王 潔 韓艷艷 李 娟 毛向雷 牛草原 李艷艷 蘭春偉 譚 軍

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453000)

腺苷預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪復(fù)氧糖后CX3CL1、GLT-1表達(dá)的變化

王 潔 韓艷艷 李 娟 毛向雷 牛草原 李艷艷 蘭春偉 譚 軍

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453000)

目的 探討在缺氧復(fù)氧情況下腺苷預(yù)處理誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體蛋白(GLT-1)和趨化因子(CX3CL1)的表達(dá)變化。方法 原代培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞分為正常組、模型組和腺苷預(yù)處理組。模型組:細(xì)胞接受5 h氧糖剝奪/復(fù)氧糖24 h處理；腺苷預(yù)處理組：細(xì)胞在氧糖剝奪前24 h加入100 μmol/L腺苷后接受5 h氧糖剝奪/復(fù)氧糖24 h。在5 h氧糖剝奪/復(fù)氧糖24 h后觀察各組的細(xì)胞形態(tài)、MTT法檢測各組細(xì)胞活力，ELISA檢測各組CX3CL1的相對表達(dá)情況，免疫熒光法及Western印跡法檢測各組GLT-1的相對表達(dá)情況。結(jié)果 ①正常組、模型組和腺苷預(yù)處理組在氧糖剝奪5 h復(fù)氧糖24 h后細(xì)胞活力(OD值)分別是(0.763±0.065)，(0.217±0.052)和(0.404±0.013)，腺苷可以減少缺氧復(fù)氧引起的損傷(P<0.05)。②與正常組相比，星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺氧復(fù)氧后，其釋放的趨化因子CX3CL1明顯升高(P<0.05)，GLT-1的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，腺苷預(yù)處理組可明顯降低缺氧復(fù)氧組CX3CL1的釋放(P<0.05)，以及增加缺氧復(fù)氧GLT-1的表達(dá)水平(P<0.05)。結(jié)論 腺苷預(yù)處理可使氧糖剝奪/復(fù)氧糖后CX3CL1的釋放減少，GLT-1表達(dá)量升高，從而增強(qiáng)腦對缺血再灌注損傷的耐受。

CX3CL1；谷氨酸轉(zhuǎn)運體蛋白；星形膠質(zhì)細(xì)胞；氧糖剝奪/復(fù)氧糖

腦組織過度的炎癥反應(yīng)是造成腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一，腦缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵是白細(xì)胞聚集并遷移至腦實質(zhì)中。CX3CL1作為腦中主要的趨化因子，具有黏附、趨化、調(diào)節(jié)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞功能及神經(jīng)保護(hù)等多重作用，參與腦缺血再灌注損傷的發(fā)生和發(fā)展〔1〕。谷氨酸積聚所致的興奮性毒性被認(rèn)為是腦缺血再灌注損傷的另一重要機(jī)制〔2〕。腦內(nèi)清除谷氨酸的主要機(jī)制是谷氨酸轉(zhuǎn)運體蛋白(GLT)-1將胞外谷氨酸重攝取至胞內(nèi)，以終止谷氨酸的神經(jīng)興奮作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上表達(dá)大量GLT-1，參與了大部分胞外谷氨酸的清除，但在缺血缺氧等條件下其功能表達(dá)會發(fā)生顯著變化，從而導(dǎo)致谷氨酸興奮性毒性。腺苷作為一種神經(jīng)遞質(zhì)與G蛋白耦聯(lián)受體(主要是受體A1)相結(jié)合后，激活A(yù)TP依賴的鉀離子通道，抑制興奮性氨基酸釋放，阻止興奮性氨基酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元除極效應(yīng)，降低細(xì)胞膜對鈣離子的通透性，擴(kuò)張血管，抑制炎性細(xì)胞黏附和浸潤，抑制血小板聚集以及減輕炎性細(xì)胞、自由基導(dǎo)致的血管內(nèi)皮損傷。本研究探討腺苷是否通過調(diào)節(jié)CX3CL1及GLT-1發(fā)揮抗腦缺血再灌注損傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料 出生24 h內(nèi)的SD大鼠，雌雄不限，體重10～12 g。由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。高糖DMEM培養(yǎng)基，無糖DMEM(Gibco)，胎牛血清，青鏈霉素，0.25%胰蛋白酶，MTT試劑盒，ELISA試劑盒，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體、GLT-1抗體均購自武漢博士德生物有限公司。

