藍(lán)天云，范 紅，陳勇彬，楊翠萍，趙興旺，李 巖△

(1.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明 650032；2.云南省第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，昆明 650032；3.中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，昆明 650223)

金絲桃素抗乙型肝炎病毒作用及機(jī)制的體外研究*

藍(lán)天云1,2，范 紅1,2，陳勇彬3，楊翠萍3，趙興旺1，李 巖1,2△

(1.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明 650032；2.云南省第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，昆明 650032；3.中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，昆明 650223)

目的 從細(xì)胞水平評(píng)價(jià)金絲桃素(HY)的抗乙型肝炎作用，并初步探尋其藥物作用靶點(diǎn)。方法 選擇可分泌乙型肝炎病毒的肝細(xì)胞株HepG2.2.15為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，HY為HY組，拉米夫定(3TC)為3TC組，去離子水為空白對(duì)照組，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組給藥。給藥72h后，采用Southern印記雜交及熒光定量PCR檢測(cè)病毒HBV-DNA的復(fù)制水平；ELISA檢測(cè)HBV表面抗原(HBsAg)和HBVe抗原(HBeAg)的抑制率；采用Northernblot與熒光定量PCR檢測(cè)pgRNA的表達(dá)水平；Westernblot及熒光定量PCR檢測(cè)調(diào)控因子肝細(xì)胞核因子3(HNF3β)、肝細(xì)胞核因子4(HNF4α)、過(guò)氧化物酶體增殖激活受體/視黃受X受體(PPARα/RXRα)的表達(dá)水平。結(jié)果 與空白對(duì)照組相比，HY組與3TC組對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞中的HBVDNA及HBsAg、HBeAg的表達(dá)有明顯抑制作用(P<0.05)。與空白對(duì)照組相比，HY可顯著減少pgRNA的表達(dá)(P<0.05)，而3TC無(wú)明顯變化(P>0.05)。與空白對(duì)照組和3TC組相比，HY對(duì)調(diào)控因子HNF3β與HNF4α的表達(dá)有顯著影響(P<0.05)，但對(duì)PPARα和PXRα的表達(dá)無(wú)影響(P>0.05)。結(jié)論HY具有強(qiáng)效抗乙型肝炎病毒作用，且其可使負(fù)向調(diào)控因子HNF3β的表達(dá)升高并降低正向調(diào)控因子HNF4α的表達(dá)。提示其藥物作用靶點(diǎn)可能為pgRNA。

肝炎，乙型；肝炎病毒，乙型；金絲桃素；DNA，病毒；pgRNA；肝富集轉(zhuǎn)錄因子

乙型病毒性肝炎(簡(jiǎn)稱乙肝)是由乙型嗜肝DNA病毒(hepatitis B virus,HBV)引起的一種世界范圍內(nèi)的傳染性疾病，對(duì)人類健康危害重大[1]。目前，國(guó)際上應(yīng)用最廣泛的抗HBV藥物是核苷類化合物，代表藥物有拉米夫定(lamivudine,3TC)、替比夫定(sebivo)等[2]，其作用靶點(diǎn)為HBV DNA聚合酶/逆轉(zhuǎn)錄酶[3-4]。但長(zhǎng)期應(yīng)用核苷類藥物時(shí)，編碼HBV DNA聚合酶/逆轉(zhuǎn)錄酶的基因區(qū)域發(fā)生點(diǎn)突變使酶活性部位變化而產(chǎn)生病毒變異株和耐藥株[5]，從而使得抗病毒效果大為下降，因此，尋找新的抗病毒藥物靶點(diǎn)成為乙肝研究中的重點(diǎn)與熱點(diǎn)。HBV前體RNA(pregenomic RNA，pgRNA)是乙肝復(fù)制過(guò)程中的重要中間體，其表達(dá)量下調(diào)，不僅可以減少生成核衣殼的核心蛋白的表達(dá)，更能直接減少病毒逆轉(zhuǎn)錄生成新的HBV DNA[6]。因此，pgRNA是目前HBV復(fù)制過(guò)程中的關(guān)鍵點(diǎn)，也是目前抗HBV新靶點(diǎn)的研究熱點(diǎn)。

