劉景華 周 凡 劉 洋 張曉琳 李敏燕 劉彥琴 王吉剛 白 穎

(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院，遼寧 沈陽 110016)

原發(fā)性血小板增多癥患者治療中出現(xiàn)慢性粒細胞白血病1例

劉景華 周 凡 劉 洋 張曉琳 李敏燕 劉彥琴 王吉剛 白 穎

(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院，遼寧 沈陽 110016)

目的 認識Ph1陰性原發(fā)性血小板增多癥在病程中向BCR-ABL1陽性慢性粒細胞白血病的轉變。方法 密切監(jiān)測患者骨髓巨核細胞的形態(tài)、BCR/ABL P210融合基因轉錄水平、FISH法Ph1染色體、JAK2基因V617F突變。結果 初診時患者骨髓巨核細胞胞體大、多分葉核，BCR/ABL P210融合基因陰性，Ph1染色體陰性，JAK2基因為野生型；33個月后患者骨髓巨核細胞形態(tài)轉為單圓核小巨核細胞，BCR/ ABL P210融合基因轉為陽性，Ph1染色體轉為陽性，JAK2基因仍為野生型。結論 該患者由Ph1陰性原發(fā)性血小板增多癥在治療過程中轉為BCR-ABL1陽性慢性粒細胞白血病。

原發(fā)性血小板增多癥；慢性粒細胞白血病

骨髓增殖性腫瘤(MPN)是克隆性造血干細胞疾病，分為BCR-ABL陽性慢性髓細胞白血病(CML)和BCR-ABL陰性MPN，后者包括原發(fā)性血小板增多癥(ET)，真性紅細胞增多癥(PV)和原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)。雖然CML和ET在初期的臨床表現(xiàn)和臨床過程上是明顯不同的，但一些CML和ET病例有重疊的臨床特點，可能會出現(xiàn)ET和CML的共存〔1〕，也可能會出現(xiàn)ET和CML的交替〔2〕?，F(xiàn)將1例ET轉化為CML的病例報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 患者，女，72歲，因反復心前區(qū)疼痛于2011年1月4日首次就診我科，于2010年10月末情緒激動后出現(xiàn)心前區(qū)陣發(fā)性疼痛，持續(xù)2～3 s，服用速效救心丸后，癥狀瞬間緩解。于11月25日精神受打擊后突發(fā)耳鳴，聽力下降，同時伴有咽痛，就診于某醫(yī)院耳鼻喉科，行血液分析檢查白細胞13.8×109/L，血紅蛋白131 g/L，血小板541×109/L，肺炎支原體抗體：1∶640，給予左氧氟沙星，長春西汀等對癥治療，聽力逐漸恢復。此期間多次復查血液分析白細胞及血小板均高，白細胞最高達25×109/L，最低降至13.8×109/L。11月29日心前區(qū)疼痛加重，再次就診某醫(yī)院干診科，24 h動態(tài)心電圖提示：房性期前收縮、短陣房速；心臟彩超提示：左室舒張功能減低。給予擴冠、抗炎等治療后癥狀緩解。既往高血壓、腔隙性腦梗死病史。查體：胸骨無叩痛，肝脾肋下未觸及。入院后多次檢查白細胞18×109/L～25×109/L，血紅蛋白130～138 g/L，血小板620×109/L～900×109/L。結合骨髓穿刺、活檢、白細胞堿性磷酸酶、BCR/ABL融合基因、JAK2基因V617F突變及Ph1染色體等檢查，診斷：ET。之后口服羥基脲聯(lián)合肌肉注射干擾素α治療，白細胞5×109/L～10×109/L，血紅蛋白110～120 g/L，血小板360×109/L～540×109/L。期間于2012年6月出現(xiàn)全身多關節(jié)疼痛，化驗檢查類風濕因子水平增高。于2012年9月行右側人工膝關節(jié)表面置換術，2013年10月因全身多關節(jié)腫痛伴活動受限，診斷為“類風濕關節(jié)炎”，當時化驗檢查白細胞11.1×109/L 血紅蛋白108 g/L，血小板725×109/L，中幼粒細胞1%，晚幼粒細胞2%，嗜酸細胞2%，嗜堿細胞9%。再次就診我院，經(jīng)復查骨髓穿刺、BCR/ABL融合基因、JAK2基因V617F突變及Ph1染色體等檢查，調整診斷：慢性粒細胞白血病(慢性期)。自2013年10月30日開始口服伊馬替尼400 mg/d，半個月后血小板降至275×109/L，白細胞6.3×109/L。但因關節(jié)腫痛加重，患者知情同意下?lián)Q用尼洛替尼800 mg/d，現(xiàn)服藥4個月，無明顯不適癥狀，血象控制較好。

