支翠菊，黃 瑛，祁煒罡，張代富

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microRNA在肥胖大鼠脂肪組織中的差異表達

支翠菊，黃 瑛，祁煒罡，張代富

目的 建立高脂飲食誘導的大鼠肥胖模型，初步探討肥胖大鼠脂肪細胞、體質量、體長、血糖、血脂的變化，為進一步研究microRNA在肥胖誘發(fā)脂類代謝紊亂的相關分子機制奠定基礎。方法 將40只雄性SD大鼠隨機分為普通飲食組和高脂飲食組，分別以基礎飼料和高脂飼料喂養(yǎng)，尾靜脈采血檢測造模前及4周、8周的血糖、血脂水平，8周時眼眶放血處死大鼠；用動物電子秤稱量大鼠體重；留取大鼠網(wǎng)膜脂肪組織，用皿式電子分析天平稱重，并將其保存在-80 ℃液氮中備用，油紅染色光學顯微鏡觀察脂肪組織形態(tài)，采用微距陣基因芯片技術篩選肥胖大鼠模型的網(wǎng)膜脂肪組織差異表達的microRNA，Real-Time PCR驗證結果。結果 建模8周末，高脂飲食組大鼠體重、網(wǎng)膜組織重量、三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白均高于普通飲食組(P<0.01)，高密度脂蛋白低于普通飲食組(P<0.01)。基因芯片檢測并經(jīng)Real-Time PCR驗證發(fā)現(xiàn)，高脂飲食組大鼠網(wǎng)膜組織中有13個差異表達的microRNA，其中microRNA30a、microRNA7e、microRNA30c、microRNA335、microRNA103、microRNA107、microRNA139-5p表達上調，microRNA494、microRNA140、microRNA342-5p、microRNA382、microRNA17-1-3p、microRNA92a表達下調。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，差異表達的microRNA調控的靶基因與細胞增殖、凋亡、糖代謝及調節(jié)脂肪細胞分化和脂類代謝生物學功能相關。結論 高脂誘導的肥胖模型大鼠網(wǎng)膜組織中microRNA表達譜發(fā)生明顯改變，提示microRNA能夠調節(jié)脂肪細胞分化和脂類代謝。

肥胖；microRNA；基因芯片；血糖；血脂

隨著全球經(jīng)濟的快速發(fā)展，肥胖已是全世界面臨的嚴峻問題，在發(fā)展中國家，超重及肥胖的發(fā)病率逐年上升。世界衛(wèi)生組織(WHO)明確認定肥胖是全球成年人面臨的最大慢性疾病，為世界四大醫(yī)學社會問題之一。中心性肥胖引起胰島素抵抗伴隨胰島細胞功能障礙，釋放胰島素減少，不能有效地控制血糖水平，進而加速了2型糖尿病的進程，尋找肥胖治療的新靶點顯得很重要[1]。microRNA是一類內源性產(chǎn)生的單鏈小分子RNA，能夠與目標microRNA轉錄的互補基因序列結合，進而通過轉錄抑制和MicroRNA干擾導致基因沉默，從而參與和調控了包括時序發(fā)育、細胞凋亡、脂肪代謝、神經(jīng)元發(fā)育、細胞分化、激素分泌等在內的多種生理過程以及多種疾病發(fā)生過程[2-3]。近年來，大量研究證明肥胖與某些特異的microRNA有關[4]。但是目前采用芯片來篩查肥胖大鼠脂肪組織中差異表達的microRNA的報道并不多見。本課題建立高脂飲食誘導的大鼠肥胖模型，通過microRNA芯片技術篩查肥胖大鼠網(wǎng)膜脂肪組織中差異表達的microRNA，尋找肥胖誘發(fā)脂類代謝紊亂相關的microRNA，從而了解調控脂肪細胞生長的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只健康雄性斷乳SD大鼠，6周～7周齡，體重220 g±25 g，斯萊克公司提供，許可證號：SCXK(滬)2012-0002。按體重隨機分為對照組(普通飼料喂養(yǎng))和模型組(高脂飼料喂養(yǎng))，SPF清潔級百級中分籠喂養(yǎng)，每籠3只～8只，飼料、飲水、墊料、籠具均經(jīng)消毒滅菌后使用，嚴格執(zhí)行清潔級實驗動物操作規(guī)程，12 h明暗循環(huán)，動物自由進食水。

