董躍濱 尚精娟

(上海市第七人民醫(yī)院消化科，上海 200137)

香連片預(yù)防小鼠潰瘍性結(jié)腸炎癌變的作用及機(jī)制

董躍濱 尚精娟

(上海市第七人民醫(yī)院消化科，上海 200137)

目的 探討香連片在小鼠潰瘍性結(jié)腸炎(UC)癌變預(yù)防中的作用機(jī)制。方法 將60只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、香連片組和柳氮磺胺嘧啶組，每組15只，采用1，2-二甲基肼(DMH)/葡萄聚糖硫酸鈉(DSS)復(fù)合法誘導(dǎo)小鼠UC癌變模型。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)DKK-1和WTF-1 mRNA的表達(dá)，采用免疫組化法檢測(cè)β-鏈蛋白(β-catenin)和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與空白組比較，其余各組β-catenin及PANA蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)；與模型組比較，香連組和對(duì)照組β-catenin和PANA蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)；香連組和對(duì)照組β-catenin和PANA蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與空白組比較，模型組DKK-1 mRNA表達(dá)降低，香連組和對(duì)照組表達(dá)升高，其他各組WTF-1 mRNA均表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，香連組和對(duì)照組DKK-1和WTF-1 mRNA表達(dá)均升高(P<0.05)；香連組和對(duì)照組DKK-1和WTF-1 mRNA表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 香連片可以通過(guò)抑制β-catenin和PANA蛋白表達(dá)、提高DKK-1和WTF-1 mRNA表達(dá)阻斷Wnt通路，發(fā)揮預(yù)防UC癌變的作用。

潰瘍性結(jié)腸炎；癌變；香連片

研究表明，香連片具有抗菌、抗胃腸炎、抗?jié)冃越Y(jié)腸炎(UC)等藥理作用〔1〕。據(jù)報(bào)道，約5%的UC患者在疾病進(jìn)展過(guò)程中發(fā)生癌變，其癌變機(jī)制尚不明確，但研究發(fā)現(xiàn)與患者病程、嚴(yán)重程度和復(fù)發(fā)率密切相關(guān)〔2〕。Wnt信號(hào)通路在結(jié)直腸癌的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。β-鏈蛋白(β-catenin)在Wnt通路中發(fā)揮正向調(diào)節(jié)效應(yīng)，核內(nèi)β-catenin水平的升高能夠激活下游效應(yīng)基本的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，是Wnt信號(hào)通路的激活標(biāo)識(shí)，參與結(jié)直腸癌的進(jìn)展〔3〕。β-catenin已經(jīng)作為結(jié)腸癌進(jìn)展的常見(jiàn)標(biāo)志物。DKK-1是一種外泌型的糖蛋白，在Wnt信號(hào)通路中發(fā)揮拮抗作用，能夠特異性的抑制Wnt信號(hào)通路〔4〕。本研究擬構(gòu)建UC癌變小鼠模型，從分子生物學(xué)水平上探討香連片在UC癌變預(yù)防中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及分組 選擇60只7～8 w BALB/C雄性小鼠，體重(21.21±3.11)g，由上海義森生物科技有限公司提供。將60只小鼠隨機(jī)分成空白組、模型組、香連片組和柳氮磺胺嘧啶對(duì)照組，每組15只。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及器材 香連片：0.3 g/片，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10900035，購(gòu)自湖北香連藥業(yè)有限責(zé)任公司；柳氮磺胺嘧啶，0.25 g/片，國(guó)藥準(zhǔn)字H31020450，購(gòu)自上海中西三維藥業(yè)有限公司。葡萄聚糖硫酸鈉(DSS)(分子量50 kD)購(gòu)自Fluka公司，1，2-二甲基肼(DMH)購(gòu)自Sigma公司。小鼠β-catenin、β-catin、DKK-1引物均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)一抗購(gòu)自Abcam生物工程有限公司；Trizol購(gòu)自Superior公司；ABI熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；Elx800NB酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司。

1.3 動(dòng)物模型 空白組給予生理鹽水作為對(duì)照，不做其他處理。模型組采用腹腔注射DMH結(jié)合飲用DSS法制備UC癌變模型。實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔注射20 mg/kg DMH，2次/w，在各造模組小鼠飲用生理鹽水中添加5%DSS，2 w，以上整個(gè)流程(共3 w)為1個(gè)循環(huán)，重復(fù)以上過(guò)程3個(gè)循環(huán)。從第10周開(kāi)始不做處理，持續(xù)至第18周。香連組：將香連片溶解在蒸餾水中，用藥濃度13.5 mg/ml，自造模前1 w開(kāi)始用藥，至造模第10周。對(duì)照組：將柳氮磺胺嘧啶溶解在蒸餾水中，用藥濃度7.5 mg/ml，自造模前1 w開(kāi)始用藥，至造模第10周。

1.4 檢測(cè)DKK-1和WTF-1 mRNA的表達(dá) 采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)對(duì)腸組織中DKK-1和WTF-1 mRNA的表達(dá)進(jìn)行半定量測(cè)量。取新鮮的病變腸組織和正常腸組織分別提取RNA，操作過(guò)程嚴(yán)格按照RNA提取試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行。采用Biotek酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR儀反應(yīng)程序：95℃下變性30 s，60℃下退火30 s，循環(huán)40次。DKK-1引物序列：上游序列5′-GACTCTTGACAACTACCAGC-3′，下游序列5′-AAATGGCTGTGGTCAGAGGG-3′；WTF-1引物序列：上游序列5′-TGTATGAACGGTGGTCTGTG-3′，下游序列5′-ATTTACCTCCATTTCGGGAG-3′。

