譚小兵，徐靜舒，孫貴虎，宋俊呈，戴青原△

(1.云南省第一人民醫(yī)院/昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院口腔內(nèi)科，昆明 650032；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，昆明 650032)

兩種重編程系統(tǒng)誘導(dǎo)人牙源性多潛能干細(xì)胞的對比研究*

譚小兵1，徐靜舒1，孫貴虎2，宋俊呈2，戴青原2△

(1.云南省第一人民醫(yī)院/昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院口腔內(nèi)科，昆明 650032；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，昆明 650032)

目的 對比研究兩種人牙源性多潛能干細(xì)胞重編程體系的特點。方法 分別利用STEMCCA慢病毒/飼養(yǎng)層和仙臺病毒/基質(zhì)膠兩種重編程系統(tǒng)，將人根尖乳頭干細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞，比較兩種方法的誘導(dǎo)效率、誘導(dǎo)工作量、iPS細(xì)胞非整倍體核型比例、外源性基因消除難易程度等情況。結(jié)果 STEMCCA重編程體系需要制備飼養(yǎng)層細(xì)胞MEF，重編程效率約為0.1%，后期經(jīng)Cre-Loxp酶切技術(shù)可得到無外源性轉(zhuǎn)錄基因的iPS細(xì)胞。仙臺病毒重編程體系為無飼養(yǎng)層培養(yǎng)，基質(zhì)膠制備方便、標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，重編程效率約為0.7%，明顯高于STEMCCA系統(tǒng)(P<0.05)，外源性病毒和轉(zhuǎn)錄基因經(jīng)自然傳代后逐漸消除。結(jié)論 與STEMCCA系統(tǒng)相比，仙臺病毒/基質(zhì)膠體系更適于人牙源性iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)。

多潛能干細(xì)胞；乳頭；干細(xì)胞；慢病毒屬；人誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞；根尖乳頭干細(xì)胞；重編程；仙臺病毒

自從2007年首次報道人多潛能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPS細(xì)胞)以來，人們已成功將多種終末分化體細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞[1-5]。iPS細(xì)胞能分化為所有三胚層細(xì)胞，在組織再生、疾病模型、個性化治療等方面具有巨大的應(yīng)用前景。由于誘導(dǎo)iPS細(xì)胞時會利用外源性轉(zhuǎn)錄因子和載體，有可能在宿主體內(nèi)形成腫瘤，成為制約iPS細(xì)胞應(yīng)用于組織再生的一個瓶頸。目前有多種方法可以用來誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞，也有學(xué)者使用非染色體結(jié)合性誘導(dǎo)方法以降低外源性轉(zhuǎn)錄基因插入宿主染色體而致瘤的風(fēng)險，包括質(zhì)粒、cre-loxp酶切除、蛋白轉(zhuǎn)運技術(shù)等[6-9]。飼養(yǎng)層的選擇也是iPS細(xì)胞必須考慮的一個安全性問題。本研究采用兩種重編程體系，即STEMCCA慢病毒+小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic firbroblasts，MEF)和仙臺病毒+基質(zhì)膠，將人根尖乳頭干細(xì)胞(stem cells from apical papilla，SCAP)誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞，從多方面比較兩種方法，為建立安全有效的iPS細(xì)胞及進(jìn)一步研究提供實驗數(shù)據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料 α-MEM培養(yǎng)基，DMEM培養(yǎng)基，DMEM-F12培養(yǎng)基，血清替代品，2.5 g/L胰蛋白酶，0.25 mmol/L 二乙胺四乙酸(EDTA)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)均購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；70 μm細(xì)胞過濾網(wǎng)、基質(zhì)膠(生長因子減少型)購自美國BD公司；總RNA提取試劑盒購自德國QIAGEN公司；c-DNA合成試劑盒、iTaq DNA聚合酶、dNTP混合物購自美國BIO-RAD公司；STEMCCA Lentivirus Reprogramming Kits試劑盒購自美國Millipore公司；Hela Monster transfection reagent試劑盒購自美國Mirus公司；CytoTune?-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit試劑盒購自美國Life公司，重編程培養(yǎng)基、PSC-easy培養(yǎng)基購自北京賽貝生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 人SCAP原代分離 收集云南省第一人民醫(yī)院口腔頜面外科因阻生需要拔除的下頜第三磨牙(<20歲)，按照Sonoyama等[10]方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2.2 MEF的制備 按照本課題組之前研究方法進(jìn)行制備[11]。

