王 濤 張澤峰 高 峰 王 瑞 米麗麗

(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院胸外一科，河北 石家莊 050000)

肺復康對肺癌小鼠腫瘤生長及E鈣黏蛋白表達的影響

王 濤 張澤峰 高 峰 王 瑞 米麗麗

(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院胸外一科，河北 石家莊 050000)

目的 探討肺復康對小鼠肺癌生長的抑制情況及分子水平檢測癌組織、癌旁組織E鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達。方法 70只C57BL/6小鼠隨機分為模型組、肺復康大、中、小劑量組及正常對照組，相同條件下喂養(yǎng)16 d，觀察各組小鼠的生長情況，檢測各組腫瘤的體積和重量，并檢測各組癌組織、癌旁組織E-cadherin蛋白的表達量。結(jié)果 觀察期中，模型組整體生長狀況不良，進食及活動情況明顯不佳，較其他組更加消瘦。肺復康大劑量組末次腫瘤重量明顯輕于模型組(P<0.05)；腫瘤生長抑制率明顯低于肺復康小劑量組(P<0.05)；肺復康大劑量組在第7、10、13、16天的腫瘤體積小于模型組(P<0.05)。Western印跡顯示肺復康大劑量組在癌組織及癌旁組織的E-cadherin蛋白表達量均高于模型組(P<0.05)。結(jié)論 肺復康對腫瘤的生長有抑制作用，其通過上調(diào)E-cadherin蛋白的表達促進上皮細胞間質(zhì)化(EMT)的發(fā)生，從而增強腫瘤細胞間的黏附和侵襲能力。

肺復康；肺癌；E鈣黏蛋白

研究表明，肺癌的復發(fā)、轉(zhuǎn)移與上皮細胞間質(zhì)化(EMT)密切相關〔1〕，當上皮細胞發(fā)生EMT后，上皮標記基因E鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達下調(diào)，使細胞侵襲和遷移能力增強，進而誘導癌癥的發(fā)生〔2〕。E-cadherin是一類細胞黏附分子，在細胞黏附及分化中起著至關重要的作用，廣泛存在于上皮組織，與腫瘤的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關，對評價腫瘤的惡性程度、浸潤深度、預測轉(zhuǎn)移及預后判斷均有重要的參考價值〔3〕。肺復康作為中醫(yī)藥制劑，臨床研究表明具有益氣養(yǎng)陰、化瘀解毒的功效，對肺癌患者有較好的治療效果，但具體的作用機制至仍不明確〔4〕。本文旨在通過建立小鼠肺癌模型，初步探討肺復康對肺癌生長及E-cadherin表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與瘤株 本實驗選取6～8周齡C57BL/6小鼠80只，雌雄各半，體重(20.13±1.96)g，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所，許可證號：SCXK(京)2005-0013。中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所提供肺癌瘤株。

1.2 藥品與試劑 肺復康由本課題組實驗室保存，主要成分：赤芍30 g，丹參30 g，百合20 g，瓜蔞皮20 g，桑白皮30 g，黃芪30 g，陳皮12 g，重樓20 g，谷麥芽各20 g，半枝連20 g，白術20 g，麥冬15 g，藿香15 g，臭牡丹20 g，神曲20 g，黃芩15 g，炮姜12 g，常規(guī)水煎，靜置沉淀，濾過濃縮，4℃保存?zhèn)溆谩?〕。生理鹽水、三乙醇胺(TBS-T)緩沖液均為實驗室自配，Radio-Immunoprecipitation Assa(RIPA)緩沖液購自北京博凌科為生物科技有限公司，十二烷基硫酸鈉(SDS)購自美國Sigma公司，硝酸纖維膜購自ThermoFisher公司，兔抗E-cadherin單克隆抗體、小鼠抗β-actin單克隆抗體、羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(HPR)、羊抗小鼠IgG-HPR均購自Proteintech公司，超敏化學放射發(fā)光法(ECL)化學發(fā)光試劑盒購自上海碩嘉生物科技有限公司。

1.3 儀器 倒置顯微鏡IX3(Olympus)，液氮罐(四川盛杰低溫設備制造股份有限公司)，DY89-1-電動玻璃勻漿器(寧波新芝)，低溫離心機(Sigma)，超凈臺(天津鈞星瑞科技有限公司)，精密電子天平(上海瞬宇恒平)，凝膠成像系統(tǒng)(Syngene G.BOX)，DYY-6C-電泳儀、DYCZ-24EN-電泳槽均購自北京六一儀器廠，轉(zhuǎn)膜儀購自ThermoFisher公司。

1.4 方法

1.4.1 小鼠肺癌模型的建立 將肺癌細胞從液氮罐中取出復蘇并傳代，將傳代后的0.2 ml細胞懸液接種至10只C57BL/6小鼠(雌雄各半)的右側(cè)腋窩，飼養(yǎng)無特定病原體(SPF)條件下飼養(yǎng)1個月后，將荷瘤小鼠以頸椎脫臼的方法處死，無菌條件下取出生長良好、新鮮淡粉色且無破潰的腫瘤組織，按瘤塊(g)∶生理鹽水(ml)為1∶3 的比例進行勻漿，200目篩子過濾制備細胞懸液，在56只小鼠腋窩下接種腫瘤勻漿液0.2 ml/只〔6〕。

