孟 亮 余小祥 樊 文 涂 勤 王躍飛 陶 亮

(武漢市第三醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北 武漢 430000)

組蛋白去乙?；敢种苿δX膠質(zhì)瘤細胞增殖和遷移的影響

孟 亮 余小祥 樊 文 涂 勤 王躍飛 陶 亮

(武漢市第三醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北 武漢 430000)

目的 探討組蛋白去乙?；敢种苿?HDACsi)對腦膠質(zhì)瘤細胞增殖和遷移的影響。方法 2.0、5.0、10.0、20.0和40.0 nmol/L HDACsi MS-275與U251人膠質(zhì)瘤細胞共同孵育48 h后，通過CCK-8法檢測U251細胞增殖能力的變化、Tranwell小室檢測MS-275對U251細胞遷移能力的影響、Annexin V-PI雙染色法檢測U251細胞凋亡程度。結(jié)果 MS-275處理48 h后，與空白組相比，各濃度組U251人膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力明顯受到抑制，細胞的遷移能力顯著降低，細胞凋亡率明顯升高；隨著MS-275濃度的增加，其抑制U251細胞增殖和遷移的能力、誘導U251細胞凋亡的能力逐漸增強。結(jié)論 HDACsi MS-275能抑制U251人膠質(zhì)瘤細胞增殖和遷移，誘導細胞凋亡，MS-275有望成為膠質(zhì)瘤的新手段。

組蛋白去乙?；敢种苿?；人膠質(zhì)瘤細胞；增殖；遷移

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的30%和全部惡性顱內(nèi)腫瘤的80%〔1〕，術(shù)后復發(fā)率高〔2〕，并具有局部侵襲性生長、進展迅速、病死率高等特點〔3〕。治療手段主要集中于手術(shù)、化療、放療、γ刀、χ刀等，但其術(shù)后和放療后的復發(fā)率高、生存期短、5年生存率低等導致其治療仍然是臨床上難破的關(guān)〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)，在癌癥中，組蛋白去乙?；?HDACs)表達過量〔5〕，于是便成為目前研究治療腫瘤新的可靠靶點之一，人們發(fā)現(xiàn)其抑制劑(HDACsi)可以通過控制細胞增殖和抗凋亡從而達到治療癌癥的目的〔6〕。本研究旨在探HDACsi恩替司他(Entinostat，MS-275)對U251人膠質(zhì)瘤細胞的效果。

1 材料與方法

1.1 材料 HDACsi MS-275(ALEXIS公司)，人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細胞(上海中喬新舟生物科技有限公司)，細胞計數(shù)試劑盒8試劑盒(CCK-8，Dojindo)，DMEM高糖培養(yǎng)基、小牛血清(FBS)、二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)，細胞凋亡試劑盒、丙戊酸鈉注射液(VPA)均購自武漢博士德生物工程有限公司。流式細胞儀(Beckman FC500)，高速離心機(3300，日本Kubota)，紫外光、可見光分光光度計(Beckman)，細胞培養(yǎng)箱(Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 U251細胞培養(yǎng)及分組 細胞置于含10%FBS(V/V)和100 U/ml青霉素-100 mg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱環(huán)境37℃、5%CO2、濕度95%，24 h更換培養(yǎng)液，待細胞覆蓋瓶底95%以上則用0.25%胰蛋白酶消化并傳代。取對數(shù)生長期的U251細胞懸浮于含有二甲基亞砜(10%V/V)、FBS(30%V/V)和DMEM/F12(60%V/V)的培養(yǎng)基中，保存在液態(tài)氮中備用。實驗時將細胞分為空白組(不予任何藥物)、VPA組(VPA 1.0 mmol/L)、MS-275組(2.0、5.0、10.0、20.0和40.0 nmol/L)，每個濃度設4個復孔。

1.2.2 CCK-8法檢測MS-275對U251細胞增殖的影響 取備用細胞解凍后置于上述培養(yǎng)基中，用血球計數(shù)板計數(shù)細胞密度，按5.0×104密度種于96孔板中，孵育24 h后棄去舊的培養(yǎng)液加入含F(xiàn)BS的新鮮培養(yǎng)液，200 μl/孔，再按上述分組分別加入相應濃度的藥物，均培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)液，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH 7.4,100 μl/孔)和CCK-8溶液(10 μl/孔)，于37℃避光孵化1 h，經(jīng)酶標儀OD480檢測每組各孔吸光度(A值)，依照公式計算細胞增殖抑制率：抑制率(100%)=(1-試驗孔A值)/對照孔A值×100%。

