趙素晨 吳慶文 程月發(fā) 賈玉鳳 陳 娟 閆春林

(華北理工大學(xué)護(hù)理與康復(fù)學(xué)院，河北 唐山 063000)

丁苯酞對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制

趙素晨1吳慶文 程月發(fā)2賈玉鳳 陳 娟 閆春林

(華北理工大學(xué)護(hù)理與康復(fù)學(xué)院，河北 唐山 063000)

目的 探討丁苯酞對(duì)1-甲基-4-苯基-吡啶離子(MPP+)誘導(dǎo)的人體神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞凋亡途徑的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，建立MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡模型。應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)不同劑量丁苯酞對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響；篩選出丁苯酞的最佳作用濃度；Annexin-V/PI流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化；Western印跡法檢測(cè)線粒體相關(guān)凋亡蛋白P53、Bcl-2、Bax的表達(dá)。結(jié)果 丁苯酞預(yù)處理的細(xì)胞比單純MPP+處理的細(xì)胞存活率增加(P<0.05)，且呈一定的劑量依賴性；丁苯酞可以降低MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡率(P<0.05)。丁苯酞下調(diào)P53、Bax蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論 丁苯酞對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是調(diào)節(jié)P53、Bcl-2、Bax的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

丁苯酞；帕金森病；SH-SY5Y細(xì)胞；凋亡

帕金森病(PD)主要病理改變是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性缺失和紋狀體多巴胺含量顯著減少，而多巴胺神經(jīng)元廣泛的缺失是形成障礙的最重要原因〔1〕?，F(xiàn)行藥物只能緩解疾病癥狀并不能徹底阻止疾病發(fā)展〔2〕。中藥在治療PD病方面具有臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)豐富、作用途經(jīng)靶點(diǎn)多、副作用小等潛在優(yōu)點(diǎn)，在臨床上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，從中藥中獲取活性成分成為尋求預(yù)防和治療PD的重要途徑〔3〕。丁苯酞為脂溶性的藥物，可以直接通過(guò)血腦屏障發(fā)揮作用，重構(gòu)缺血區(qū)微循環(huán)，保護(hù)線粒體免受損傷，改善能量代謝〔4～7〕。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用丁苯酞對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，觀察對(duì)線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白P53、Bcl-2、Bax表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、藥物、試劑及儀器 SH-SY5Y細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)。丁苯酞購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。MPP+、MTT、Annexin-V/PI試劑盒均購(gòu)于Sigma公司；DMEM/F12=1∶1培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清(FBS)購(gòu)于Gibco公司；GAPDH抗體(華安生物技術(shù)有限公司)，P53、Bcl-2、Bax抗體(巴傲得生物科技有限公司)。CO2培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀(意大利Bio-Rad公司)，倒置相差顯微鏡(Olympus公司)，流式細(xì)胞儀(FACS Calibuar，BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 SH-SY5Y細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，DMEM/F12培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清，青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組，模型組，丁苯酞組。

1.2.2 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率 以每孔(1～5)×104個(gè)/ ml的活細(xì)胞懸液100 μl接種于96孔板中，不同劑量(1、10、20、100 μmol/L)丁苯酞預(yù)先處理2 h后加入1 mmol/L MPP+繼續(xù)培養(yǎng)24 h后各組分別加入50 mg/ml的MTT 15 μl繼續(xù)孵育3 h，吸去培養(yǎng)基，加入150 μl的DMSO，搖床10 min，酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度值(OD值)，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Annexin-V/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 以每孔(2～5)×105個(gè)/ml的密度接種于6孔板中，用最佳濃度丁苯酞預(yù)先作用2 h后加入1 mmol/L的MPP+繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，胰酶消化，收集細(xì)胞，PBS清洗，加入400 μl Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞后，加入5 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育15 min，加10 μl的PI染色液混勻，室溫避光孵育5 min，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Western印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況 細(xì)胞干預(yù)情況同上，每孔加入60 μl裂解液，用細(xì)胞刮刮掉細(xì)胞，放入EP管中，超聲打碎，離心，取上清。用BCA試劑盒檢測(cè)樣品濃度進(jìn)行蛋白定量。蛋白變性，SDS-PAGE電泳，采用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜，5%牛奶封閉1 h，一抗4℃搖床過(guò)夜，TBST洗3次，每次5 min，二抗37℃孵育1 h，TBST洗3次，ECL顯色，用ImageJ軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 丁苯酞對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響 模型組〔(39.50±4.05)%〕與對(duì)照組〔(100.08±0.00)%〕比較，細(xì)胞相對(duì)存活率明顯降低(P<0.05)，而給予1、10、20、100 μmol/L丁苯酞預(yù)處理后的細(xì)胞存活率高于模型組，相對(duì)存活率分別為(56.76±3.70)%、(74.00±6.24)%、(81.47±7.45)%、(78.93±1.21)%(P<0.05)，丁苯酞濃度為20 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率最高，為最佳濃度。后續(xù)研究選擇20 μmol/L丁苯酞作為治療劑量。