1.2 實驗分組和OGD模型的建立〔3〕大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)參照參考文獻(xiàn)〔4〕。將第三代融合80%以上的星形膠質(zhì)細(xì)胞傳代至24孔板內(nèi)，隨機(jī)分為正常組，模型組和腺苷預(yù)處理組。細(xì)胞經(jīng)24 h基本貼壁并伸出突觸，待細(xì)胞貼壁后腺苷預(yù)處理組給予腺苷預(yù)處理，即細(xì)胞換含100 μmol/L腺苷的DMEM預(yù)處理，24 h后進(jìn)行氧糖剝奪。正常組不進(jìn)行氧糖剝奪，模型組和腺苷預(yù)處理組在糖氧剝奪期分別更換為預(yù)熱的無糖DMEM培養(yǎng)基，去培養(yǎng)板蓋，放入95%氮氣、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育。缺氧5 h后，模型組及腺苷預(yù)處理組均更換為預(yù)熱的復(fù)糖DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。正常組在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.3 星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 用光學(xué)顯微鏡(德國Leica)直接觀察各組細(xì)胞在氧糖剝奪復(fù)氧后形態(tài)變化。

1.4 細(xì)胞活性檢測 取第3代星形膠質(zhì)細(xì)胞以1×105個/ml的密度接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為104個，待24 h后細(xì)胞基本融合后，氧糖剝奪處理過程如同上述，各孔加入相應(yīng)的培養(yǎng)基100 μl，在再復(fù)氧復(fù)糖24 h時，每孔加入MTT50 μl，充分混勻，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h后平板離心機(jī)1 000 r/min離心5 min，小心去除培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，37℃搖晃10 min，用450 nm波長測定OD值，各實驗組設(shè)5個復(fù)孔，獨立重復(fù)3次。

1.5 ELISA檢測CX3CL1表達(dá) 將對數(shù)生長期的星形膠質(zhì)細(xì)胞以5×104個/ml的密度接種于24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞基本融合后，吸棄培養(yǎng)液，進(jìn)行隨機(jī)分組，每組設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次，各組氧糖剝奪處理過程如同上述，各孔加入相應(yīng)的培養(yǎng)基1 000 μl，在再復(fù)氧復(fù)糖24 h時，收集各組細(xì)胞上清液，按大鼠試劑盒進(jìn)行CX3CL1測定。

1.6 免疫熒光測GLT-1的表達(dá)〔4〕取第3代星形膠質(zhì)細(xì)胞傳代至24孔板內(nèi)，隨機(jī)分為正常組、模型組、腺苷預(yù)處理組(ADO/R)，氧糖剝奪過程如上述。24 h細(xì)胞貼壁后，用PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，棄去，PBS洗3次，0.1%Triton-X 100作用10 min，PBS液漂洗3次，5%BSA封閉1 h，棄封閉液，加入兔抗GLT-1抗體(1∶200稀釋)，孵育過夜，棄一抗，PBS液漂洗3次，加FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(1∶200稀釋)，室溫孵育1 h，棄二抗，熒光顯微鏡下觀察拍照。觀察照相后以Image Pro-Plus 6.0軟件分析得出平均吸光度值及熒光強(qiáng)度。

1.7 Western印跡測GLT-1表達(dá)量 分別消化各組缺氧復(fù)氧后的細(xì)胞，加上蛋白裂解液，冰上裂解20 min，測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，沸水變性5 min，每孔加入40 μg蛋白樣品電泳，用NC膜轉(zhuǎn)膜，封閉后加一抗(1∶500稀釋)，4℃孵育過夜，加入HRP標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h，ECL顯影，GAPDH作為內(nèi)參對照，用ImageJ軟件分析熒光條帶吸光度值。以目的蛋白GLT-1與內(nèi)參的比值進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較均采用Turkey法。

2 結(jié) 果

2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定結(jié)果 分離培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞接種2 h 開始貼壁生長，3 d后胞體增大，7 d時基本成熟，胞體較大、扁平、形狀多樣，從胞體發(fā)出許多長而分支的突起，形成密集的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞傳到第3 代后，用兔抗GFAP 多克隆抗體進(jìn)行免疫熒光染色，可見細(xì)胞陽性率達(dá)95%以上;熒光顯微鏡下顯示清晰的星形膠質(zhì)細(xì)胞，輪廓清晰，胞質(zhì)中呈綠色熒光，胞核處熒光淺淡，胞體寬大而扁平，發(fā)出多個短而粗大的突起，形態(tài)不規(guī)則，相互連接成片。見圖1。