表1 熒光定量PCR引物

金絲桃素(hypericin，HY)是貫葉連翹等HY植物的主要活性成分之一。本課題組的前期研究顯示，HY具有強(qiáng)效抗HBV活性，但對(duì)HBV DNA聚合酶/逆轉(zhuǎn)錄酶無(wú)抑制作用，而可以明顯下調(diào)pgRNA表達(dá)水平，提示其藥物作用靶點(diǎn)可能與pgRNA相關(guān)[7]。pgRNA主要是通過(guò)肝富集轉(zhuǎn)錄因子(liver enriched transcription factor，LETFs)肝細(xì)胞核因子3(HNF3)，肝細(xì)胞核因子4(HNF4)，過(guò)氧化物酶體增殖激活受體/視黃素X受體(PPARα/RXRα)調(diào)控。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)HY抗HBV作用進(jìn)行驗(yàn)證，并在此基礎(chǔ)上對(duì)HY的可能靶點(diǎn)pgRNA及靶點(diǎn)相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)進(jìn)行了更加深入的研究。

1 材料與方法

1.1 材料 可分泌HBV活病毒的肝細(xì)胞株HepG2.2.15由武漢同濟(jì)醫(yī)院肝病研究所饋贈(zèng)HY(95%，HPLC)購(gòu)自Sigma公司；3TC由武漢同濟(jì)醫(yī)院肝病研究所饋贈(zèng)。高糖DMEM培養(yǎng)液及胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司；胰酶購(gòu)自碧云天公司；地高辛標(biāo)記及檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche；HBV表面抗原(hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)和HBV e抗原(hepatitis B virus e antigen，HBeAg)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上?？迫A生物工程公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBRGreen熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自Bio-rad公司；AxyPrep液體病毒DNA/RNA提取試劑盒及總RNA小量制備試劑盒；試驗(yàn)所用抗體一抗及二抗體均購(gòu)自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及化合物干預(yù) 將細(xì)胞以(1～2)×106接種于10 cm培養(yǎng)皿中，所有細(xì)胞均使用含有10%小牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞分為3組，分別為空白對(duì)照組、HY組及3TC組。去離子水加入空白對(duì)照組的細(xì)胞的培養(yǎng)基中；3TC以半數(shù)有效濃度1.0 μmol/L為終濃度加入3TC組細(xì)胞的培養(yǎng)基中；HY以半數(shù)有效濃度0.5 μmol/L為終濃度加入HY組細(xì)胞的培養(yǎng)基中，HY的配制與給藥均在弱光條件下進(jìn)行，給藥后，將HY置于4 000 W/m2光源下照射1 h后，放入37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h更換一次培養(yǎng)基，72 h后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.2 HBV DNA復(fù)制水平檢測(cè) 使用AxyPrep液體病毒DNA/RNA小量制備試劑盒提取HepG.2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)基中細(xì)胞分泌的HBV DNA，具體方法如下：取250 μL樣品，加入500 μL裂解液，振蕩混勻，靜置5 min后加入125 μL蛋白去除液，125 μL蛋白沉淀液，混勻后12 000×g離心5 min，轉(zhuǎn)移入制備管中，5 000×g離心1 min后，棄去濾液，加入700 μL洗滌液，6 000×g離心1 min，并重復(fù)洗滌1次，12 000×g離心1 min，用60 μL去離子水洗脫。取各組所提取的DNA樣品30 μg，使用Southern印記雜交(Southern blot)檢測(cè)HBV DNA的復(fù)制情況，尼龍膜轉(zhuǎn)印，紫外交聯(lián)，使用地高辛標(biāo)記試劑盒標(biāo)記的HBV DNA探針雜交過(guò)夜，化學(xué)發(fā)光顯影。取各組DNA樣品，使用染料法熒光定量PCR，檢測(cè)HBV DNA復(fù)制水平，引物列表見(jiàn)表1。使用Bio-rad熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)HBsAg和HBeAg的抑制率 吸取不同藥物處理后的各組細(xì)胞上清液，用ELISA 法測(cè)定細(xì)胞上清液中的HBsAg 和HBeAg抗原量，具體方法為：設(shè)置空白對(duì)照與陰性、陽(yáng)性對(duì)照組各兩孔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔加入相應(yīng)樣品50 μL，除空白對(duì)照孔外每孔加入酶結(jié)合物50 μL，加蓋封板膜，振蕩混勻，37 ℃反應(yīng)1 h后棄反應(yīng)液，50 μL洗液反復(fù)洗滌5次，加入顯色液，加封板膜振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min，顯色終止后在酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描。