1.4.2 動物分組及給藥 將上述接種后的56只小鼠隨機分為模型組、肺復康大、中、小劑量組，每組14只，雌雄各半，造模后第2天開始進行給藥。模型組用蒸餾水灌胃，每日每只0.5 ml，持續(xù)半個月；肺復康大劑量(4.0 g/ml)、中劑量(2.0 g/ml)、小劑量(1.0 g/ml)組，每日每只灌胃相應劑量肺復康0.5 ml，持續(xù)16 d；同時取14只同批小鼠作為正常對照，其余條件和實驗組完全相同。接種后1 w開始，觀察并記錄動物的進食、活動狀態(tài)及死亡情況，每3天測量腫瘤的長徑(X)及垂直短徑(Y)。16 d后，脫臼法處死小鼠，無菌條件下剝離腫瘤瘤體準確稱量其重量，計算腫瘤生長抑制率。

1.4.3 Western印跡檢測E-cadherin蛋白的表達 取腫瘤塊0.25 g，加入RIPA緩沖液進行裂解，并提取總蛋白，通過分光光計測蛋白濃度，調(diào)節(jié)蛋白濃度為15 μg/μl，取20 μl蛋白上樣后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離及轉(zhuǎn)膜、封閉。然后使用兔抗E-cadherin單克隆抗體孵育，TBS-T緩沖液洗滌，相應二抗進行雜交，使用ECL標記結(jié)合信號，暗室X線膠片曝光，調(diào)整曝光時間直至最佳條帶。以β-actin為參照，測E-cadherin蛋白的表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、方差分析和χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 肺復康對肺癌小鼠生存狀況的影響 在實驗過程中，各組均未出現(xiàn)小鼠死亡情況。但模型組整體生長狀況不良，進食及活動情況明顯不佳，較其他組更加消瘦。肺復康大中、小劑量組生長狀態(tài)明顯優(yōu)于模型組，和正常對照組相近。

2.2 各組小鼠腫瘤重量、生長抑制率比較 肺復康治療組小鼠末次腫瘤重量均低于模型組，且隨著劑量的增加，末次腫瘤重量逐漸減輕，肺復康大劑量組末次腫瘤重量為(2.59±0.61)g，明顯輕于模型組〔(4.07±0.96)g，P<0.05〕；中劑量組為(3.53±0.52)g，小劑量組為(3.61±0.48)g。肺復康大劑量組腫瘤生長抑制率(35.97%)明顯低于肺復康小劑量組(14.71%，P<0.05)，中劑量組為18.86%。

2.3 各組不同時期小鼠腫瘤體積比較 隨著時間的推移，小鼠腫瘤體積逐漸增大，但同一時間內(nèi)，肺復康治療組腫瘤體積均小于模型組，且劑量越大，體積越小；肺復康大劑量組第7、10、13、16天腫瘤體積均小于模型組(P<0.05)。見表1。

2.4 模型組與正常對照組E-cadherin蛋白表達比較 模型組癌組織和癌旁組織的E-cadherin蛋白表達量分別為(0.36±0.02)和(0.31±0.16)，均低于正常對照組的(0.44±0.03)(t=8.302，2.988；P=0.000，0.006)。

2.5 各組癌組織及癌旁組織E-cadherin蛋白表達比較 與模型組相比，肺復康大、中、小劑量組癌組織及癌旁組織E-cadherin蛋白表達量均有所升高，且肺復康大劑量組均明顯高于模型組(P<0.05)。見表2。