1.2 骨髓BCR/ABL P210融合基因轉錄水平檢測 留取3～5 ml EDTA抗凝骨髓進行骨髓單個核細胞分離和RNA提取，之后進行逆轉錄合成cDNA及RQ-PCR：在15 μl PCR反應模板中加入含有逆轉錄酶的10 μl PCR反應液，42℃ 37 min，94℃ 5 min；94℃ 15 s，60℃ 60 s，40次循環(huán)；37℃ 1 min。ABL基因作為內(nèi)參照基因。目的基因BCR-ABL(P210)引物及探針序列：上游引物b2：5′-CCGC TGACCATCAATAAGGAA-3′，下游引物a2：5′-CTCAGACCCTGAGGCTCAAA GT-3′；探針BCR-ABL：5′-FAM-AGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-TAMRA-3′。內(nèi)參基因ABL引物及探針序列：上游引物ENF1003：5′-TGGAGA TAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3′，下游引物ENR1063：5′-TGGAGATA ACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3′；探針ENPr1043：5′-FAM-CCATTTTTG GTTTGGGCTTCACACCATT-TAMRA-3′。

1.3 JAK2基因V617F突變的檢測 留取3～5 ml EDTA抗凝骨髓液，提取DNA。采用AS-PCR方法。PCR反應體系為：10×PCR緩沖液2.5 μl，10 μmol/L的F1引物1.2 μl(正義引物：5′-GT-GAATAGTCCTAGTGTTTTCAGTTTCA-3′)、F2引物1.3 μl(正義引物：5′-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3′)、R引物2.5 μl(反義引物：5′-ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAAG-3′)，50 ng/μl模板DNA 2 μl，2 μl的25 mmol/L MgCl2，2 μl的各種dNTP和2 μl Taq DNA聚合酶，加雙蒸水至12.5 μl。之后進行瓊脂糖凝膠電泳及測序。

1.4 Ph1染色體FISH的檢測 留取3～5 ml肝素抗凝骨髓液。采用Spectrum Orange標記的序列特異性DNA探針ABL及Spectrum Green標記的序列特異性DNA探針BCR。探針處理：每份標本探針1 μl，加雜交稀釋液4 μl混勻，將探針混合液5 μl加于玻片的待雜交區(qū)，蓋上玻片。用橡膠膠水封片后，放于自動原位雜交儀中，程序設定78℃ 變性5 min，42℃雜交20 h。雜交結束后，洗片，去除蓋玻片，將玻片置于46℃的0.3% NP-40/0.4×SSC中洗滌2 min，再置于2×SSC/0.1NP-40中洗滌45 s，置于2×SSC中脫水4 min，再置于70%的酒精中脫水4 min，取出玻片，晾干，復染，吸取10 μl的DAPI于雜交區(qū)，置于4℃冰箱，待30 min后觀察結果。

2 結 果

2.1 初診骨髓涂片及活檢 骨髓涂片：骨髓增生明顯活躍，粒系細胞比例明顯增高，早幼粒細胞1%，中幼粒細胞15%，晚幼粒細胞17.5%，嗜酸粒細胞4.5%，嗜堿粒細胞3%，紅系細胞比例減低，全片共見巨核細胞230只，為胞體大、多分葉核巨核細胞(見圖1)；外周血涂片：未見早、中、晚幼粒細胞，嗜堿粒細胞12%；骨髓活檢：骨髓增生活躍，粒系細胞比例增高，可見各階段細胞散在分布，紅系細胞比例減低，巨核細胞6只，少量纖維細胞增生。