1.2.4 總RNA的提取與目標(biāo)mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 收集HepG2.2.15各組細(xì)胞，使用 AxyPrep總RNA小量制備試劑盒提取所收集細(xì)胞中的總RNA，具體步驟如下。收集各組細(xì)胞，加入400 μL細(xì)胞裂解液，漩渦振蕩，加入150 μL裂解中和液，漩渦振蕩，12 000×g離心5 min，取上清液，加入250 μL異丙醇，混合均勻后轉(zhuǎn)移至制備管中，6 000×g離心1 min，棄濾液，加入500 μL洗滌液，12 000×g離心1 min，棄去濾液，加入500 μL去鹽液，12 000×g離心1 min，重復(fù)洗滌1次后1 200×g離心1 min，使用100 μL RNase-free水洗脫。取各組所提取的總RNA 10 μg，進(jìn)行Northern印記雜交(Northern blot)檢測(cè)pgRNA表達(dá)水平尼龍膜印跡，地高辛標(biāo)記試劑盒標(biāo)記的pgRNA探針雜交，化學(xué)發(fā)光顯影。取各組所提取的總RNA 1 μg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，使用染料法熒光定量PCR檢測(cè)pgRNA及各肝富集因子mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，引物列表見(jiàn)表1。

1.2.5 總蛋白提取及指標(biāo)檢測(cè) 將收集細(xì)胞使用RIPA Lysis Buffer[50 mmol/L Tris-HCl(pH7.4)+150 mmol/L NaCl+1%NP-40+PMSF]進(jìn)行重懸，冰上放置10 min后，將裝有細(xì)胞懸液的EP管放入液氮中反復(fù)凍融2～3次。4 ℃ 13 000 r/min離心20 min，取上清液。取各組所提取蛋白20 μg，Western blot檢測(cè)肝富集因子NF3β,HNF4α,PPARα/RXRα的表達(dá)水平，β-actin為內(nèi)參基因，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜印跡，所用抗體均購(gòu)自abcam公司，化學(xué)發(fā)光法顯影。

2 結(jié) 果

2.1HY對(duì)HBVDNA復(fù)制的影響HY作用可分泌活病毒的HepG2.2.15細(xì)胞后，對(duì)HBVDNA的Southernblot檢測(cè)表明，與空白對(duì)照組相比，HY組與3TC組HBVDNA的表達(dá)有明顯下調(diào))，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。熒光定量PCR的結(jié)果同樣表明了相同的結(jié)果，見(jiàn)圖1。

*：P<0.05，與空白對(duì)照組比較。A：Southernblot檢測(cè)HBVDNA表達(dá)；B：熒光定量法檢測(cè)HBVDNA表達(dá)。

圖1 藥物處理后各組HBVDNA的表達(dá)變化

2.2HY對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制率 實(shí)驗(yàn)同時(shí)用ELISA法檢測(cè)了各組HBsAg和HBeAg在藥物處理后的表達(dá)變化。3TC組、HY組與空白對(duì)照組相比，HBsAg和HBeAg的抑制率均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 HY對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制作用

a：P<0.01，b：P<0.05，與空白對(duì)照組比較。

2.3HY對(duì)pgRNA的表達(dá)水平的影響Northernblot結(jié)果顯示HY組與3TC組及空白對(duì)照組相比，HepG2.2.15 細(xì)胞株pgRNA下降明顯(P<0.05)，但3TC組及空白對(duì)照組相比，pgRNA差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。熒光定量PCR的結(jié)果顯示與Northernblot一致，見(jiàn)圖2。

*：P<0.05，與HY組比較。A：Northernblot檢測(cè)pgRNA表達(dá)；B：熒光定量法檢測(cè)pgRNA的表達(dá)。

圖2 給藥后各組pgRNA的表達(dá)變化

2.4HY對(duì)各肝富集因子的影響 研究分別從mRNA與蛋白質(zhì)水平初步探查了HY和調(diào)控pgRNA轉(zhuǎn)錄的幾個(gè)相關(guān)的肝富集轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平。HepG2.2.15細(xì)胞組的Westernblot結(jié)果與熒光定量PCR結(jié)果(圖3)相同，HY組與空白對(duì)照組相比，HepG2.2.15細(xì)胞株HNF3β的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，HNF4α表達(dá)降低(P<0.05)，而PPARα和RXRα的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但3TC組與空白對(duì)照組相比，4種調(diào)控因子均無(wú)明顯表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