1.2 飼料配方 采用合成飼料喂養(yǎng)大鼠，其中所含營養(yǎng)素和能量能保證大鼠生長發(fā)育的基本要求，在此基礎上調整脂肪和淀粉含量，配出高脂飼料。普通飼料由斯萊克公司提供，熱量比：蛋白質28%，脂肪12%，碳水化合物60%；高脂飼料由斯萊克公司提供：100 g高脂飼料包括基礎飼料55 g，豬油30 g，奶粉10 g，蛋黃粉5 g。熱量比：蛋白質20%，脂肪60%，碳水化合物20%。

1.3 方法

1.3.1 大鼠肥胖模型的建立 將40只雄性斷乳SD大鼠分為普通飲食組和高脂飲食組，分別以基礎飼料和高脂飼料喂養(yǎng)8周。每周稱重、測量體長1次，并觀察精神狀態(tài)、引水量、尿量、食欲、大便、毛發(fā)光亮度、皮毛、活動、眼睛等?？崭刮察o脈采血檢測造模前及4周、8周的血糖、血脂水平。造模評定標準：大鼠體重超過標準體重的20%即達到肥胖標準。8周后眼眶放血處死大鼠；用動物電子秤稱量大鼠體重；留取大鼠網(wǎng)膜脂肪組織，用皿式電子分析天平稱重，并將其保存在-80 ℃液氮中備用。

1.3.2 microRNA芯片檢測 microRNA芯片由國藥集團提供。用Trizol試劑(國藥集團)按照說明書提取大鼠網(wǎng)膜脂肪組織總RNA，用分光光度計測定RNA溶液在260 nm和280 nm下的吸光度值，檢測 RNA的濃度和純度。用1.5%的甲醛變性凝膠電泳(120 V)15 min，在凝膠成像儀下檢測總 RNA中 28 s和18 s的完整性。按說明書進行microRNA芯片雜交及芯片洗滌和掃描。高脂飲食組標準值與普通飲食組標準值相比高于2倍或低于0.5倍即認為存在顯著性上調或下調趨勢。

2 結 果

2.1 肥胖大鼠體重的變化 實驗前，普通飲食組和高脂飲食組大鼠體重差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。高脂飲食8周后，高脂飲食組大鼠體重較普通飲食組增加了43．80%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。詳見表1。

組別時間n體質量(g)體長(cm)普通飲食組0周19244.55±8.7318.94±1.734周19320.22±5.0523.17±1.388周19385.92±26.5225.68±1.31高脂飲食組0周18246.56±6.0218.72±1.454周18351.72±5.9925.06±1.088周18 473.25±48.501)28.89±1.90 與普通飲食組同時間比較,1)P<0.01。

2.2 油紅染色后光學顯微鏡觀察大鼠網(wǎng)膜脂肪組織細胞的比較 與普通飲食組大鼠相比，高脂飲食組大鼠網(wǎng)膜組織的脂肪細胞更大、更圓、更密集。詳見圖1。

圖1 油紅染色后光學顯微鏡觀察大鼠網(wǎng)膜脂肪組織細胞

2.3 肥胖大鼠網(wǎng)膜脂肪的變化 高脂飲食8周后，高脂飲食組大鼠網(wǎng)膜脂肪組織重量是普通飲食組的3倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。詳見表2。

表2 兩組大鼠網(wǎng)膜脂肪重量及其重量系數(shù)比較

2.4 兩組大鼠不同時期的血糖值比較 8周時，高脂飲食組大鼠血糖高于普通飲食組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。詳見表3。

mmol/L

2.5 兩組大鼠不同時期血脂指標比較 8周時，高脂飲食組大鼠三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)均高于普通飲食組，高密度脂蛋白(HDL)低于普通飲食組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。詳見表4。

mmol/L

2.6 大鼠網(wǎng)膜脂肪組織中差異表達的microRNA 通過microRNA芯片對468個microRNA分析，與普通飲食組相比，高脂飲食組大鼠差異表達的microRNA共有13個，其中上調7個，下調6個。詳見表5。

microRNA差異表達的microRNA高脂飲食組/正常飲食組上調的microRNA microRNA30a3.17±0.380.0392 microRNA7e2.68±0.240.0387 microRNA30c1.72±0.120.0382 microRNA3352.23±0.150.0368 microRNA1032.57±0.090.0182 microRNA1073.22±0.180.0164 microRNA139-5p4.54±0.670.0096下調的microRNA microRNA4940.76±0.110.0446 microRNA1400.67±0.060.0438 microRNA342-5p0.42±0.080.0273 microRNA3820.31±0.070.0244 microRNA17-1-3p0.58±0.040.0228 microRNA92a0.38±0.130.0184

