宋文玲，韓 蓉，張 曼，張 權(quán)，姚惟琦,3，武棟成,4

(1.湖北省武漢市黃陂區(qū)人民醫(yī)院暨江漢大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤三科 430060；2.武漢漢密頓生物科技股份有限公司研發(fā)部，武漢 430075；3.武漢大學(xué)第一臨床學(xué)院腫瘤中心，武漢 430060；4.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢 430072)

兩種培養(yǎng)基的培養(yǎng)體系對(duì)CIK細(xì)胞增殖和功能的影響

宋文玲1，韓 蓉1，張 曼1，張 權(quán)2，姚惟琦2,3，武棟成2,4

(1.湖北省武漢市黃陂區(qū)人民醫(yī)院暨江漢大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤三科 430060；2.武漢漢密頓生物科技股份有限公司研發(fā)部，武漢 430075；3.武漢大學(xué)第一臨床學(xué)院腫瘤中心，武漢 430060；4.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢 430072)

目的 觀察細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK細(xì)胞)增殖情況，檢測(cè)CIK細(xì)胞的表面分子表型和體外對(duì)白血病細(xì)胞K562的殺傷作用。方法 通過(guò)用H3培養(yǎng)基培養(yǎng)的分別來(lái)源于臍帶血和患者自體外周血分離的單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，添加重組人γ干擾素(IFN-γ)與CD3單抗，體外誘導(dǎo)CIK細(xì)胞，在培養(yǎng)的第7天分別加入H3培養(yǎng)基和T551培養(yǎng)基繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)至14 d。計(jì)數(shù)觀察CIK細(xì)胞增殖能力，流式檢測(cè)細(xì)胞表面CD3、CD56的表達(dá)情況，CCK8法檢測(cè)兩組培養(yǎng)基條件下對(duì)白血病細(xì)胞K562的殺傷效果。結(jié)果 動(dòng)態(tài)計(jì)數(shù)及表型分析結(jié)果表明，H3及H3+T551培養(yǎng)的CIK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)(包括臍帶血CIK總細(xì)胞數(shù)和自體CIK總細(xì)胞數(shù))在第14天均分別達(dá)到76.9倍、62.3倍；兩種培養(yǎng)條件下臍帶血CIK細(xì)胞中 CD3+CD56+雙陽(yáng)性細(xì)胞含量分別是(16.70±2.72)%和(10.80±2.59)%，自體CIK細(xì)胞中 CD3+CD56+雙陽(yáng)性細(xì)胞含量分別是(11.23±6.64)%和(10.70±6.42)%；體外殺瘤實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)效靶比為5∶1時(shí)，H3培養(yǎng)的臍帶血CIK細(xì)胞殺傷率達(dá)到(33.50±9.99)%，顯著高于H3+T551培養(yǎng)臍帶血CIK細(xì)胞的(20.3±6.76)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011),而H3和H3+T551培養(yǎng)的自體CIK細(xì)胞殺傷率分別是(59.67±27.59)%和(42.13±19.47)%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.080)。結(jié)論 H3培養(yǎng)的臍帶血和自體CIK細(xì)胞具有較強(qiáng)的體外抗白血病癌細(xì)胞活性，可應(yīng)用于臨床上白血病的過(guò)繼性免疫治療。

白血病，幼紅細(xì)胞，急性；CIK細(xì)胞；白血病細(xì)胞K562；H3培養(yǎng)基；T551培養(yǎng)基；殺傷率

體內(nèi)回輸免疫活性細(xì)胞的過(guò)繼免疫療法，具有一定的抗腫瘤效果，與其他抗腫瘤藥物相比，它能在沒有損傷機(jī)體免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)上，直接殺傷腫瘤細(xì)胞，并且調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，故而成為放化療、腫瘤手術(shù)的重要輔助治療方法，為預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)、改善晚期患者的生存質(zhì)量提供了新的途徑[1-2]。為了得到更好的抗腫瘤效果，用于過(guò)繼免疫療法的免疫活性細(xì)胞必須具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性和增殖力，研究結(jié)果顯示細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer cells，CIK 細(xì)胞)可以滿足過(guò)繼免疫治療中對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的要求[3-4]。CIK細(xì)胞是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，在體外用多種細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-1α、γ-干擾素(IFN-γ)、CD3單克隆抗體(anti-CD3 monoclonal antibody，MabCD3)等共同培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞，兼有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和自然殺傷(NK)細(xì)胞的非主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)限制性殺瘤優(yōu)點(diǎn)[5-7]，被認(rèn)為是新一代抗腫瘤過(guò)繼細(xì)胞免疫治療的首選方案[8]。