1.2.3 Tranwell小室檢測MS-275對U251細胞遷移的影響 用不含血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整各組細胞密度為2.0×105/ml，上室加100 μl細胞懸液，下室加600 μl預先加10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育，24 h后棄上室培養(yǎng)液，取800 μl無水甲醇室溫固定30 min，棉簽輕輕拭去底膜上室側(cè)的細胞，用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，于倒置顯微鏡下計數(shù)，取底膜下室側(cè)左、右、中、上、下5處高倍視野(×400)的細胞總數(shù)，重復3次，并取平均值。

1.2.4 Annexin V-PI雙染色法檢測MS-275對U251細胞凋亡的影響 按試劑盒說明書操作，用不含EDTA的胰蛋白酶(0.25%)消化并收集各組細胞，冷PBS洗滌2次，buffer懸浮并調(diào)整細胞密度為1×106，流式管加入加100 μl細胞懸液，分別加入10 μl Annexin V和5 μl PI，混勻，常溫避光反應15 min，1 h內(nèi)經(jīng)流式細胞儀檢測，Ex=488 nm，Em=530 nm，計算總凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 CCK-8法檢測MS-275對U251膠質(zhì)瘤細胞增殖的影響 隨著MS-275藥物濃度不斷增加，其對U251膠質(zhì)瘤細胞增殖的抑制率明顯加強，2.0 nmol/L組(30.57±2.26)%，5.0 nmol/L組(47.21±4.28)%，10.0 nmol/L組(63.76±5.24)%，20.0 nmol/L組(66.81±3.76)%，40.0 nmol/L組(77.17±7.36)%，與空白組〔(6.98±4.91)%〕相比差異顯著(P<0.01)，而且MS-275對U251膠質(zhì)瘤細胞增殖的抑制率與藥物濃度呈劑量-效應關(guān)系。

2.2 Tranwell小室檢測MS-275對U251細胞遷移的影響 MS-275藥物處理U251膠質(zhì)瘤細胞48 h后，各濃度組U251膠質(zhì)瘤細胞的遷移能力受到明顯的抑制(P<0.05，P<0.01)，而且MS-275藥物對U251膠質(zhì)瘤細胞遷移的抑制能力具藥物濃度依賴性，其中空白組遷移(44.6±1.5)個，VPA組(34.2±1.1)個，MS-275 2.0 nmol/L組(21.1±1.3)個，5.0 nmol/L組(10.4±2.0)個，10.0 nmol/L組(9.8±1.7)個，20.0 nmol/L組(5.7±2.4)個，40.0 nmol/L(3.2±1.2)個。見圖1。

圖1 MS-275藥物對U251膠質(zhì)瘤細胞遷移的影響

2.3 Annexin V-PI雙染色法檢測MS-275對U251細胞凋亡的影響 各濃度的MS-275藥物處理后U251膠質(zhì)瘤細胞的凋亡率明顯增加，VPA組(9.52±1.20)%，MS-275 2.0 nmol/L組(12.58±1.12)%，5.0 nmol/L組(18.16±2.71)%，10.0 nmol/L組(26.78±1.96)%，20.0 nmol/L組(30.35±1.27)%，40.0 nmol/L組(46.01±1.08)%，與空白組〔(7.56±1.23)%〕比較差異顯著(P<0.05，P<0.01)。