*：P<0.05，與空白對(duì)照組比較。1：空白對(duì)照組；2：3TC組；3：HY組，β-catin為內(nèi)參。A:Westernblot檢測(cè)肝富集因子表達(dá)；B:熒光定量法檢測(cè)肝富集因子表達(dá)。

圖3 給藥后檢測(cè)各組肝富集因子表達(dá)變化

3 討 論

現(xiàn)有的抗HBV藥物中，主要以核苷類化合物為主，在臨床的應(yīng)用過(guò)程中，耐藥株與變異株的產(chǎn)生導(dǎo)致藥物療效明顯下降，所以尋找新的抗病毒藥物靶點(diǎn)成為乙肝研究中的重點(diǎn)與熱點(diǎn)。許多研究分別從HBV周期中的不同階段尋找HBV新靶點(diǎn)。Krepstakies等[13]發(fā)現(xiàn)人工合成的抗脂多肽端可以結(jié)合硫酸乙酰肝素以抑制HBV和HCV等包膜病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。Park等[14]發(fā)現(xiàn)shRNA可誘導(dǎo)HBVcccDNA甲基化，從而降低其轉(zhuǎn)錄活性。Cai等[15]發(fā)現(xiàn)了可抑制RCDNA轉(zhuǎn)化成cccDNA的磺胺類替代物CCC-0975和CCC-0346。有研究篩選對(duì)HBVDNA的復(fù)制有抑制作用的siRNA，這些siRNA可以作為未來(lái)基因治療的備選方案[16-17]。

在眾多新靶點(diǎn)研究中，pgRNA由于其在病毒復(fù)制中的多重角色與關(guān)鍵身份成為了研究的熱門。因?yàn)閜gRNA是乙肝復(fù)制過(guò)程中的重要中間體，其不僅是HBcAg與HBeAg的翻譯模板，同時(shí)也是HBVDNA的反轉(zhuǎn)錄模板[18-19]。因此，如果pgRNA表達(dá)量下調(diào)，勢(shì)必會(huì)抑制HBVDNA的復(fù)制。pgRNA長(zhǎng)3.5×103，由Cp啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄HBV基因組C開(kāi)放閱讀框生成，Cp啟動(dòng)子含有特異的DNA結(jié)合位點(diǎn)，蛋白質(zhì)調(diào)控因子結(jié)合特異性與之結(jié)合可以直接調(diào)節(jié)其活性[20]。這些蛋白質(zhì)調(diào)控因子主要有肝富集轉(zhuǎn)錄因子，如：HNF3β、HNF4α和PPARα/RXRα[21]?，F(xiàn)已有多篇文章報(bào)道了通過(guò)降低pgRNA的表達(dá)來(lái)抑制HBVDNA的表達(dá)：合成的Phenylpropenamide衍生物AT-130可以通過(guò)阻礙胞內(nèi)pgRNA的殼體化過(guò)程[22]。而另一研究發(fā)現(xiàn)的缺失一個(gè)DNA結(jié)合域的小異源二聚體(smallheterodimerpartner,SHP)與Yeo從中國(guó)臺(tái)灣杉芯材中分離出的木酚素化合物(helioxanthin)則是通過(guò)影響調(diào)控Cp啟動(dòng)子調(diào)控因子表達(dá)水平，降低Cp啟動(dòng)子的活性來(lái)抑制pgRNA的轉(zhuǎn)錄[20,23]。

有研究表明，HY有廣泛抗包膜病毒的作用，對(duì)鼠巨細(xì)胞病毒、艾滋病病毒、單純皰疹病毒以及鴨乙肝病毒均有較好的抑制作用[24]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HY對(duì)HepG2.2.15中的HBVDNA的復(fù)制有明顯抑制作用[7]。但其對(duì)核苷類藥物靶點(diǎn)HBVDNA聚合酶/逆轉(zhuǎn)錄酶無(wú)抑制作用，證明其作用機(jī)制與核苷類藥物不同[7]。此次研究結(jié)果表明，HY具有強(qiáng)效抗HBV活性，且可引起pgRNA的表達(dá)水平的降低；而3TC組，不影響pgRNA的表達(dá)，提示HY的藥物靶點(diǎn)可能與pgRNA相關(guān)。