1.2.3 主要培養(yǎng)基組成 (1)MEF培養(yǎng)基：DMEM+10%胎牛血清+1%L-谷氨酰胺+1%青/鏈霉素+1%非必需氨基酸；(2)SCAP培養(yǎng)基：α-MEM+10%胎牛血清+1%L-谷氨酰胺+1%青/鏈霉素；(3)iPS培養(yǎng)基(用于H9和iPS細(xì)胞的培養(yǎng))：DMEM-F12+20%血清替代品+1%非必需氨基酸+1%L-谷氨酰胺+0.1 mmol/L β-巰基乙醇+4 ng/mL bFGF。

1.2.4 兩種重編程體系

1.2.4.1 方法1 STEMCCA慢病毒體系參照本課題組方法進(jìn)行[12]：轉(zhuǎn)染前一天人SCAP細(xì)胞鋪板，當(dāng)天細(xì)胞50%融合，加入適量STEMCCA慢病毒和聚凝胺(5 μg/mL)混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h后換為MEF培養(yǎng)液。第4天收集已轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到MEF覆蓋的培養(yǎng)板上。第2天換為iPS 培養(yǎng)基，隔日換液，兩周內(nèi)可觀察到小克隆出現(xiàn)?？寺〕墒鞎r，“十字法”分離克隆，轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)板內(nèi)(MEF覆蓋)繼續(xù)培養(yǎng)，每日換液。切除轉(zhuǎn)錄基因：挑選第2代克隆，轉(zhuǎn)移到抗嘌呤霉素MEF上培養(yǎng)。細(xì)胞60%融合時，將培養(yǎng)液換為加有2.5 μg pHAGE2-Cre-IRES-PuroR質(zhì)粒DNA，7.5 μL Trans IT Hela試劑，5.0 μL MONSTER試劑的iPS培養(yǎng)基，24 h后換為iPS培養(yǎng)基再處理6 h，接著用含有嘌呤霉素(1.2 μg/mL)iPS培養(yǎng)基處理細(xì)胞，48 h后再換為iPS培養(yǎng)基。所有克隆開始會慢慢死去，2～4 d后克隆重新出現(xiàn)，逐漸長大后“十字法”分離挑選，轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)板內(nèi)(MEF覆蓋)正常培養(yǎng)。提取細(xì)胞克隆的基因組DNA，PCR擴增目的片段、凝膠電泳，明確外源性hSTEMCCA是否已無表達(dá)。STEMCCA慢病毒重編程及切除過程見圖1。

1.2.4.2 方法2 仙臺病毒誘導(dǎo)體系：轉(zhuǎn)染前兩天，將第3代人SCAP鋪到6孔板內(nèi)(1×105/孔)，常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染當(dāng)天(第0天)，將適量SeV溶解到70 μL SCAP培養(yǎng)基內(nèi)開始轉(zhuǎn)染，1天后(第1天)再加入130 μL SCAP培養(yǎng)基，第2天換新鮮含SeV培養(yǎng)液繼續(xù)轉(zhuǎn)染。第3天將已轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)移到基質(zhì)膠覆蓋6孔板內(nèi)，重編程培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，3周左右可觀察到克隆出現(xiàn)?？寺〕墒鞎r，“十字法”分割克隆，轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)板內(nèi)(基質(zhì)膠覆蓋)，PSC-easy培養(yǎng)基(含10 μmol/L Y27632)繼續(xù)培養(yǎng)。提取第0、10及14代iPS克隆總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴增目的片段、凝膠電泳，明確外源性病毒序列和轉(zhuǎn)錄基因是否已消除。仙臺病毒重編程過程見圖2。

