黃燕玲 羅光偉 毛先明

(武漢市第一醫(yī)院，湖北 武漢 430022)

痰熱清對慢性阻塞性肺疾病大鼠支氣管上皮多藥耐藥相關(guān)蛋白1表達(dá)的影響

黃燕玲 羅光偉 毛先明

(武漢市第一醫(yī)院，湖北 武漢 430022)

目的 觀察痰熱清對慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠支氣管上皮多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)1 mRNA的影響。方法 雄性Wistar大鼠30只，隨機(jī)分為COPD模型組、痰熱清組和正常對照組，每組10只。除正常對照組，其余兩組采用氣管注脂多糖加熏香煙方法制備COPD模型，RT-PCR技術(shù)分析MRP1 mRNA基因表達(dá)。結(jié)果 COPD模型組和痰熱清組大鼠支氣管上皮細(xì)胞中MRP1 的表達(dá)減少(P<0.01)。與模型組比較，痰熱清組大鼠支氣管上皮細(xì)胞中MRP1 的表達(dá)增高(P<0.05)。結(jié)論 痰熱清注射液可能通過增高大鼠支氣管上皮細(xì)胞中MRP1 的表達(dá)而有效減輕COPD氣道炎癥，達(dá)到延緩COPD肺功能惡化和改善癥狀的效應(yīng)。

痰熱清；慢性阻塞性肺疾病；多藥耐藥蛋白1 mRNA

慢性阻塞性肺疾病(COPD)常伴有氣道、肺實(shí)質(zhì)與肺血管對有害顆粒和(或)氣體的炎癥反應(yīng)〔1～3〕。多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)1在肺支氣管上皮有很強(qiáng)的表達(dá)，不僅可以作用于內(nèi)源性代謝物，還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)藥物、毒物及其代謝產(chǎn)物濃度的功能，是機(jī)體自身防御解毒體系的重要組成部分〔4〕。痰熱清注射液是在“雙黃連”、“清開靈”兩種清熱解毒中成藥藥方的基礎(chǔ)上優(yōu)選而成，具有清熱解毒和化痰鎮(zhèn)驚的作用，對COPD急性加重期患者具有一定療效〔5〕，但痰熱清治療COPD的機(jī)制研究較少，本文探討痰熱清對COPD大鼠支氣管上皮細(xì)胞MRP1 mRNA基因表達(dá)的影響。

1 動(dòng)物與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 SPF級健康Wistar大鼠30只，雌雄各半，體重180～220 g，購于武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號：SCXK(鄂)2003-0004。隨機(jī)分為COPD模型組，痰熱清組和正常對照組，每組10只，雌雄各半。

1.2 COPD模型制備 COPD模型組和痰熱清組氣管內(nèi)注入脂多糖(LPS)加熏香煙方法制備COPD模型。在第1和第14天，將大鼠全麻，于氣道注入溶于生理鹽水的LPS 200 μl (1 mg/ml)，正常對照組大鼠注入生理鹽水。第2到第28天(第14天除外)將COPD模型大鼠置入自制被動(dòng)熏吸箱內(nèi)(50 cm×50 cm×50 cm)，注入香煙煙霧(牡丹牌香煙，上海卷煙廠生產(chǎn)，焦油、尼古丁和CO的含量分別為11.0 mg/支、0.9 mg/支和12 mg/支)，濃度5%，1 h/次，2次/d。正常對照組大鼠不進(jìn)行熏吸。

1.3 給藥方法 COPD模型組和正常對照組尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液，劑量2 ml/kg，痰熱清組尾靜脈注射痰熱清注射液(上海凱寶藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字：Z20030054，規(guī)格：10 ml/支，批號：20131001) 2 ml/kg，所有組別連續(xù)給藥14 d，第15天檢測大鼠呼吸功能，RT-PCR技術(shù)分析MRP1 mRNA基因表達(dá)。

1.4 大鼠呼吸功能測定 采用動(dòng)物肺功能測定系統(tǒng)檢測肺功能，即0.3 s用力呼氣容積(FEV0.3)占用力肺活量的比值(FVC)、呼氣峰流速(PEF)和肺順應(yīng)性(Cydn)。采用10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉大鼠，仰臥位固定于操作臺，測定肺功能。

1.5 肺組織標(biāo)本病理 夾閉左主支氣管，將硅膠管固定于右主支氣，檢測之前將血漿標(biāo)本用SepPack C18(美國Cayman Chemical公司)分離柱抽提，洗出液用N2吹干，置入試管內(nèi)，右肺內(nèi)注射10%甲醛至右肺膨脹邊緣變銳，結(jié)扎右主支氣管，置于10%甲醛中固定、脫水、包埋、HE染色并行病理檢查。