2.2 調整診斷時骨髓涂片 骨髓增生明顯活躍，粒細胞增生明顯活躍，中、晚幼粒細胞比值增高，原始粒細胞0.8%，早幼粒細胞2.4%，中幼粒細胞23.2%，晚幼粒細胞24%，紅細胞增生減低，全片見巨核細胞220只，為單圓核小巨核細胞(見圖1)。

圖1 初診及調整診斷時骨髓巨核細胞形態(tài)(×100)

2.3 初診基因及染色體等相關檢查 骨髓細胞BCR/ABL P210融合基因定量檢測：陰性；外周血細胞BCR/ABL熒光原位雜交FISH檢測：陰性(見圖2)；骨髓細胞JAK2基因為野生型；骨髓白細胞堿性磷酸酶陽性率14% 積分14分。

2.4 調整診斷時基因及染色體等相關檢查 骨髓細胞BCR/ABL P210融合基因定量檢測：陽性；外周血細胞BCR/ABL熒光原位雜交FISH檢測(見圖2)：陽性；骨髓細胞JAK2基因為野生型。

圖2 初診及調整診斷時外周血細胞BCR/ABL熒光原位雜交FISH檢測(×100)

3 討 論

MPN傳統(tǒng)上分為BCR-ABL陽性的CML和BCR-ABL陰性的MPN，后者包括原發(fā)性PMF、PV和ET。雖然在2005年前pubmed上曾報道數(shù)篇的Ph陽性ET〔3,4〕，但此后隨著對疾病性質的進一步認識及疾病定義的進一步限定，目前對于PMF和ET的診斷要求是沒有Ph染色體，而Ph染色體的存在是診斷CML的必備條件。然而，當Ph染色體陽性MPN缺乏CML的典型特征〔5〕(白細胞增高并核左移、脾臟腫大、嗜堿性粒細胞增多、小單圓核巨核細胞)時，會給臨床醫(yī)生在疾病的診斷過程中帶來不少困惑。

我們的病例在初始診斷時符合WHO對于ET的診斷標準〔6〕：①血小板>450×109/L；②巨核細胞增殖，體積大，形態(tài)成熟，無粒系或紅系增殖；③除外CML、PV、PMF、骨髓增生異常綜合征(MDS)或其他髓系腫瘤；④證實存在JAK2V617F或其他克隆標記；或沒有反應性血小板增多的證據(jù)。自診斷以來給予羥基脲聯(lián)合干擾素α治療，起初血小板控制較好，但在2年后血小板控制不佳，此時白細胞數(shù)值與初診時相當，但骨髓巨核細胞由初診時的胞體大、多分葉核巨核細胞轉為單圓核小巨核細胞，同時骨髓細胞BCR/ABL P210融合基因定量檢測陽性，外周血細胞BCR/ABL熒光原位雜交FISH檢測陽性，此時患者不再符合ET，而轉化為CML。

CML和ET均是克隆性造血干細胞疾病，雖然通常在初期的臨床表現(xiàn)和臨床過程上是明顯不同的，但一些CML和ET病例有重疊的臨床特點，可能會出現(xiàn)ET和CML的共存〔1〕，也可能會出現(xiàn)ET和CML的交替〔2〕。Wahlin等〔2〕首次報道1例58歲的男性ET患者在羥基脲治療18年后轉化為CML，之后該患者進行了異基因造血干細胞移植。隨后Curtin等〔7〕報道1例患者在診斷Ph陰性ET前存在長時間的孤立血小板增高的病史，在ET診斷后4個月檢測到Ph染色體。Cesar等〔8〕報道1例65歲的女性ET患者，在羥基脲治療6年后，血小板數(shù)量不能控制，此時檢測到Ph染色體，之后應用伊馬替尼治療，血小板數(shù)量得到控制。此后Mizutani等〔9〕報道1例72歲的男性ET患者在羥基脲治療9年后血小板逐漸降低，白細胞上升，此時通過染色體及基因學的檢查，證實交替為CML，之后改為伊馬替尼治療，4個月后因出現(xiàn)胸腔積液而調整為尼洛替尼治療，在治療5個月后CCyR，但此時血小板再次上升，之后需尼洛替尼和羥基脲共同應用控制病情。Santos等〔10〕報道1例41歲男性ET患者2年后轉化為CML，在伊馬替尼治療后BCR-ABL1水平下降的同時血小板再次上升，之后需伊馬替尼和羥基脲共同應用控制血小板數(shù)量。