圖2 仙臺病毒重編程過程簡圖

1.2.5 兩種重編程系統(tǒng)的比較

1.2.5.1 iPS細(xì)胞克隆形態(tài) 觀察iPS克隆在不同體系底物上的生長情況(人胚胎干細(xì)胞H9為標(biāo)準(zhǔn)對照)。

1.2.5.2 重編程效率 確定精確的重編程效率非常復(fù)雜，出現(xiàn)克隆數(shù)占重編程體細(xì)胞數(shù)量的比例是一個重要參數(shù)。計算公式：重編程效率=克隆數(shù)/體細(xì)胞數(shù)量×100%，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5.3 重編程時間 包括準(zhǔn)備時間(培養(yǎng)基、飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備)，從目標(biāo)細(xì)胞鋪板到iPS克隆可以挑取所需時間。重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5.4 外源性基因消除 比較兩種方法得到的iPS細(xì)胞外源性重編程基因消除的時間和復(fù)雜程度。

2 結(jié) 果

2.1 兩種系統(tǒng)得到的重編程iPS克隆形態(tài) 兩種方法得到的iPS克隆在不同底物上狀態(tài)良好，具有典型的胚胎干細(xì)胞樣形態(tài)：圓形克隆，有清晰邊界線，克隆內(nèi)部細(xì)胞核大，有一個或幾個核仁，胞質(zhì)少，結(jié)構(gòu)簡單、排列致密整齊，見圖3。

A：hSCAP-iPS(P15，×100)；B：H9(P54，×100)生長于MEF；C：hSCAP-iPS(P15，×100)；D：H9(P54，×100)生長于基質(zhì)膠。

圖3 不同底物人SCAP-iPS細(xì)胞生長情況

2.2 兩種系統(tǒng)的重編程效率比較 人SCAP重編程前細(xì)胞數(shù)量大約為1×104，重編程后方法1得到10個克隆，重編程效率為0.1%；方法2共得到約70個克隆，重編程效率為0.7%，明顯高于方法1(P<0.05)，見圖4。

2.3 兩種系統(tǒng)的重編程時間比較 方法1準(zhǔn)備時間3.0h，MEF鋪板過夜12.0h，絲裂霉素處理時間2.0h，總計17.0h，重編程第28天克隆長大可以挑選擴增，同時后期酶切除、嘌呤霉素篩選等也增加了處理時間。方法2準(zhǔn)備時間3.5h，重編程第26天時克隆長大可以挑選擴增(P<0.05)，見圖5。

圖4 兩種方法重編程效率比較

圖5 兩種方法重編程時間比較

2.4 兩種系統(tǒng)的重編程效果比較 方法1得到的iPS克隆先用嘌呤霉素處理48h，此間所有克隆會慢慢消失，2～3d后重新出現(xiàn)的克隆為外源性基因可能已被切除的iPS克隆[4]。方法2得到的iPS克隆體外正常擴增培養(yǎng)數(shù)代后外源性基因及病毒序列即消除，RT-PCR結(jié)果也證實無外源性基因及病毒序列的表達(dá)，見圖6。

圖6 無病毒、無轉(zhuǎn)錄基因人SCAP-iPS細(xì)胞

3 討 論

提高重編程效率，減少外源性因素的影響，提高臨床安全性是目前iPS細(xì)胞領(lǐng)域的研究熱點，主要包括飼養(yǎng)層的選擇和誘導(dǎo)方法的改進(jìn)。自從iPS細(xì)胞產(chǎn)生以來，為了支持其能理想生長并長期維持未分化狀態(tài)，同時獲得安全性能高的iPS細(xì)胞，其培養(yǎng)條件經(jīng)歷了從飼養(yǎng)層細(xì)胞到無飼養(yǎng)層的演變，重編程方法也由結(jié)合性逐漸進(jìn)展到非結(jié)合性誘導(dǎo)[13-14]。