1.6 RT-PCR技術(shù)分析MRP1 mRNA表達(dá) 用Trizol法提取肺組織中總RNA。MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶和Oligo(dT)37℃下逆轉(zhuǎn)錄5 min，42℃ 1 h逆轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA。PRC擴(kuò)增：采用Taq DNA多聚酶和正反引物存在下進(jìn)行PCR，用β-actin和Marker D512為參照物，按以下步驟行PCR擴(kuò)增：94℃變性，30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)周期。目標(biāo)基因檢測：采用瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并進(jìn)行拍照。采用Quantityone 4.6.2.版分析結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組治療前后的體重比較 實(shí)驗(yàn)期間，COPD模型組和痰熱清組精神反應(yīng)、活動(dòng)和毛發(fā)與正常對照組比較，并觀察有無大鼠死亡。所有組別入組前的體重?zé)o顯著差異，制備COPD模型并給予治療后，COPD模型組和痰熱清組體重增重緩慢，較正常對照組明顯降低(P<0.05)，與COPD模型組比，痰熱清組較重(t=2.3,P<0.05)，見表1。

2.2 各組治療后肺功能比較 COPD模型組和痰熱清組肺功能均有不同程度降低(P<0.05)，與COPD模型組比，痰熱清組PEF明顯改善(P<0.05)，F(xiàn)EV0.3/FVC和Cydn也有改善，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表2。

2.3 各組大鼠組織形態(tài)學(xué)病理的變化 正常對照組大鼠支氣管黏膜纖毛柱狀上皮排列整齊，黏膜與固有層細(xì)胞數(shù)較少，伴少量杯狀細(xì)胞，各級細(xì)支氣管壁的黏膜上皮完整，未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡正常；COPD模型組大鼠氣管與支氣管黏膜大量上皮纖毛有不同程度脫落和倒伏，杯狀細(xì)胞明顯增多，各級細(xì)支氣管管壁周圍存在大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡壁明顯變薄和斷裂，肺泡腔明顯擴(kuò)大。與COPD模型組比較，痰熱清組氣道上皮細(xì)胞脫落和倒伏、炎癥細(xì)胞浸潤與杯狀細(xì)胞增多等現(xiàn)象均有不同程度的緩和，見圖1。

表1 各組治療前后體重比較

與正常對照組比較：1)P<0.05；與COPD模型組比較：2)P<0.05，下表同

表2 各組治療后肺功能比較

圖1 肺支氣管病理學(xué)變化(HE,×400)

2.4 各組大鼠肺組織中MRP1 mRNA表達(dá) 見圖2。與正常對照組比較(3.875±0.658)，COPD模型組的光密度比值較低(1.790±0.410，P<0.05)，與COPD模型組比較，痰熱清組的光密度比值較高(2.879±0.236，P<0.05)，RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳也可看見COPD模型組的MRP1 mRNA表達(dá)較弱，與COPD模型組比較，痰熱清組的MRP1 mRNA表達(dá)較強(qiáng)。

1～3：正常對照組、COPD模型組、痰熱清組圖2 MRP1 mRNA RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

3 討 論

COPD以氣道、肺實(shí)質(zhì)與肺血管發(fā)生慢性炎癥為主要特征，發(fā)生發(fā)展與炎癥和氧化應(yīng)激密切相關(guān)〔6〕。氣道炎癥反復(fù)可造成患者氣道重構(gòu)和進(jìn)行性氣道阻塞。肺支氣管細(xì)胞可表達(dá)ABC(ATP-binding Cassete)類轉(zhuǎn)運(yùn)體，ABC類轉(zhuǎn)運(yùn)體可吸入體外的化學(xué)異物或有毒物質(zhì)，通過外排功能達(dá)到肺減毒的效應(yīng)，作為肺的天然屏障，其家族中的重要一員MRP1在健康人肺支氣管上皮有較強(qiáng)的表達(dá)。因?yàn)镸RP1具有較廣泛的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能和較多的結(jié)合底物，使得MRP1通過作用于內(nèi)源性代謝物，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)藥物、毒物和藥物代謝產(chǎn)物水平達(dá)到調(diào)節(jié)肺組織氧化應(yīng)激，減少毒物或異物對人體的損害，是機(jī)體天然的防御解毒的重要組成部分。MRP1 對LTC4具有較高的親和力，LTC4與MRP1結(jié)合并與MRP1一起排出到細(xì)胞外，因此COPD患者支氣管上皮細(xì)胞的MRP1表達(dá)降低少，重度COPD較中等COPD的支氣管上皮細(xì)胞的MRP1表達(dá)更少，隨著病程的加重，MRPI表達(dá)隨之降低。本課題結(jié)果顯示，與正常對照組比，COPD大鼠支氣管上皮細(xì)胞中MRP1 的表達(dá)降低，可見MRP1是COPD的發(fā)生發(fā)展過程起保護(hù)作用〔7～10〕。

