葉麗平 馬靜方 仇會(huì)會(huì)

(錦州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001)

RNA干擾cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白對(duì)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的人卵巢癌細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的影響

葉麗平 馬靜方 仇會(huì)會(huì)

(錦州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001)

目的 探討cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)是否介導(dǎo)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)誘導(dǎo)的人卵巢癌CAOV3細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)。方法 分為①空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組，siRNA CREB組。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染干擾序列72 h，RT-PCR、Western印跡檢測(cè)CREB表達(dá)并鑒定轉(zhuǎn)染最佳濃度。②對(duì)照組，bFGF組，bFGF+ siRNA組。轉(zhuǎn)染48 h后饑餓培養(yǎng)24 h。RT-PCR，Western印跡檢測(cè)Bcl-2表達(dá)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)改變，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖。結(jié)果 ①與兩對(duì)照組相比，siRNA CREB明顯抑制CREB mRNA及蛋白表達(dá)(P<0.01)，100 nmol/L抑制效果最佳。②與對(duì)照組相比，bFGF組明顯促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)，bFGF+ siRNA CREB組則部分抑制bFGF的作用(P<0.01)。結(jié)論 bFGF可能部分通過CREB調(diào)節(jié)人卵巢癌CAOV3細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)，參與細(xì)胞的生存及增殖調(diào)控。

RNA干擾；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白；Bcl-2；卵巢癌

卵巢癌的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細(xì)胞增殖失控、凋亡受抑制有關(guān)。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)可通過多種信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)屬于轉(zhuǎn)錄因子，受上游信號(hào)如生長(zhǎng)因子的激活可調(diào)節(jié)多種抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)〔1,2〕。研究表明卵巢癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞高表達(dá)bFGF受體及Bcl-2，可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔3,4〕。但目前關(guān)于bFGF是否參與調(diào)節(jié)卵巢癌表達(dá)Bcl-2表達(dá)，以及是否通過CREB調(diào)節(jié)Bcl-2的基因轉(zhuǎn)錄尚不清楚。本研究利用RNA干擾技術(shù)(RNAi)抑制卵巢癌CAOV3細(xì)胞CREB的基因表達(dá)，觀察其對(duì)bFGF誘導(dǎo)的Bcl-2表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響，以探討bFGF調(diào)控卵巢癌細(xì)胞增殖與凋亡的信號(hào)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢癌CAOV3細(xì)胞系購自武漢大學(xué)保藏中心。脂質(zhì)體2000、Trizol、MTT購自Invitrogen。CREB特異性siRNA，無義RNAi由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成。重組人bFGF購自北京雙鷺?biāo)帢I(yè)有限公司。兔抗人CREB、Bcl-2及β-actin購自北京博奧森北京博奧森生物技術(shù)有限公司，ECL試劑盒、MTT購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，RT-PCR試劑盒及引物購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 CAOV3細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。(1)分為：①空白對(duì)照組，②陰性對(duì)照組，③siRNA CREB組。待細(xì)胞融合至40%～50%，雙無培養(yǎng)基饑餓過夜，按脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑說明書分別轉(zhuǎn)染終濃度50、100、150 nmol/L的特異性siRNA CREB(5′-CAAAUGACAGUUCAAGCCCAGdTdT-3′)，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染無義RNA，空白對(duì)照組僅含脂質(zhì)體。轉(zhuǎn)染4 h后常規(guī)換液，72 h后檢測(cè)CREB表達(dá)，確定最佳干擾濃度。(2)分為：①對(duì)照組，②bFGF組，③ bFGF+ siRNA CREB組。①②組僅含脂質(zhì)體，③組轉(zhuǎn)染終濃度100 nmol/L的siRNA CREB，轉(zhuǎn)染方法同前。轉(zhuǎn)染48 h后更換含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，按組別分別加入終濃度為75 ng/L的bFGF，對(duì)照組加入等量的PBS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后檢測(cè)Bcl-2的表達(dá)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖。觀察干擾CREB對(duì)bFGF誘導(dǎo)的Bcl-2表達(dá)的影響。

1.3 RT-PCR檢測(cè)CREB、Bcl-2 mRNA表達(dá) Trizol法提取總RNA。cDNA合成條件：42℃反應(yīng)30 min，99℃反應(yīng)5 min，5℃反應(yīng)5 min。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10 min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定產(chǎn)物。CREB上游引物：5′-ACCATGGAATCTGGAGCCGAGAAC-3′,下游引物5′-CTGTAGGAAGGCCTCCTTGAAAGA-3′(360 bp)；Bcl-2上游引物：5′-CATTTCCACGTCAACAGAATTG-3′，下游引物5′-AGCACAGGATTGGATATTCCAT-3′(505 bp)；β-actin上游引物：5′-CTTCTACAATGAGCTGCGTG-3′，下游引物5′-TCATGAGGTAGTCAGTCA-GG-3′(304 bp)。