作為最早的飼養(yǎng)層細(xì)胞，MEF可分泌多種必需生長因子和胞外基質(zhì)等以支持iPS細(xì)胞的生長，但其分泌成分不明，MEF及其產(chǎn)物對iPS細(xì)胞可能是病原菌的來源[15]，影響iPS細(xì)胞的生長及安全性。STEMCCA重編程系統(tǒng)與目標(biāo)細(xì)胞DNA的結(jié)合最小化，可減少DNA插入突變和病毒再激活，后期利用Cre/LoxP將外源性轉(zhuǎn)錄基因切除，得到安全性更高的iPS細(xì)胞。本課題組[12]、Sommer等[16]成功利用STEMCCA重編程系統(tǒng)得到iPS細(xì)胞，但外源性轉(zhuǎn)錄基因切除后宿主DNA仍有部分殘留，臨床安全性能不足?；|(zhì)膠主要由層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、生長因子等組成，可以為iPS細(xì)胞生長提供理想支持，是目前最為常用的培養(yǎng)底物[13]。Seki等[17]、Soares等[18]的研究證實仙臺病毒重編程系統(tǒng)為RNA病毒，不會結(jié)合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)效率高，病毒及轉(zhuǎn)錄基因隨著iPS細(xì)胞的傳代擴增，易于從目標(biāo)細(xì)胞中消除，臨床安全性能高。

盡管已有多項研究證實STEMCCA/MEF系統(tǒng)與仙臺病毒/基質(zhì)膠系統(tǒng)均可誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞得到iPS細(xì)胞,但這兩種系統(tǒng)對人牙源性細(xì)胞的重編程效果未見報道。本研究利用這兩種重編程體系將人SCAP誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞,得到的iPS克隆均具有典型胚胎干細(xì)胞形態(tài)。STEMCCA重編程體系誘導(dǎo)時間較長，重編程效率低，后期還要切除外源性基因，操作繁瑣，不可控因素較多，難以統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。仙臺病毒重編程體系重編程效率高、時間短，外源性轉(zhuǎn)錄基因和病毒也易于去除，同時基質(zhì)膠制備方便、標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，易于操控。

綜上所述，與STEMCCA/MEF體系相比，仙臺病毒/基質(zhì)膠系統(tǒng)更適于誘導(dǎo)人SCAP重編程為iPS細(xì)胞，為后期iPS細(xì)胞用于牙髓再生和干細(xì)胞移植治療等提供可靠的重編程方法。

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A comparative study of two reprogramming systems for inducing pluripotent stem cells from human dental origin*

TanXiaobing1,XuJingshu1,SunGuihu2,SongJuncheng2,DaiQingyuan2△

(1.DepartmentofCariologyandEndodontics,YunnanProvincialFirstPeople′sHospital/AffiliatedHospitalofKunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming,Yunnan650032,China;2.DepartmentofCardiology,FirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunan650032,China)

Objective To comparatively study the features of two reprogramming systems of induced pluripotent stem cells(iPSCs) from human dental origin.Methods Two kinds of reprogramming system,i.e.STEMCCA lentivirus /feed layer and Sendai virus /matrigel were used to induce human stem cells from apical papilla(SCAP) into iPSCs,respectively.The induction efficiencies,workload of generating iPSCs,aneuploidy karyotype ratio,complexities of eliminating exogenous transcription factors and specific markers expression were compared between these two systems.Results The STEMCCA reprogramming system required to prepare the feeder cell MEF.The reprogramming efficiency was 0.1%.Transcription gene-free iPSCs cells were obtained by the Cre-loxp enzyme digestion technique at the later stage.Sendai virus reprogramming system was feeder-free and the preparation of matrigel was quite simple with unified standard.The reprogramming efficiency was 0.7%,which was much higher than that of STEMCCA system(P<0.05).The exogenous virus and transgenes could be gradually eliminated after several passages of natural subclone.Conclusion The Sendai virus/matrigle reprogramming system is much more applicable for the induction of iPSCs from dental origin than the STEMCCA system.

pluripotent stem cells；nipples；stem cells；lentivirus；human induced pluripotent stem cells;stem cells from apical papilla;reprogramming;sendai virus

?術(shù)與方法·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.01.021

國家自然科學(xué)基金資助項目(81360161)；云南省教育廳基金資助項目(2015Y153)。

譚小兵(1974-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事干細(xì)胞在牙髓再生方面研究?！?/p>

R781

A

1671-8348(2017)01-0091-03

2016-07-26

2016-09-27)