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變 模型組細(xì)胞大部分變圓，突起結(jié)構(gòu)減少，貼壁細(xì)胞數(shù)目減少，丁苯酞預(yù)處理組，亦有變圓的現(xiàn)象，但比模型組貼壁細(xì)胞增多，細(xì)胞間的突起聯(lián)系增多且細(xì)胞形態(tài)逐漸接近對(duì)照組，見(jiàn)圖1。

2.3 細(xì)胞凋亡率的變化 模型組與對(duì)照組相比凋亡率明顯升高〔(30.04±2.14)% vs (8.72±0.99)%，P<0.05〕，丁苯酞組與模型組相比，凋亡率明顯下降〔(16.84±0.54)%，P<0.05〕。

2.4 Western印跡法檢測(cè)P53、Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá) 模型組P53、Bax蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，丁苯酞組P53、Bax蛋白的表達(dá)量較模型組明顯降低(P<0.05)；模型組Bcl-2蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，丁苯酞組Bcl-2蛋白表達(dá)較模型組明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2，表1。

圖1 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化(HE，×400)

圖2 Western印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的變化

組別P53Bcl?2Bax對(duì)照組050±0041)084±0001)055±0011)模型組082±001045±000089±003丁苯酞組060±0031)075±0021)067±0021)

與模型組比較：1)P<0.05

3 討 論

PD主要病理變化為中腦黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元的大量缺失，從而導(dǎo)致基底節(jié)功能性減退〔8，9〕。在PD的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，細(xì)胞凋亡是重要的病理性過(guò)程，與其相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子包括死亡受體、Bcl-2家族、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶、鈣激活酶、周期素依賴性激酶5、p53、聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶-1等〔10～12〕。目前認(rèn)為關(guān)于細(xì)胞凋亡過(guò)程中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)主要通路有兩條：膜受體通路和線粒體通路。線粒體途徑在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，丁苯酞可有效提高線粒體膜流動(dòng)性，增加神經(jīng)細(xì)胞線粒體ATP酶活性，穩(wěn)定線粒體膜及增加線粒體ComplexⅣ的活性〔13〕。丁苯酞治療PD的臨床實(shí)踐已有相關(guān)報(bào)道，張霞萍等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，丁苯酞對(duì)中晚期PD患者治療中出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)波動(dòng)等并發(fā)癥及非運(yùn)動(dòng)癥狀有一定療效。劉建國(guó)等〔15〕通過(guò)對(duì)4例臨床病例的觀察發(fā)現(xiàn)，丁苯酞對(duì)神經(jīng)變性疾病及神經(jīng)遺傳疾病有治療作用，可能是通過(guò)改善線粒體功能而發(fā)揮作用。賈敏等〔16〕通過(guò)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞，用丁苯酞預(yù)處理過(guò)的SH-SY5Y細(xì)胞，其細(xì)胞形態(tài)的變化小，活性下降程度輕，線粒體膜電位降低幅度小，表明丁苯酞可能有抑制細(xì)胞凋亡效應(yīng)，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究顯示，丁苯酞預(yù)處理的細(xì)胞存活率明顯高于單獨(dú)MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞，在一定范圍內(nèi)，隨丁苯酞濃度的升高，細(xì)胞存活率逐漸升高，當(dāng)濃度達(dá)到一定值時(shí)，細(xì)胞存活率反而有所下降，可能是由于藥物濃度過(guò)大，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了毒性作用。丁苯酞預(yù)處理可以抑制MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞凋亡率，對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用，這與賈敏等〔16〕的研究結(jié)果相一致。

細(xì)胞凋亡機(jī)制中，P53基因是一種重要的促凋亡基因，由P53介導(dǎo)的凋亡途徑主要包括兩條〔17〕：一條是P53對(duì)外源性凋亡途徑的調(diào)節(jié)，主要通過(guò)激活位于血漿膜的死亡受體如Fas、DR4、DR5等促進(jìn)細(xì)胞凋亡。另一條是P53對(duì)內(nèi)源性凋亡途徑的調(diào)節(jié)，主要通過(guò)線粒體調(diào)控，由于此凋亡途徑中Bcl-2蛋白和線粒體腺苷酸三磷酸酶蛋白的變化依賴P53的調(diào)控，因此又稱為P53介導(dǎo)的線粒體依賴凋亡途徑。其中在P53調(diào)控凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄中，Bcl-2蛋白家族成員中Bax是P53調(diào)控的重要靶基因之一。Bax作為P53的下游調(diào)控基因，被P53蛋白激活轉(zhuǎn)錄，從而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)比例上調(diào)而B(niǎo)cl-2蛋白的比例下調(diào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔18〕。

本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明MPP+作用SH-SY5Y細(xì)胞后引起了細(xì)胞凋亡。丁苯酞通過(guò)降低促凋亡蛋白的表達(dá)，提高抗凋亡蛋白的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。因此，推測(cè)丁苯酞對(duì)MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用，且這種保護(hù)作用的機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)P53、Bax的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

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〔2015-08-04修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

吳慶文(1966-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事康復(fù)醫(yī)學(xué)、神經(jīng)康復(fù)研究。

趙素晨(1988-),女，碩士，住院醫(yī)師，主要從事神經(jīng)康復(fù)研究。

R742.5

A

1005-9202(2017)02-0316-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.024

1 襄陽(yáng)市中心醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科 2 華北理工大學(xué)冀唐學(xué)院