1.5 觀察指標(biāo) 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板(1×104/孔)，轉(zhuǎn)染方法同前，終體積100 μl。培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入5 g/L MTT溶液，DMSO呈色，570 nm處測(cè)量樣品的A值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 siRNA CREB對(duì)CAOV3細(xì)胞CREB mRNA及蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染無義RNA)的CREB mRNA及蛋白表達(dá)無明顯變化(P>0.05)，特異性siRNA CREB轉(zhuǎn)染72 h呈劑量依賴性抑制CREB mRNA及蛋白表達(dá)(P<0.05)，100 nmol/L抑制效率最高，100 nmol/L與150 nmol/L 組差異不顯著(P>0.05)，見圖1、圖2、表1。

2.2 siRNA CREB對(duì)bFGF處理的CAOV3細(xì)胞Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，bFGF可明顯提高Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)(P<0.01)，bFGF+ siRNA CREB組可部分阻斷此作用，見圖3、圖4，表2。

2.3 鏡下的細(xì)胞形態(tài)改變 與對(duì)照組相比，bFGF明顯促進(jìn)饑餓的CAOV3細(xì)胞存活，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，互相銜接伸展。與bFGF組相比，bFGF+siRNA CREB組部分細(xì)胞變圓、皺縮，生長(zhǎng)緩慢，見圖5。

1:空白對(duì)照組,2:陰性對(duì)照組,3～5：siRNA CREB 50 nmol/L,100 nmol/L,150 nmol/L組，M:DNA marker圖1 轉(zhuǎn)染siRNA CREB對(duì) CAOV3細(xì)胞CREB mRNA表達(dá)的影響

1:空白對(duì)照組,2:陰性對(duì)照組,3～5：siRNA CREB 50,100,150 nmol/L組圖2 轉(zhuǎn)染siRNA CREB對(duì) CAOV3細(xì)胞CREB蛋白表達(dá)的影響

組別mRNA蛋白空白對(duì)照組034±004048±002陰性對(duì)照組035±003047±003siRNACREB組 50nmol/L026±0021)033±0021) 100nmol/L020±0011)2)022±0031)2) 150nmol/L020±0031)2)021±0031)2)

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.01;與siRNA CREB 50 nmol/L組比較:2)P<0.05

2.4 siRNA CREB對(duì)CAOV3細(xì)胞增殖的影響 MTT比色結(jié)果顯示，與對(duì)照組(0.52±0.04)相比,bFGF作用24 h明顯促進(jìn)饑餓的CAOV3細(xì)胞增殖(0.73±0.03，P< 0.01)。與bFGF組相比，bFGF+siRNA CREB組增殖受限(0.62±0.02，P<0.01)。

表2 siRNA CREB對(duì)bFGF誘導(dǎo)的Bcl-2mRNA及蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較：1)P<0.01;與bFGF組比較:2)P<0.01

M:DNA marker;1～3:對(duì)照組;bFGF組;bFGF+siRNA CREB 組圖3 siRNA CREB對(duì) bFGF處理的CAOV3細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

圖4 siRNA CREB對(duì) bFGF處理的CAOV3細(xì)胞Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響

圖5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞形態(tài)的鏡下變化(400×)

3 討 論

多數(shù)腫瘤細(xì)胞均過度表達(dá)生長(zhǎng)因子，通過與受體結(jié)合，激活 ERK、 PKB、 PKC等信號(hào)通路，在促進(jìn)細(xì)胞增殖、阻止細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。卵巢腫瘤是女性最常見的婦科惡性腫瘤。多數(shù)卵巢癌組織過表達(dá)bFGF及其受體，并通過多條信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。cAMP反應(yīng)元件(CRE)是廣泛存在于真核生物基因啟動(dòng)區(qū)的一段DNA序列。CREB可結(jié)合相關(guān)基因啟動(dòng)區(qū)的CRE序列，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖〔5,6〕。CREB也參與卵巢的內(nèi)分泌活動(dòng)，至少部分是卵泡刺激素和黃體生成素通過CAMP細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路調(diào)節(jié)卵巢的功能,突變CREB可明顯抑制卵巢顆粒細(xì)胞生存〔7～9〕。研究表明Bcl-2基因的啟動(dòng)子中也含有CRE序列。很多基因可通過CREB上調(diào)Bcl-2。Bcl-2常在卵巢癌中過表達(dá)，可能參與卵巢癌的發(fā)生與發(fā)展，常可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性降低〔10,11〕。

本研究說明bFGF可能部分通過CREB調(diào)節(jié)人卵巢癌Bcl-2的表達(dá)，參與細(xì)胞的生存及增殖，與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅是癌基因的活化與抑癌基因的失活，還與凋亡相關(guān)基因的異常表達(dá)及生長(zhǎng)因子過量表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步明確bFGF及其下游具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,可能成為治療腫瘤等藥物作用的新靶點(diǎn)，如抑制CREB的磷酸化或過表達(dá)等〔12〕，對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移、治療疾病有重要意義。

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〔2015-06-29修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

遼寧省自然科學(xué)基金(2015020362)；遼寧省博士啟動(dòng)基金(20101065)

葉麗平(1977-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤信號(hào)通路研究。

R737.3

A

1005-9202(2017)02-0280-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.009