pgRNA是HBs和HBe蛋白的翻譯模板，但眾多研究已經(jīng)證實(shí)，下游產(chǎn)物HBs和HBe對(duì)pgRNA的生成不具有調(diào)節(jié)作用[25]。因此pgRNA的表達(dá)由上游轉(zhuǎn)錄部分調(diào)控。肝富集調(diào)控因子HNF3β、HNF4α和PPARα/RXRα等蛋白調(diào)控因子可以與上游轉(zhuǎn)錄部分特定位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)控pgRNA的表達(dá)[19]。Tang等[26]在NIH3T3細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染HBVDNA與各肝富集因子表達(dá)質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，HNF3β對(duì)HBV的復(fù)制有抑制作用而HNF4α和PPARα/RXRα對(duì)HBV的復(fù)制起正向調(diào)控的作用[19,27]。本研究為了進(jìn)一步探究HY如何作用于pgRNA，實(shí)驗(yàn)在藥物干預(yù)后，檢測(cè)了HepG2.2.15細(xì)胞中的四種調(diào)控因子表達(dá)水平。結(jié)果顯示，HY在肝臟細(xì)胞中能使pgRNA表達(dá)下調(diào)的肝富集因子HNF3β蛋白表達(dá)水平升高，使pgRNA表達(dá)上調(diào)的HNF4α蛋白表達(dá)水平下降。而另外兩種調(diào)控因子PPARα/RXRα表達(dá)無(wú)變化。這說(shuō)明HY有可能作用于調(diào)控pgRNA轉(zhuǎn)錄的肝富集因子HNF3β、HNF4α，使其表達(dá)水平發(fā)生變化，從而使pgRNA的表達(dá)降低。

本研究對(duì)HY抗HBV的靶點(diǎn)進(jìn)行了初步的探尋，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其可能通過(guò)調(diào)控HNF3β與HNF4α的表達(dá)水平以抑制pgRNA的轉(zhuǎn)錄活性。下一步擬在非肝源細(xì)胞系中通過(guò)轉(zhuǎn)染各調(diào)控因子來(lái)研究HY抗病毒作用機(jī)理，對(duì)這些機(jī)理的深入研究不僅為HY對(duì)pgRNA的作用及抗病毒機(jī)制得到闡明，也為其將來(lái)的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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In vitro study on anti-HBV effects and mechanism of hypericin*

LanTianyun1,2,FanHong1,2,ChenYongbin3,YangCuiping3,ZhaoXingwang1,LiYan1,2△

(1.MedicalCollege,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming,Yunnan650032,China;2.DepartmentofGastroenterologyYunnanProvincialFirstPeople′sHospital,Kunming,Yunnan650032,China;3.KunmingInstituteofZoology,ChineseAcademyofSciences,Kunming,Yunnan650223,China)

Objective To evaluate the anti-HBV effect of hypericin from the cellular level and to preliminarily explore its potential drug target point.Methods Liver cell line HepG2.2.15 cells secreting HBV particles were selected as the experimental objects.Hypericin served as the HY group,lamivudine was taken as 3TC group and deionized water as the blank control group.The cells were grouped and administrated.The HBV-DNA copy level was measured at72 h after medication by Southern blot and fluorescent quantitative PCR;the inhibition rate of HBsAg and HBeAg was detected by using ELISA assay;the pgRNA expression level was tested by using Northern blot and fluorescent quantitative PCR;Western blot and fluorescent quantitative PCR were adopted to detect the expression of regulatory factors including HNF3β,HNF4α,PPARα and RXRα.Results Compared to the blank control group,both hypericin and lamivudine had significant inhibiting effect on HBV DNA and expression level of HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cells (P<0.05).Hypericin could significantly decrease the pgRNA expression compared with the blank control group (P<0.05),while lamivudine had no obvious change (P<0.05).Moreover,hypericin exhibited significant effects on the expression of HNF3β and regulatory factor HNF4α compared with the blank control group and 3TC group(P<0.05).Conclusion Hypericin represents a strong anti-HBV effect,moreover could increase the negative regulatory factor HNF3βn expression and decreases the positive factor HNF4α expression,prompting that its drug target point could be pgRNA.

hepatitis B；hepatitis B virus；hypericin；DNA,viral;pregenomic RNA;liver enriched transcription factor

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.01.007

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81300324)；云南省科技應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2011FZ282)。

藍(lán)天云(1990-)， 碩士，主要從事藥理學(xué)方面研究?！?/p>

E-mail：hepatocellular@sina.com。

R

A

1671-8348(2017)01-0040-04

2016-07-18

2016-09-12)