COPD 屬于中醫(yī)學(xué)的“肺脹”“喘病”和“咳嗽”等以肺臟病變?yōu)橹鞯姆蜗导膊》懂?。在《皇帝?nèi)經(jīng)》中就有相關(guān)的記錄“皮毛者，肺之合也，皮毛先受邪氣，邪氣以從其合也。其寒飲食入胃，從肺脈上至于肺，則肺寒，肺寒則外內(nèi)合邪，因而客之，則為肺咳……肺咳之狀，咳而喘息有音，甚則唾血(《素問·咳論》”)或“諸氣郁，皆屬于肺(《素問·至真要大論》)”。本病病機(jī)在于本虛標(biāo)實(shí)，急性期以標(biāo)實(shí)為急，多見痰、瘀和熱，急性加重期則因感受風(fēng)熱或痰郁化熱表現(xiàn)為痰熱癥，穩(wěn)定期時(shí)以本虛為主，在于肺脾腎虛損，外感是本病的主要誘因，痰濁可導(dǎo)致“肺脹”。

痰熱清注射液是由黃芩、山羊角、熊膽粉、連翹和金銀花等中藥材組成，基于中醫(yī)常用藥“雙黃連”和“清開靈”兩種清熱解毒的藥方改進(jìn)而成〔11,12〕。痰熱清注射液中黃芩為君藥，味苦性寒，歸肺、胃和大腸經(jīng)，具有清熱燥濕、宣肺化痰和瀉火解毒之功；熊膽粉與山羊角同為臣藥，山羊角作為羚羊角的代用品，味咸、性寒，如肝和心經(jīng)，具有平肝熄風(fēng)、清熱鎮(zhèn)驚和解毒明目之功，熊膽粉，味苦、性寒，入心、肺和大腸經(jīng)，可清熱解毒，解驚化痰，熊膽粉與山羊角可加強(qiáng)全方的化痰解痙功效；連翹與金銀花合并為佐藥，連翹味苦微寒，與金銀花合并可助全方的清熱解毒和化痰宣肺功效，連翹建有佐藥功能，引諸藥入肺經(jīng)。全方具有清熱解毒和化痰鎮(zhèn)靜的作用〔13,14〕。

本課題結(jié)果顯示痰熱清注射液可明顯緩解COPD大鼠的臨床癥狀，改善COPD大鼠增重緩慢過程，改善COPD大鼠的肺功能，明顯逆轉(zhuǎn)COPD狀態(tài)下MRP1 mRNA表達(dá)的降低，從而達(dá)到有效減輕COPD大鼠的氣道炎癥，也應(yīng)證了痰熱清注射液在呼吸系統(tǒng)疾病的防治上的臨床療效，尤其在COPD急性發(fā)作的治療上更具優(yōu)勢，有效緩解咳嗽咯痰喘息等癥狀，提高患者生活質(zhì)量〔15〕。

痰熱清注射液加強(qiáng)MRP1 mRNA表達(dá)，緩解COPD臨床癥狀與痰熱清的物質(zhì)基礎(chǔ)有關(guān)。注射液中君藥黃芩含有黃芩苷和黃芩素等黃酮類化合物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示黃芩苷可顯著抑制細(xì)胞內(nèi)LTC4的生物合成〔16,17〕，而MRP1是LTC4的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，黃芩苷阻止Ca2+通道達(dá)到緩解支氣管痙攣?zhàn)饔茫S芩素通過抗過敏降低支氣管腺體分泌及干擾LT代謝改善COPD癥狀，黃芩本身具有抗菌、抗病毒、抗氧化及抗炎等多種藥理作用可緩解COPD臨床癥狀〔18〕，黃芩還對免疫和心腦血管等系統(tǒng)有保護(hù)作用，尤其適用于對于老年COPD伴心腦并發(fā)癥患者〔19〕。熊膽含有熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸，這兩種去氧膽酸均具有鎮(zhèn)驚、抑菌、鎮(zhèn)咳和平喘等功能。

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〔2015-09-17修回〕

(編輯 曹夢園)

毛先明(1974-)，男，住院醫(yī)師，主要從事中醫(yī)內(nèi)科學(xué)研究。

黃燕玲(1972-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事中醫(yī)內(nèi)科學(xué)研究。

R360.101

A

1005-9202(2017)02-0318-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.025