3 討 論

目前世界上有11億人口超重或肥胖，研究證明肥胖與2型糖尿病、心血管疾病甚至惡性腫瘤有一定的相關性，肥胖已成為一個全球性的健康問題。肥胖的標志就是脂肪細胞體積的增大或細胞數(shù)目的增加，因此尋找肥胖的分子生物學機制對于治療或控制肥胖至關重要。研究表明非蛋白編碼的microRNA作為轉錄后調節(jié)基因參與脂肪細胞的形成過程[5]，在肥胖及與之相關的胰島素抵抗和2型糖尿病的病理生理過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。胰島素信號轉導缺陷是最常見的最早的導致個體發(fā)展為2型糖尿病的眾多缺陷之一，microRNA已經(jīng)被認定為是一類新的影響許多生物功能的調節(jié)分子，包括代謝過程[6-7]。然而，通過microRNA直接調節(jié)胰島素敏感性在體內還沒有被證實[8]。瑞士聯(lián)邦理工學院分子生理學者Markus Stoffel和他的同事們進行了基因表達分析，發(fā)現(xiàn)microRNA 103和107在患有脂肪肝病的老鼠和人類體內都上調表達，而脂肪肝病是胰島素抗性和糖尿病的先兆，microRNA導致胰島素抗性，Stoffel等使用一種病毒載體在健康老鼠體內表達這兩種microRNA，結果它們很快產(chǎn)生高血糖癥狀，通過喂食高脂肪食物變胖，并在這肥胖老鼠體內沉默這兩種microRNA的表達，結果都顯示這兩組老鼠肝細胞和脂肪細胞中葡萄糖代謝得到了改善[9-10]。 研究人員們隨后通過基因表達實驗確定出這兩種microRNA通過關閉脂肪細胞中小窩蛋白-1(caveolin 1)能穩(wěn)定胰島素受體的膜蛋白表達來降低胰島素敏感性[10]。

用高脂、高能量攝食誘導的肥胖動物模型符合人類發(fā)病過程，是研究人類肥胖的理想動物模型，目前暫無報道采用芯片來篩查肥胖大鼠脂肪組織中差異表達的microRNA。microRNA在許多疾病過程的研究雖然剛剛起步卻立即成為熱點，然而，還有許多問題亟待解決。microRNA越來越被認定可以作為一種新的調節(jié)分子從而影響多種生物學功能，但是并沒有很多的證據(jù)表明在肥胖及與之相關的胰島素敏感性甚至2型糖尿病、冠心病方面有直接的調節(jié)作用[11-13]。本研究旨在建立高脂飲食誘導的大鼠肥胖模型，觀察高脂飲食組與普通飲食組脂肪細胞的形態(tài)變化，對兩組大鼠體質量、體長、網(wǎng)膜脂肪重量及血脂水平進行比較，在飼養(yǎng)第8周兩組比較差異有統(tǒng)計學意義，通過microRNA芯片對468個microRNA分析，發(fā)現(xiàn)和普通飲食組相比，高脂飲食組大鼠差異表達的microRNA共有13個，其中上調7個，下調6個。本研究通過microarrayRNA印跡芯片技術篩查肥胖大鼠網(wǎng)膜脂肪組織中差異表達的microRNA，尋找肥胖誘發(fā)脂類代謝紊亂相關的microRNA，并通過Real-Time PCR驗證，最終找到目的基因；從而了解調控脂肪細胞的生長的機制，初步探討microRNA在肥胖大鼠中的作用，為進一步研究microRNA在誘發(fā)脂類代謝紊亂的相關分子機制奠定基礎。

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(本文編輯郭懷印)

浦東新區(qū)科技發(fā)展基金創(chuàng)新資金資助項目(No.PKJ2012-Y16)

上海浦東新區(qū)人民醫(yī)院(上海 021200)

張代富，E-mail：zhicuiju6@sina.com

R329

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.01.011

1672-1349(2017)01-0040-04

2016-04-05)

引用信息：支翠菊，黃瑛，祁煒罡，等.microRNA在肥胖大鼠脂肪組織中的差異表達[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2017，15(1)：40-43.