group and imrecoxib combined with lobaplatin group (P<0.001, respectively). PTEN and cortactin protein, PTEN and cortactin mRNA had significantly negative correlation (r=-0.660, -0.983, P<0.001, respectively).Conclusion:Imrecoxib can inhibit non-small cell lung cancer invasion and metastasis which may be involved in upregulating PTEN protein and reducing cortactin protein. Imrecoxib could enhance the effect of lobaplatin chemotherapy.

Non-small cell lung cancer; Invasion and metastasis; Imrecoxib; PTEN; Cortactin

10.19401/j.cnki.1007-3639.2017.01.001

R734.2

A

1007-3639(2017)01-0001-06

2016-07-02

2016-08-20）

河北省省級重大醫(yī)學(xué)科研課題(zd2013029)。

陳 剛 E-mail:chengang.8@hotmail.com