3 討 論

組蛋白是存在于真核生物細胞核中、與DNA結(jié)合的分子量約10 000～20 000的堿性蛋白質(zhì)，它的甲基化修飾與異染色質(zhì)形成、基因印記、X染色體失活及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種生理功能相關(guān)。組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HATs)通過將乙酰輔酶A的乙酰基轉(zhuǎn)移到組蛋白氨基末端特定的賴氨酸殘基上完成乙?；喾碒DACs則使組蛋白的賴氨酸殘基去乙?；?〕；組蛋白乙?；梢约せ钐囟ɑ虻霓D(zhuǎn)錄，而組蛋白去乙?；瘎t使基因啟動子不易靠近轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件導致轉(zhuǎn)錄被抑制，催化組蛋白乙?；腍ATs/去乙?；腍DACs通過與癌基因或抑癌基因產(chǎn)物互相作用，從而修飾/介導該產(chǎn)物影響與細胞分化或增殖的相關(guān)基因，若這二者的平衡被打破將使基因表達失控，導致發(fā)生腫瘤。細胞失控性增殖、遷移都是惡性腫瘤的重要特征，瘤細胞從原發(fā)灶入侵至血管、淋巴管或體腔，隨血液、淋巴液進入另一個部位或器官，并在該處增殖生長，繼而發(fā)生與原發(fā)瘤同一類型的腫瘤。HDACs作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子參與有機體的生長發(fā)育過程，目前被發(fā)現(xiàn)的共有18種人類HDACs，包括Ⅰ型(HDAC1、2、3、8)、Ⅱ型(HDAC4、5、6、7、9、10)、Ⅲ型(SIRT1～7)和Ⅳ型(HDAC11)，其中主要高度相似的HDAC1和HDAC2在機體發(fā)育過程中參與細胞增殖、周期調(diào)控和細胞凋亡等多個細胞進程〔8〕，HDAC3在細胞周期調(diào)控和DNA損傷修復過程中也扮演重要角色。眾多研究結(jié)果顯示，HDACs在多種癌癥中都高表達，且它的作用機制對腫瘤發(fā)生的影響更顯著于其在腫瘤細胞中的高表達〔9〕，所以HDACi成為癌癥治療藥物的研究熱點，它作為新型的化療藥物提供了治療腫瘤的新方向，其抗腫瘤的分子機制有〔10〕：(1)阻滯細胞周期，抑制腫瘤細胞生長，HDACi通過調(diào)節(jié)異常增生和凋亡基因的表達從而抑制腫瘤細胞生長，如果腫瘤細胞DNA受損傷或有絲分裂異常，HDACi便中斷細胞周期，啟動修復途徑進行損傷修復。(2)誘導細胞凋亡，加速腫瘤細胞死亡，HDACi可上調(diào)腫瘤細胞死亡受體與配體的表達，啟動凋亡程序而導致細胞死亡；也可通過活化腫瘤細胞中的促凋亡蛋白Bax和Bak，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和bcl-xL的表達，誘導腫瘤細胞凋亡。(3)抑制血管生成，防止腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，HDACi通過抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF-A)的表達，抑制腫瘤血管的生成而防止腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移。(4)抑制腫瘤細胞遷移活性、誘導活性氧產(chǎn)生、誘導腫瘤免疫等其他抗腫瘤效應。

MS-275屬于苯甲酰胺類HDACi，是小分子化合物，分子量僅有376.4 kD，此藥通過抑制HDAC1和HDAC3的活性〔11〕，使細胞內(nèi)組蛋白乙?；?、核內(nèi)染色質(zhì)機構(gòu)改變、影響特異性基因表達，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，且其具有在體內(nèi)穩(wěn)定、可口服給藥、毒副作用相對小等特點，任亞嬋等〔12〕研究MS-275對胃癌細胞增殖能力的抑制，閆洪亮等〔13〕觀察到MS-275能抑制人宮頸癌SiHA細胞遷移，曲巍等〔14〕報道MS-275有效誘導膀胱癌細胞凋亡。本文也和細胞增殖抑制結(jié)果相符，而且MS-275的藥物作用呈濃度依賴性，另外，MS-275對U251的作用均比陽性對照藥VPA的作用強，具有一定的研究價值。

綜上，MS-275有望成為治療腦膠質(zhì)細胞瘤的有效途徑，可能與抑制U251膠質(zhì)瘤細胞的增殖和遷移能力、誘導U251膠質(zhì)瘤細胞凋亡相關(guān)，我們將進一步探索MS-275對U251膠質(zhì)瘤細胞的作用機制，為其治療提供更充足的理論依據(jù)。

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〔2016-10-27修回〕

(編輯 李相軍/滕欣航)

孟 亮(1984-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的基礎(chǔ)和臨床研究。

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A

1005-9202(2017)02-0309-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.021