2.2 各組星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)觀察及活力檢測結(jié)果 糖氧剝奪復(fù)糖氧后正常組星形膠質(zhì)細(xì)胞生長狀態(tài)良好，折光性強(qiáng)，相連的細(xì)胞之間形成大量的突觸聯(lián)系，與氧糖剝奪復(fù)氧糖前相比無明顯形態(tài)學(xué)變化。模型組星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體水腫變圓，細(xì)胞形態(tài)由不規(guī)則變成梭形，突起明顯變短或消失；腺苷預(yù)處理組細(xì)胞水腫較輕。見圖2。

2.3 MTT 與細(xì)胞的形態(tài)變化相一致。正常組、模型組、腺苷預(yù)處理組在氧糖剝奪5 h復(fù)氧24 h后細(xì)胞活力(OD值)分別是(0.763±0.065)，(0.217±0.052)，(0.404±0.013)。模型組星形膠質(zhì)細(xì)胞活力下降，明顯低于正常組(P<0.05)。腺苷預(yù)處理組細(xì)胞活力顯著高于模型組，表明腺苷與處理組能明顯改善細(xì)胞活力(P<0.05)。三組間兩兩比較差異顯著(P<0.05)。

2.4 糖氧剝奪復(fù)糖氧24 h后細(xì)胞培養(yǎng)液中CX3CL1濃度 模型組星形膠質(zhì)細(xì)胞CX3CL1濃度明顯高于正常組(P<0.05)，表明細(xì)胞受到缺氧缺糖損傷，細(xì)胞損傷嚴(yán)重，釋放大量CX3CL1；與模型組比較，腺苷預(yù)處理組細(xì)胞損傷輕，CX3CL1釋放減少(P<0.05)。

2.5 GLT-1免疫熒光結(jié)果 正常組胞膜及胞質(zhì)中熒光信號最強(qiáng)；糖氧剝奪復(fù)糖氧后，胞膜熒光信號減弱；而胞質(zhì)中熒光表達(dá)弱且無明顯變化。與模型組相比，腺苷預(yù)處理組胞膜熒光強(qiáng)度降低但高于正常組。見圖3。

2.6 Western印跡檢測氧糖剝奪/復(fù)糖后GLT-1的表達(dá) 如圖4所示，正常組星形膠質(zhì)細(xì)胞在氧糖剝奪5 h復(fù)氧糖24 h后蛋白表達(dá)相對最高，腺苷預(yù)處理組次之，模型組最低(P<0.05)。

圖1 免疫熒光染色鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞(×200)

圖2 各組星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧復(fù)氧后的形態(tài)學(xué)改變(×100)

圖3 各組GLT-1免疫熒光結(jié)果(×200)

圖4 各組細(xì)胞在氧糖剝奪5 h復(fù)氧糖24 h后GLT-1的表達(dá)

3 討 論

近年研究表明，缺血后的血流恢復(fù)在某些情況下能導(dǎo)致進(jìn)一步的組織損傷和功能障礙，這種恢復(fù)血流灌注后的有害情況稱為缺血再灌注損傷(IRI)〔6〕。雖然目前人們對其病理機(jī)制進(jìn)行了深入研究發(fā)現(xiàn)，其病理過程是一個多因素、多機(jī)制，涉及復(fù)雜的時間和空間的級聯(lián)反應(yīng)。腦缺血再灌注損傷機(jī)制復(fù)雜，炎癥反應(yīng)在其中的作用越來越受到重視。腦缺血再灌注損傷的最早反應(yīng)是局部白細(xì)胞遷移、炎性細(xì)胞因子出現(xiàn)和增多。另外，炎癥反應(yīng)會加大梗死核心區(qū)周圍區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞損傷。在此過程中，趨化因子是調(diào)節(jié)白細(xì)胞遷移和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化的關(guān)鍵因素。能在腦中持續(xù)表達(dá)的趨化因子極少，CX3CL1 為其中之一〔7〕。它對中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞均有趨化作用。研究表明，僅基質(zhì)細(xì)胞衍生因子和CX3CL1可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)持續(xù)表達(dá)〔8〕。趨化因子與炎癥過程密切相關(guān)，能吸引炎性細(xì)胞在炎癥區(qū)域聚集，參與調(diào)控白細(xì)胞遷移，在炎癥中誘導(dǎo)性表達(dá)。有人提出趨化因子能增加血腦脊液屏障通透性，使炎性細(xì)胞及因子在病灶處聚集，加重腦損傷。生理狀態(tài)時小鼠的CX3CL1幾乎僅存在于大腦，其特異性受體CX3CR1 在腦中也呈高表達(dá)，CX3CL1 及受體主要分布于大腦皮質(zhì)、海馬、基底神經(jīng)節(jié)、紋狀體及嗅球，主要表達(dá)于皮質(zhì)板層Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ及海馬CA1 區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元上，在腦干、小腦僅少量表達(dá)〔9〕。CX3CL1是目前發(fā)現(xiàn)唯一不依賴黏附因子而介導(dǎo)炎性細(xì)胞及炎癥介質(zhì)黏附于內(nèi)皮細(xì)胞的趨化因子，能加快炎性因子滲出，促進(jìn)炎癥級聯(lián)反應(yīng)發(fā)生，獨特的結(jié)構(gòu)和生物特性使其可能在缺血再灌注損傷中起重要作用〔10〕。腦缺血再灌注損傷中的炎癥反應(yīng)在缺血再灌注損傷過程十分復(fù)雜〔11〕，其特點是血腦脊液屏障崩裂導(dǎo)致白細(xì)胞穿透血腦屏障并在損傷區(qū)異常聚集黏附。在缺血1～48 h 內(nèi)出現(xiàn)明顯的中性粒細(xì)胞浸潤和聚集，2～15 d單核細(xì)胞浸潤明顯。缺血再灌注時缺血處血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)功能障礙，各種趨化因子及炎癥介質(zhì)表達(dá)增加，白細(xì)胞在缺血處聚集，且與微血管內(nèi)皮細(xì)胞間黏附性增強(qiáng)，白細(xì)胞貼壁、嵌塞并游出微血管外，釋放大量氧自由基和炎性因子，導(dǎo)致神經(jīng)元繼發(fā)性損傷。除炎性細(xì)胞因子和黏附分子外，趨化因子及其受體在白細(xì)胞聚集進(jìn)入缺血性損傷部位中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔12〕。缺乏CX3CR1 不會誘發(fā)腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)毒性，而是顯著降低了腦缺血的損傷和炎癥反應(yīng)。

