葉麗平 馬靜方 仇會會

(錦州醫(yī)科大學病理生理學教研室，遼寧 錦州 121001)

RNA干擾cAMP反應元件結合蛋白對堿性成纖維細胞生長因子誘導的人卵巢癌細胞Bcl-2表達的影響

葉麗平 馬靜方 仇會會

(錦州醫(yī)科大學病理生理學教研室，遼寧 錦州 121001)

目的 探討cAMP反應元件結合蛋白(CREB)是否介導堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)誘導的人卵巢癌CAOV3細胞Bcl-2的表達。方法 分為①空白對照組，陰性對照組，siRNA CREB組。脂質體轉染干擾序列72 h，RT-PCR、Western印跡檢測CREB表達并鑒定轉染最佳濃度。②對照組，bFGF組，bFGF+ siRNA組。轉染48 h后饑餓培養(yǎng)24 h。RT-PCR，Western印跡檢測Bcl-2表達。倒置顯微鏡下觀察細胞生長及形態(tài)改變，MTT法檢測細胞增殖。結果 ①與兩對照組相比，siRNA CREB明顯抑制CREB mRNA及蛋白表達(P<0.01)，100 nmol/L抑制效果最佳。②與對照組相比，bFGF組明顯促進細胞生長，上調Bcl-2表達，bFGF+ siRNA CREB組則部分抑制bFGF的作用(P<0.01)。結論 bFGF可能部分通過CREB調節(jié)人卵巢癌CAOV3細胞Bcl-2的表達，參與細胞的生存及增殖調控。

RNA干擾；堿性成纖維細胞生長因子；cAMP反應元件結合蛋白；Bcl-2；卵巢癌

卵巢癌的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細胞增殖失控、凋亡受抑制有關。堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)可通過多種信號通路促進細胞的生長和增殖。cAMP反應元件結合蛋白(CREB)屬于轉錄因子，受上游信號如生長因子的激活可調節(jié)多種抗凋亡基因的轉錄及表達〔1,2〕。研究表明卵巢癌等多種惡性腫瘤細胞高表達bFGF受體及Bcl-2，可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關〔3,4〕。但目前關于bFGF是否參與調節(jié)卵巢癌表達Bcl-2表達，以及是否通過CREB調節(jié)Bcl-2的基因轉錄尚不清楚。本研究利用RNA干擾技術(RNAi)抑制卵巢癌CAOV3細胞CREB的基因表達，觀察其對bFGF誘導的Bcl-2表達及細胞增殖的影響，以探討bFGF調控卵巢癌細胞增殖與凋亡的信號機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢癌CAOV3細胞系購自武漢大學保藏中心。脂質體2000、Trizol、MTT購自Invitrogen。CREB特異性siRNA，無義RNAi由上海吉凱基因化學技術有限公司合成。重組人bFGF購自北京雙鷺藥業(yè)有限公司。兔抗人CREB、Bcl-2及β-actin購自北京博奧森北京博奧森生物技術有限公司，ECL試劑盒、MTT購自北京中杉金橋生物技術公司，RT-PCR試劑盒及引物購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 細胞轉染及分組 CAOV3細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2常規(guī)培養(yǎng)，取對數生長期細胞用于轉染實驗。(1)分為：①空白對照組，②陰性對照組，③siRNA CREB組。待細胞融合至40%～50%，雙無培養(yǎng)基饑餓過夜，按脂質體2000轉染試劑說明書分別轉染終濃度50、100、150 nmol/L的特異性siRNA CREB(5′-CAAAUGACAGUUCAAGCCCAGdTdT-3′)，陰性對照組轉染無義RNA，空白對照組僅含脂質體。轉染4 h后常規(guī)換液，72 h后檢測CREB表達，確定最佳干擾濃度。(2)分為：①對照組，②bFGF組，③ bFGF+ siRNA CREB組。①②組僅含脂質體，③組轉染終濃度100 nmol/L的siRNA CREB，轉染方法同前。轉染48 h后更換含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，按組別分別加入終濃度為75 ng/L的bFGF，對照組加入等量的PBS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后檢測Bcl-2的表達，觀察細胞生長及增殖。觀察干擾CREB對bFGF誘導的Bcl-2表達的影響。

1.3 RT-PCR檢測CREB、Bcl-2 mRNA表達 Trizol法提取總RNA。cDNA合成條件：42℃反應30 min，99℃反應5 min，5℃反應5 min。PCR反應條件：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)，循環(huán)結束后72℃延伸10 min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定產物。CREB上游引物：5′-ACCATGGAATCTGGAGCCGAGAAC-3′,下游引物5′-CTGTAGGAAGGCCTCCTTGAAAGA-3′(360 bp)；Bcl-2上游引物：5′-CATTTCCACGTCAACAGAATTG-3′，下游引物5′-AGCACAGGATTGGATATTCCAT-3′(505 bp)；β-actin上游引物：5′-CTTCTACAATGAGCTGCGTG-3′，下游引物5′-TCATGAGGTAGTCAGTCA-GG-3′(304 bp)。