Mizutani等〔9〕和Santos等〔10〕所報道的病例均出現(xiàn)一致的現(xiàn)象：起初臨床表現(xiàn)為Ph-ET，隨后交替為Ph+CML，在應用對BCR-ABL靶向治療的酪氨酸激酶抑制劑后，在BCR-ABL1水平下降的同時血小板再次上升。上述現(xiàn)象我們推測可能有如下機制：Ph-和Ph+克隆可能在發(fā)病時即共同存在于患者體內(nèi)，只是在不同的時期不同的克隆占優(yōu)勢而導致臨床表現(xiàn)及檢測結果的不同，及應用目前檢測手段表現(xiàn)為Ph-ET和Ph+CML的交替。Ph-和Ph+克隆間相互抑制，ET交替為CML患者，在發(fā)病時Ph-克隆占優(yōu)勢，表現(xiàn)為ET，隨著長時間的治療，其被抑制，之后表現(xiàn)為Ph+克隆占優(yōu)勢，而表現(xiàn)為CML，隨著酪氨酸激酶抑制劑的應用抑制了Ph+克隆的增殖，從而為Ph-克隆的增殖提供了空間，使得再次表現(xiàn)為ET。另外伊馬替尼對于c-kit的抑制作用強于尼洛替尼，導致尼洛替尼組Ph-克隆的相對弱抑制，推測可能應用尼洛替尼發(fā)生ET復發(fā)的概率更大。

盡管Ph-MPN在治療過程中出現(xiàn)Ph+CML是非常少見的，兩者的臨床表現(xiàn)有時又相似，但它們需要不同的靶向治療，因此臨床醫(yī)生需要細致地將兩者進行鑒別診斷，以便更好地治療。

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3 Michiels JJ，Berneman Z，Schroyens W，etal.Philadelphia(Ph)chromosome-positive thrombocythemia without features of chronic myeloid leukemia in peripheral blood：natural history and diagnostic differentiation from Ph-negative essential thrombocythemia〔J〕.Ann Hematol，2004；83(8)：504-12.

4 Daly K，Nandula SV，Murty VV，etal.Variant translocation with a deletion of derivative(9q)in a case of Philadelphia chromosome positive(Ph+)essential thrombocythemia(ET)，a variant of Chronic Myelogenous Leukemia(CML)with a poor prognosis〔J〕.Leukemia Lymphoma,2005;46(12)：1801-6.

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6 Vardiman JW，Thiele J，Arber DA，etal.The 2008 revision of the world health organization(WHO)classification of myeloid neoplasms and acute leukemia：rationale and important changes〔J〕.Blood,2009;114(5)：937-51.

7 Curtin NJ，Campbell PJ，Green AR，etal.The Philadelphia translocation and pre-existing myeloproliferative disorders〔J〕.Br J Haematol,2005;128(5)：734-6.

8 Cesar JM，Cabello P，F(xiàn)erro T，etal.Emergence of chronic myelogenous leukemia in a patient with primary thrombocythemia and absence of BCR/ABL rearrangement〔J〕.Cancer Genet Cytogenet,2006;167(1)：74-7.

9 Mizutani S，Kuroda J，Shimizu D，etal.Emergence of chronic myelogenous leukemia during treatment for essential thrombocythemia〔J〕.Int J Hematol,2010;91(3)：516-21.

10 Santos FP，Verstovsek S.JAK2 inhibitors：what′s the true therapeutic potential〔J〕? Blood Rev,2011;25(2)：53-63.

〔2015-06-01修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

遼寧省科技計劃課題(No.2011225021;2013225089)

周 凡(1961-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事骨髓增殖性腫瘤的診治研究。

劉景華(1976-)，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事復發(fā)難治性多發(fā)性骨髓瘤機制研究。

R733

A

1005-9202(2017)02-0387-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.058