興奮性氨基酸毒性是腦缺血再灌注損傷的另一重要因素。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，對維持正常腦功能至關(guān)重要，但過高濃度的谷氨酸又具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性。研究表明，谷氨酸的興奮性毒性是腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一〔13〕。因此，降低腦缺血再灌注時細(xì)胞外液中谷氨酸的濃度，是減輕神經(jīng)元損傷的重要策略。腦內(nèi)細(xì)胞外沒有谷氨酸代謝酶，腦內(nèi)細(xì)胞外谷氨酸的穩(wěn)態(tài)主要依靠高親和力興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體系統(tǒng)(EAATs)維持〔14〕。目前，已經(jīng)克隆出5種高親和力谷氨酸轉(zhuǎn)運體，包括EAAT1(GLAST)、EAAT2、EAAT3(EAAC1)、EAAT4、EAAT5。EAAT2主要分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上，又稱為膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1〔15〕。GLT-1在清除突觸間隙的谷氨酸、維持細(xì)胞外液谷氨酸濃度處于低水平、防止其興奮性毒性方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，GLT-1表達(dá)上調(diào)在腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受中發(fā)揮重要作用，提示GLT-1的功能異常在缺血性腦損傷中發(fā)揮重要作用，調(diào)制GLT-1的表達(dá)和功能、增強(qiáng)其攝取谷氨酸的能力，有可能成為腦缺血類疾病預(yù)防和治療研究的新靶點〔16〕。

腺苷用于腦缺血再灌注損傷的預(yù)處理作用效果好，價格便宜，且腺苷預(yù)處理方面已取得了一定的成果〔17〕。腺苷能抑制EAA的釋放，降低細(xì)胞膜對鈣離子的通透性，抑制炎性細(xì)胞黏附和浸潤，抑制血小板聚集，減輕自由基引起的血管內(nèi)皮損傷，是一種內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)劑，腺苷的作用是通過特異性腺苷受體調(diào)節(jié)的，腺苷受體分為A1、A2、A3三種〔18〕。缺血預(yù)處理時用藥物阻斷A1受體或ATP通道能阻斷缺血耐受的形成。A1R在腦缺血中具有神經(jīng)保護(hù)作用原代培養(yǎng)的皮質(zhì)或海馬神經(jīng)元細(xì)胞，在糖-氧剝奪的條件下給予A1R選擇性激動劑環(huán)己基處理后，其細(xì)胞損傷明顯減輕，而A1R特異性拮抗劑可加重同一缺氧模型所誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷〔19〕。同樣，在腦缺血的動物模型中也有類似發(fā)現(xiàn)。這些都提示A1R對腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。本實驗腺苷通過抑制CX3CL1的釋放及上調(diào)GLT-1的表達(dá)，產(chǎn)生腦保護(hù)效應(yīng)。

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〔2015-09-30修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

王 潔(1987-)，女，碩士，醫(yī)師，主要從事腦血管疾病研究。

R3

A

1005-9202(2017)02-0288-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.013