1.5 觀察指標 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。MTT檢測細胞增殖：對數生長期細胞接種于96孔板(1×104/孔)，轉染方法同前，終體積100 μl。培養(yǎng)結束前4 h加入5 g/L MTT溶液，DMSO呈色，570 nm處測量樣品的A值。

1.6 統計學方法 應用 SPSS17.0統計軟件進行t檢驗及方差分析。

2 結 果

2.1 siRNA CREB對CAOV3細胞CREB mRNA及蛋白表達的影響 與空白對照組相比，陰性對照組(轉染無義RNA)的CREB mRNA及蛋白表達無明顯變化(P>0.05)，特異性siRNA CREB轉染72 h呈劑量依賴性抑制CREB mRNA及蛋白表達(P<0.05)，100 nmol/L抑制效率最高，100 nmol/L與150 nmol/L 組差異不顯著(P>0.05)，見圖1、圖2、表1。

2.2 siRNA CREB對bFGF處理的CAOV3細胞Bcl-2 mRNA及蛋白表達的影響 與對照組相比，bFGF可明顯提高Bcl-2 mRNA及蛋白表達(P<0.01)，bFGF+ siRNA CREB組可部分阻斷此作用，見圖3、圖4，表2。

2.3 鏡下的細胞形態(tài)改變 與對照組相比，bFGF明顯促進饑餓的CAOV3細胞存活，細胞生長狀態(tài)良好，互相銜接伸展。與bFGF組相比，bFGF+siRNA CREB組部分細胞變圓、皺縮，生長緩慢，見圖5。

1:空白對照組,2:陰性對照組,3～5：siRNA CREB 50 nmol/L,100 nmol/L,150 nmol/L組，M:DNA marker圖1 轉染siRNA CREB對 CAOV3細胞CREB mRNA表達的影響

1:空白對照組,2:陰性對照組,3～5：siRNA CREB 50,100,150 nmol/L組圖2 轉染siRNA CREB對 CAOV3細胞CREB蛋白表達的影響

組別mRNA蛋白空白對照組034±004048±002陰性對照組035±003047±003siRNACREB組 50nmol/L026±0021)033±0021) 100nmol/L020±0011)2)022±0031)2) 150nmol/L020±0031)2)021±0031)2)

與空白對照組比較：1)P<0.01;與siRNA CREB 50 nmol/L組比較:2)P<0.05

2.4 siRNA CREB對CAOV3細胞增殖的影響 MTT比色結果顯示，與對照組(0.52±0.04)相比,bFGF作用24 h明顯促進饑餓的CAOV3細胞增殖(0.73±0.03，P< 0.01)。與bFGF組相比，bFGF+siRNA CREB組增殖受限(0.62±0.02，P<0.01)。

表2 siRNA CREB對bFGF誘導的Bcl-2mRNA及蛋白表達的影響

與對照組比較：1)P<0.01;與bFGF組比較:2)P<0.01

M:DNA marker;1～3:對照組;bFGF組;bFGF+siRNA CREB 組圖3 siRNA CREB對 bFGF處理的CAOV3細胞Bcl-2 mRNA表達的影響

圖4 siRNA CREB對 bFGF處理的CAOV3細胞Bcl-2 蛋白表達的影響

圖5 轉染細胞形態(tài)的鏡下變化(400×)

3 討 論

多數腫瘤細胞均過度表達生長因子，通過與受體結合，激活 ERK、 PKB、 PKC等信號通路，在促進細胞增殖、阻止細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。卵巢腫瘤是女性最常見的婦科惡性腫瘤。多數卵巢癌組織過表達bFGF及其受體，并通過多條信號通路促進腫瘤細胞增殖。cAMP反應元件(CRE)是廣泛存在于真核生物基因啟動區(qū)的一段DNA序列。CREB可結合相關基因啟動區(qū)的CRE序列，促進基因的轉錄及表達，進而調節(jié)細胞增殖〔5,6〕。CREB也參與卵巢的內分泌活動，至少部分是卵泡刺激素和黃體生成素通過CAMP細胞內信號通路調節(jié)卵巢的功能,突變CREB可明顯抑制卵巢顆粒細胞生存〔7～9〕。研究表明Bcl-2基因的啟動子中也含有CRE序列。很多基因可通過CREB上調Bcl-2。Bcl-2常在卵巢癌中過表達，可能參與卵巢癌的發(fā)生與發(fā)展，?？蓪е履[瘤細胞對放化療的敏感性降低〔10,11〕。

本研究說明bFGF可能部分通過CREB調節(jié)人卵巢癌Bcl-2的表達，參與細胞的生存及增殖，與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅是癌基因的活化與抑癌基因的失活，還與凋亡相關基因的異常表達及生長因子過量表達有關。進一步明確bFGF及其下游具體的信號轉導通路,可能成為治療腫瘤等藥物作用的新靶點，如抑制CREB的磷酸化或過表達等〔12〕，對抑制腫瘤細胞增殖及轉移、治療疾病有重要意義。

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〔2015-06-29修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

遼寧省自然科學基金(2015020362)；遼寧省博士啟動基金(20101065)

葉麗平(1977-)，女，博士，副教授，碩士生導師，主要從事腫瘤信號通路研究。

R737.3

A

1005-9202(2017)02-0280-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.009