劉 娜 穆 華 梁傳棟 鄭吉敏

(河北省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 石家莊 050051)

去甲腎上腺素對(duì)人肝細(xì)胞系表達(dá)瘦素及瘦素受體的影響

劉 娜 穆 華 梁傳棟1鄭吉敏

(河北省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 石家莊 050051)

目的 探討交感神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素(NE)對(duì)體外培養(yǎng)人肝細(xì)胞系L02表達(dá)瘦素及瘦素受體的影響。方法 用不同濃度的NE作用于體外培養(yǎng)的人肝細(xì)胞系L02，分別于24、48及72 h收集細(xì)胞，Western印跡法檢測其表達(dá)瘦素及瘦素受體蛋白的影響；RT-PCR檢測NE對(duì)肝細(xì)胞系L02瘦素及瘦素受體mRNA的影響。結(jié)果 ①Western印跡結(jié)果顯示，1、10、100 μmol/L NE作用于L02 細(xì)胞24 h后，瘦素蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(1.02±0.08,2.24±0.09,2.35±0.12 vs 0.62±0.09,P<0.05)；瘦素受體蛋白表達(dá)亦明顯高于對(duì)照組(1.35±0.13,2.37±0.12,2.39±0.15 vs 0.85±0.13,P<0.05)。②RT-PCR檢測L02瘦素以及瘦素受體mRNA的表達(dá)情況，1、10、100 μmol/L NE作用于L02 24 h后，瘦素mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組(1.54±0.08,2.37±0.09,2.72±0.12 vs 1.00±0.07,P<0.05);瘦素受體mRNA表達(dá)亦明顯高于對(duì)照組(1.61±0.08,2.27±0.10,3.39±0.11 vs 1.00±0.06,P<0.01)。結(jié)論 交感神經(jīng)遞質(zhì)NE對(duì)體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞系瘦素以及瘦素受體的表達(dá)均有促進(jìn)作用，從而參與了肝纖維化進(jìn)程。

肝細(xì)胞；肝纖維化；去甲腎上腺素；瘦素；可溶性瘦素受體

瘦素參與了肝纖維化進(jìn)程〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)在非酒精性脂肪肝患者中血清瘦素水平增高,瘦素可以促進(jìn)肝星狀細(xì)胞(HSC)增殖,并抑制HSC細(xì)胞凋亡〔2〕。交感神經(jīng)系統(tǒng)也參與了肝纖維化的進(jìn)程，交感神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素(NE)能增加HSC數(shù)目,并使其活化〔3〕,但對(duì)肝細(xì)胞的影響鮮有報(bào)道。本文旨在探討NE對(duì)體外培養(yǎng)人肝細(xì)胞系L02表達(dá)瘦素及其受體的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及實(shí)驗(yàn)儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，β-actin 兔抗人單抗購自北京博奧森公司，兔抗人瘦素抗體、兔抗人瘦素受體抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系、SYBR Green Real Master Mix、TRIzol試劑盒購自中國北京天根公司；PCR 擴(kuò)增用引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。NE購自美國Sigma公司；人肝細(xì)胞系L02購自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，其他試劑為分析純。主要儀器有超凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱(Precision Co,美國)，倒置相差顯微鏡(Olympus,日本)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將冷凍保存的人肝細(xì)胞系L02復(fù)蘇后接種于含10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和4 mmol/ml谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞分為以下四組：①空白對(duì)照組，為單純L02培養(yǎng)；②低濃度NE組(1 μmol/L)；③中濃度NE組(10 μmol/L)；④高濃度NE組(100 μmol/L)。

1.3 Western印跡檢測瘦素以及瘦素受體蛋白的變化 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，加1、10、100 μmol/L NE繼續(xù)培養(yǎng)24、48及72 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，考馬斯亮藍(lán)比色法測定蛋白含量。以8%的SDS-PAGE凝膠作為分離膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別以兔抗人痩素抗體、兔抗人痩素受體抗體(1∶200)和兔抗人β-actin多克隆抗體(1∶200)作為第一抗體反應(yīng)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)作為第二抗體反應(yīng)。采用電化學(xué)發(fā)光(ECL)劑，進(jìn)一步顯影、定影，結(jié)果以目的蛋白與β-actin的積分光密度值的比值表示。密度掃描分析采用美國Kodak公司ID數(shù)碼成像分析系統(tǒng)軟件對(duì)Western印跡結(jié)果進(jìn)行定量分析，灰度值以積分光密度值(IOD)表示。