急性白血病是一種源于造血干細(xì)胞某一單株細(xì)胞的惡性克隆性疾病，以兒童及青年居多，臨床診斷一般可分為急性淋巴性白血病和急性髓性白血病。目前化療是急性白血病的常規(guī)治療方法，但是其較大的不良反應(yīng)限制了化療療效的進(jìn)一步提高。細(xì)胞免疫治療有可能為急性白血病的治療提供有益幫助[9-10]。由于CIK細(xì)胞的增殖能力和殺瘤活性是影響細(xì)胞治療效果的重要因素，因此本研究擬通過(guò)觀察不同成分培養(yǎng)基制備的CIK細(xì)胞的增殖能力和對(duì)白血病K562細(xì)胞株的殺傷力，為提高CIK細(xì)胞療效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 白血病細(xì)胞K562由武漢漢密頓生物科技股份有限公司實(shí)驗(yàn)室提供。將K562用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)，置于37 ℃含5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。試劑：IL-2(美國(guó)PEPR0 TECH公司)，IFN-γ(美國(guó)PEPR0 TECH公司)，MabCD3(日本TaKaRa公司)。RPMI 1640 和胎牛血清(FBS，Gibco公司)，CCK-8(5 mg/mL，碧云天)，F(xiàn)ITC-抗CD3流式抗體和PECy5-抗CD56流失抗體(美國(guó)Biolegend公司)。

1.2 方法

1.2.1 效應(yīng)細(xì)胞CIK細(xì)胞的制備 使用密度離心方法常規(guī)分離臍帶血和白血病患者外周血制備單核細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為(1～2)×106/mL進(jìn)行培養(yǎng)，于培養(yǎng)第1天在H3培養(yǎng)體系中加入IFN-γ 2 000 U/mL，培養(yǎng)24 h后加入IL-2 1 000 U/mL，MabCD3 100 ng/mL，刺激CIK 細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。在培養(yǎng)的第7天,組1加入H3(含1 000 U/mL 的重組人IL-2)培養(yǎng)基，組2加入T551(含1 000 U/mL 的重組人IL-2)培養(yǎng)基繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)至14 d，保證細(xì)胞生長(zhǎng)密度在(1～2)×106/mL。計(jì)數(shù)培養(yǎng)第0、4、7、10及14天的CIK細(xì)胞的數(shù)量。

1.2.2 效應(yīng)細(xì)胞的表型分析 取培養(yǎng)第14天的CIK細(xì)胞以流式抗體染色，流式細(xì)胞儀分析，測(cè)定CIK細(xì)胞CD3+CD56+雙陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。

1.2.3 CCK8法殺傷活性鑒定CIK對(duì)K562的殺傷作用 以不同效靶比(1∶1、2∶1、5∶1)將CIK效應(yīng)細(xì)胞與K562細(xì)胞各50 μL，一起放入96孔培養(yǎng)板中，另設(shè)單獨(dú)靶細(xì)胞和單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔,以及空白培養(yǎng)基對(duì)照孔，每組設(shè)3孔，37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)4 h，用CCK-8顯色法測(cè)定，確定各組吸光度值(A值)按下列公式計(jì)算殺瘤率[11-12]：殺傷活性(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)孔A值-效應(yīng)細(xì)胞A值)/(靶細(xì)胞A值-空白孔A值)]×100%