表1 各組不同時期小鼠腫瘤體積比較

與模型組比較：1)P<0.05；下表同

表2 各組癌組織及癌旁組織E-cadherin蛋白表達比較

3 討 論

目前對于肺癌的治療方法主要有手術、化療、放療、生物免疫制劑治療及中醫(yī)療法。中醫(yī)學認為肺癌屬本虛標實之證，虛多屬于肺脾氣虛，實多屬于痰濁瘀阻。其治療關鍵在于清肺祛痰，扶正祛邪，益氣活血〔7〕。肺復康正是基于這一理論研制的中藥制劑，以黃芪為主，能夠提高機體免疫力，減少膠原積聚，具有益氣扶正之功效；丹參能夠抑制炎癥細胞分泌、膠原合成、血小板聚集，從而抑制肺成纖維細胞增殖，發(fā)揮抗感染、活血化瘀之功效〔8〕。由于中藥毒副作用小，故肺復康對癌癥患者來說具有現(xiàn)實意義〔9〕。現(xiàn)代分子生物學研究證實，腫瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移的發(fā)生與細胞黏附，細胞與細胞以及細胞與基質(zhì)間的信號傳導通路異常有關〔10〕。肺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移包括一系列相當復雜的過程，主要包括細胞黏附、基質(zhì)降解和細胞運動3 個步驟。E-cadherin屬于鈣黏素家族中的一員，廣泛存于各類上皮細胞中，其主要功能為參與細胞間黏附，調(diào)節(jié)細胞外增殖相關信號，其表達降低或缺失將有利于腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移〔11〕。而EMT可使腫瘤細胞表型改變，從而使其獲得更強的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在胃癌的相關研究中，腫瘤細胞發(fā)生EMT后，細胞E-cadherin等上皮標記基因表達降低或消失，N-鈣黏蛋白等間質(zhì)標記基因表達升高，進而表現(xiàn)得更具遷移和侵襲性〔12〕。Tai等〔13〕人研究也發(fā)現(xiàn)敲除存活素基因的肝癌細胞GRP78的表達下調(diào)而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標志的波形蛋白的表達上調(diào)，進而介導其發(fā)生EMT。本研究小鼠肺癌模型建模成功。接種腫瘤株后，小鼠腫瘤體積增大，重量逐漸增重，模型組小鼠進食及活動情況明顯不佳，可能是因為腫瘤引起了相應癥狀，而肺復康大、中、小劑量治療組均未出現(xiàn)相應不良癥狀，說明肺復康對腫瘤有一定治療作用。此外，研究已發(fā)現(xiàn)腫瘤與EMT發(fā)生有關，而E-cadherin蛋白表達的下調(diào)會誘發(fā)EMT轉(zhuǎn)化，從而說明腫瘤的發(fā)生與E-cadherin蛋白有著密不可分的關系〔14〕。本研究也一定程度上證明了肺復康對腫瘤治療的積極作用。綜上，肺復康對腫瘤的生長有抑制作用，通過上調(diào)E-cadherin蛋白的表達促進EMT的發(fā)生，從而增強了腫瘤細胞間的黏附和侵襲能力，對腫瘤抑制作用的其他機制有待深入研究。

1 Gu K，Li MM，Shen J，etal.Interleukin-17-induced EMT promotes lung cancer cell migration and invasion via NF-kappaB/ZEB1 signal pathway〔J〕.Am J Cancer Res，2015；5(3)：1169-79.

2 Ko H，So Y，Jeon H，etal.TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition and acetylation of Smad2 and Smad3 are negatively regulated by EGCG in human A549 lung cancer cells〔J〕.Cancer Lett，2013；335(1)：205-13.

3 伍洲頌，張樹友.E-cadherin的表達與癌癥發(fā)生、發(fā)展及預后關系的探討〔J〕.臨床合理用藥雜志，2011；4(18)：170-1.

4 夏 丹，李勇敏，譚小寧，等.肺復康對Lewis肺癌小鼠腫瘤生長及E-cadherin、Vimentin和TGF-β表達的影響〔J〕.湖南中醫(yī)藥大學學報，2015；35(3)：30-3.

5 王云啟，梁 慧，李東芳，等.肺復康方改善中晚期非小細胞肺癌患者生活質(zhì)量的臨床研究〔J〕.湖南中醫(yī)藥大學學報，2014；34(8)：32-5.

6 李秀麗，張 丹，朱慶均，等.肺復康對Lewis肺癌模型小鼠腫瘤細胞P53、Bcl-2表達的影響〔J〕.山東中醫(yī)雜志，2012；31(9)：668-70.

7 王云啟，梁 慧，李東芳，等.肺復康方治療中晚期非小細胞肺癌30例〔J〕.遼寧中醫(yī)雜志，2015；42(1)：108-10.

8 趙 敏，李 炯，宋曉冬，等.肺復康合劑對大鼠肺纖維化的抑制作用及相關機制〔J〕.中國老年學雜志，2015；35(9)：2342-5.

9 劉孟安，姜學連，劉志學，等.肺復康合劑對肺纖維化大鼠血清變化的影響〔J〕.中國中醫(yī)急癥，2008；17(12)：1730-1.

10 邵偉偉，郝蘭香，蘭建云，等.EphA2、E-鈣黏蛋白在非小細胞肺癌中的表達及意義〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2015；23(19)：2761-3.

11 馬修平，張 海，汪亦品，等.E-cadherin表達下調(diào)致GSK-3β磷酸化失活的分子機制研究〔J〕.南京醫(yī)科大學學報(自然科學版)，2012；32(7)：896-902.

12 Ye Y，Miao S，Wang Y，etal.3，3′-diindolylmethane potentiates tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis of gastric cancer cells〔J〕.Oncol Lett，2015；9(5)：2393-7.

13 Tai CJ，Chin-Sheng H，Kuo LJ，etal.Survivin-mediated cancer cell migration through GRP78 and epithelial-mesenchymal transition(EMT)marker expression in Mahlavu cells〔J〕.Ann Surg Oncol，2012；19(1)：336-43.

14 張 莉，沈麗佳，謝思明.影響E-鈣黏蛋白表達下調(diào)因素與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化關系的研究進展〔J〕.中外醫(yī)學研究，2014；12(10)：158-60.

〔2016-11-22修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

張澤峰(1973-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事胸心外科研究。

王 濤(1979-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事胸心外科研究。

R73

A

1005-9202(2017)02-0304-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.019