1.5 檢測(cè)β-catenin和PCNA蛋白表達(dá) 采用免疫組化法檢測(cè)β-catenin和PCNA蛋白表達(dá)。各組織切片脫蠟至水，100℃加熱，抗原修復(fù)；室溫下，過(guò)氧化氫-甲醇(3%)封閉20 min；牛血清白蛋白溶液(5%)封閉30 min。滴加1∶500的β-catenin一抗和1∶250的PANA一抗，4℃搖床過(guò)夜，加二抗，常溫孵育30 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色液顯色，控制顯色時(shí)間在10 min；根據(jù)陽(yáng)性染色位置調(diào)整復(fù)染、脫水、透明、封片。

1.6 蛋白表達(dá)結(jié)果判定 當(dāng)細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色棕黃色顆粒定義為β-catenin陽(yáng)性，當(dāng)細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為PCNA陽(yáng)性。判斷標(biāo)準(zhǔn)：高倍鏡下選擇5個(gè)視野，依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的比例及其著色強(qiáng)度計(jì)分。(1)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分值為0分(<5%)、1分(5%～25%)、2分(25%～50%)、3分(>50%)；(2)陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度分值為0分(陰性)、1～2分(弱陽(yáng)性)、3～5分(中等陽(yáng)性)、6～7分(強(qiáng)陽(yáng)性)。

1.7 基因相對(duì)表達(dá)量判斷 采用ΔΔCT法分析基因的相對(duì)表達(dá)量，其相對(duì)表達(dá)量為2-ΔΔCT。ΔΔCT=(觀察樣本ΔCT-對(duì)照樣本ΔCT)，T=(觀察樣本目的基因CT-內(nèi)參基因CT)-(對(duì)照樣本目的基因CT-內(nèi)參基因CT)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0進(jìn)行方差分析和LSD法。

2 結(jié) 果

2.1 各組β-catenin和PCNA蛋白表達(dá)比較 各組間β-catenin和PCNA蛋白表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白組比較，其余各組β-catenin及PCNA蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)；與模型組比較，香連組和對(duì)照組均降低(P<0.05)；香連組和對(duì)照組β-catenin和PCNA蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 各組DKK-1和WTF-1 mRNA表達(dá)比較 各組間DKK-1 mRNA和WTF-1 mRNA表達(dá)量均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白組比較，模型組DKK-1 mRNA表達(dá)降低，香連組和對(duì)照組表達(dá)升高，其他各組WTF-1 mRNA均表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，香連組和對(duì)照組DKK-1和WTF-1 mRNA表達(dá)均升高(P<0.05)；香連組和對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組β-catenin、pCNA及DKK-1、WTF-1 mRNA比較

與空白組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

3 討 論

UC病變常累及直腸和結(jié)腸，黏膜出現(xiàn)彌漫性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，伴有多發(fā)性潰瘍。UC癌變的發(fā)展經(jīng)歷著炎癥-增生-癌變的進(jìn)程〔5〕。目前，UC治療藥物主要有免疫抑制劑、類固醇激素和氨基水楊酸類。氨基水楊酸類常用于中輕型患者，免疫抑制類和激素類常用于重度患者的治療。前期有研究發(fā)現(xiàn)，香連片能夠預(yù)防UC的癌變進(jìn)程。Wnt信號(hào)通路是一條信號(hào)轉(zhuǎn)到途徑，在許多發(fā)育過(guò)程和機(jī)體組織的動(dòng)態(tài)平衡張發(fā)揮重要作用，還參與了干細(xì)胞的分化過(guò)程〔6〕。其中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路也被稱為經(jīng)典Wnt通路，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的β-catenin，對(duì)下游靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控〔7〕。首先，由Axin、APC和GSK3β形成磷酸化胞質(zhì)，被磷酸化和泛素化后，被蛋白酶體降解。當(dāng)細(xì)胞外配體Wnt與細(xì)胞膜上的Frizzled受體及LRP5/6受體結(jié)合后，激活Wnt信號(hào)通路。激活的受體將信號(hào)傳遞給細(xì)胞質(zhì)中的蛋白，使得β-catenin降解并積累。大量β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，與LEF/TCF等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后，激活下游靶基因的調(diào)控。在Wnt信號(hào)通路的過(guò)程中，DKK一方面可以與LRP5/6結(jié)合，干擾LRR5/6和Frizzled復(fù)合物的結(jié)合；另一方面，能夠與Krm受體和LRP6形成復(fù)合物，發(fā)生內(nèi)吞現(xiàn)象，細(xì)胞膜表面LRP6受體被清楚，抑制Wnt信號(hào)〔8〕。WIF-1是一種內(nèi)源性拮抗劑，在腫瘤發(fā)生的過(guò)程進(jìn)程中發(fā)揮重要生物學(xué)作用。WIF-1能夠與Wnt配體蛋白結(jié)合抑制其信號(hào)通路〔9〕。

本研究結(jié)果說(shuō)明香連片能夠下調(diào)β-catenin蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制Wnt通路的激活。且香連片能夠上調(diào)DDK-1和WTF-1 mRNA的表達(dá)，抑制Wnt通路，與殷銀霞等〔10〕、王欣等〔11〕研究一致。綜上所述，香連片可以通過(guò)抑制β-catenin和PANA蛋白表達(dá)、提高DKK-1和WTF-1 mRNA表達(dá)阻斷Wnt通路，發(fā)揮預(yù)防UC癌變的作用。

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〔2016-10-25修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

董躍濱(1962-)，女，碩士，主任醫(yī)師，主要從事潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制的研究。

R574.63

A

1005-9202(2017)02-0297-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.016