1.4 RT-PCR檢測NE對(duì)LQZ表達(dá)瘦素及瘦素受體的影響 (1)采用TRIzol試劑盒，提取L02總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；瘦素、瘦素受體及內(nèi)參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物參照Genebank基因序列自行設(shè)計(jì)，由北京賽百盛基因有限公司合成。引物設(shè)計(jì)與合成如下：瘦素(正義：5'-CAATGACATTTCACACACGCAG-3'，反義：5'-AGATGGAGGAGGTCTCGCAG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為204 bp)。瘦素受體(正義：5'-GTGTCCTTCCTGACTCCGTAG-3'，反義：5'-GTTATTCTCTGGAAAGACTGGCT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為119 bp)。GAPDH(正義：5'TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA 3'，反義：5' AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT 3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為259 bp)。(2)在PE5700實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增。SYBR反應(yīng)體系25 μl。反應(yīng)條件：93℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；93℃ 45 s，55℃ 1 min，10個(gè)循環(huán)；93℃ 30 s，55℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自帶軟件進(jìn)行分析，獲得產(chǎn)物的Ct值。采用相對(duì)定量2-△△Ct法比較瘦素、瘦素受體基因在各組中的表達(dá)差異。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS12.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 NE對(duì)L02細(xì)胞作用后的瘦素及瘦素受體蛋白表達(dá)的影響 如圖1所示，分別在大約16 kD、5.1 kD位置出現(xiàn)瘦素、瘦素受體特異性條帶，在43 kD位置可見β-actin條帶。結(jié)果證實(shí)，1、10、100 μmol/L NE作用于L02細(xì)胞24 h后，瘦素蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(1.02±0.08,2.24±0.09,2.35±0.12 vs 0.62±0.09,F=519.348，P<0.05)；瘦素受體蛋白表達(dá)亦明顯高于對(duì)照組(1.35±0.13,2.37±0.12,2.39±0.15 vs 0.85±0.13,F=217.285，P<0.05)；見圖1。

1～4：對(duì)照組，1、10、100 μmol/L組圖1 Western印跡檢測NE作用于L02 細(xì)胞24 h 后表達(dá)瘦素及瘦素受體表達(dá)

2.2 NE對(duì)L02細(xì)胞作用后的瘦素及瘦素受體mRNA表達(dá)的影響 1、10、100 μmol/L NE作用于L02細(xì)胞24 h后，瘦素mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組(1.54±0.08,2.37±0.09,2.72±0.12 vs 1.00±0.07,F=1 241.751，P<0.05);瘦素受體mRNA表達(dá)亦明顯高于對(duì)照組(1.61±0.08,2.27±0.10,3.39±0.11 vs 1.00±0.06,F=751.254,P<0.01)。

3 討 論

瘦素是由肥胖基因所編碼的一種由167 個(gè)氨基酸組成的分泌型蛋白質(zhì)。瘦素作為一種肽類激素,其生物學(xué)效應(yīng)由瘦素受體介導(dǎo)，其中可溶性瘦素受體是主要的功能性受體。瘦素主要通過與可溶性瘦素受體結(jié)合發(fā)揮作用。近年來研究顯示瘦素與纖維化形成有關(guān)，瘦素在非酒精性脂肪肝、丙肝及肝硬化等慢性肝病中的作用已引起眾多學(xué)者的關(guān)注〔4〕。非酒精性脂肪肝患者血清中瘦素水平明顯增高，而瘦素是肝星狀細(xì)胞的強(qiáng)有力促有絲分裂因子,并抑制肝星狀細(xì)胞的細(xì)胞凋亡〔5,6〕。Oben等〔7〕通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)痩素缺陷性ob/ob大鼠形成肝損傷，如補(bǔ)充瘦素可使肝纖維化加重；但對(duì)于對(duì)照大鼠注射同樣劑量的瘦素卻意義不大，說明依賴瘦素且與損傷關(guān)聯(lián)的因素可參與肝纖維化的進(jìn)展。交感神經(jīng)系統(tǒng)參與了體內(nèi)各個(gè)系統(tǒng)的功能調(diào)節(jié)，肝臟也不例外。交感神經(jīng)遞質(zhì)NE也能增加肝星狀細(xì)胞數(shù)目，促進(jìn)纖維化的形成〔8,9〕。表達(dá)低兒茶酚胺水平或低交感活性的痩素缺陷性ob/ob小鼠經(jīng)研究顯示可以產(chǎn)生肝纖維化抵抗，當(dāng)給予動(dòng)物肝細(xì)胞毒性飲食，NE缺乏的大鼠纖維化形成過程減慢，當(dāng)給予補(bǔ)充促腎上腺素釋放物質(zhì)時(shí)，這種現(xiàn)象消失，認(rèn)為NE直接作用于肝臟，以調(diào)節(jié)并削弱瘦素對(duì)肝纖維化的促進(jìn)作用〔10〕。由此可見，瘦素的促進(jìn)纖維化的形成作用可能需要NE參與調(diào)節(jié)〔11〕。肝細(xì)胞作為肝臟的主要實(shí)質(zhì)細(xì)胞，瘦素對(duì)于肝細(xì)胞的作用是否需要NE的介導(dǎo)仍不明確。本研究提示NE確實(shí)介導(dǎo)了肝細(xì)胞瘦素以及瘦素受體的表達(dá)，從而參與了肝纖維化的過程。但是NE對(duì)于肝細(xì)胞的生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)作用仍不明確，關(guān)于瘦素和瘦素受體在肝纖維化形成過程中具體作用機(jī)制也需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，以期為臨床上肝纖維化/肝硬化的治療提供更加精確的理論依據(jù)。

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〔2015-08-12修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)

河北省衛(wèi)生廳課題(ZL20140250)

劉 娜(1979-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事肝纖維化的治療研究。

R575.2

A

1005-9202(2017)02-0276-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.007

1 河北省人民醫(yī)院神經(jīng)外二科