2 結(jié) 果

2.1 兩種培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)CIK細(xì)胞的增殖水平 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H3培養(yǎng)基培養(yǎng)的CIK細(xì)胞直至第4天后開始大量增殖，細(xì)胞數(shù)量呈非線形增長(zhǎng)。從臍帶血分離的細(xì)胞繼續(xù)經(jīng)H3培養(yǎng)基培養(yǎng)至第7、10、14天時(shí)，至培養(yǎng)第7天約增加23.3倍，其后進(jìn)入快速增長(zhǎng)期，至第14天約增加76.9倍；繼續(xù)經(jīng)T551培養(yǎng)基培養(yǎng)至第7天約增加23.3倍，其后進(jìn)入快速增長(zhǎng)期，至第14天約增加62.3倍。同時(shí)，從外周血分離單個(gè)核細(xì)胞繼續(xù)經(jīng)H3培養(yǎng)基培養(yǎng)至第7、10、14天時(shí)，培養(yǎng)至第7天約增加20.2倍，其后進(jìn)入快速增長(zhǎng)期，至第14天約增加76.9倍；繼續(xù)經(jīng)T551培養(yǎng)基培養(yǎng)至第7天約增加17.5倍，其后進(jìn)入快速增長(zhǎng)期，至第14天約增加62.3倍(圖1)。兩種培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞第14天的形態(tài)學(xué)照片如圖2所示。

圖1 兩種培養(yǎng)基誘導(dǎo)不同來(lái)源CIK細(xì)胞的增殖水平

A：來(lái)源臍帶血，H3培養(yǎng)基；B:來(lái)源臍帶血，H3+T551培養(yǎng)基；C:來(lái)源自體，H3培養(yǎng)基；D:來(lái)源自體，H3+T551培養(yǎng)基。

圖2 兩種培養(yǎng)基誘導(dǎo)不同來(lái)源的CIK細(xì)胞形態(tài)(×100)

2.2 兩種培養(yǎng)基誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞表型 隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，H3和T551培養(yǎng)基培養(yǎng)的CIK細(xì)胞表達(dá)CD3+CD56+雙陽(yáng)性細(xì)胞的比例逐漸增加，細(xì)胞培養(yǎng)至第14天時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。H3培養(yǎng)基誘導(dǎo)的臍帶血和自體CIK細(xì)胞中CD3+CD56+細(xì)胞百分比分別為(16.70±2.72)%和(11.23±6.64)%，T551培養(yǎng)基誘導(dǎo)的臍帶血和自體CIK細(xì)胞中CD3+CD56+細(xì)胞百分比分別為(10.80±2.59)%和(10.70±6.42)%，兩種培養(yǎng)基誘導(dǎo)第14天獲得的自體、臍帶血CIK細(xì)胞表型見表1、2。

2.3CIK細(xì)胞對(duì)K562的殺傷作用 當(dāng)效靶比為1∶1時(shí)，H3培養(yǎng)基培養(yǎng)14d的臍帶血和自體CIK細(xì)胞殺瘤率分別是(12.33±12.49)%和(19.43±12.65)%，T551培養(yǎng)基培養(yǎng)14d的臍帶血和自體CIK細(xì)胞殺瘤率分別是(6.20±8.59)%和(16.23±8.63)%；當(dāng)效靶比為2∶1時(shí)，H3培養(yǎng)基培養(yǎng)的臍帶血和自體CIK細(xì)胞殺瘤率分別是(19.97±16.68)%和(33.37±15.62)%，T551培養(yǎng)基培養(yǎng)14d的臍帶血和自體CIK細(xì)胞殺瘤率分別是(10.93±8.24)%和(25.38±10.99)%；當(dāng)效靶比為5∶1時(shí)，H3培養(yǎng)基培養(yǎng)的臍帶血和自體CIK細(xì)胞殺瘤率分別是(33.50±9.99)%和(59.67±27.59)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011)，H3+T551培養(yǎng)基培養(yǎng)14d的臍帶血和自體CIK細(xì)胞殺瘤率分別是(20.30±6.76)%和(42.13±19.47)%,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.080)。CIK細(xì)胞對(duì)白血病K562細(xì)胞的殺傷作用與濃度有關(guān)。相同濃度下作用24h，H3培養(yǎng)基培養(yǎng)的CIK細(xì)胞的殺傷效率優(yōu)于T551培養(yǎng)基培養(yǎng)的CIK細(xì)胞，見表3。

圖3 兩種培養(yǎng)基誘導(dǎo)第14天T細(xì)胞表面CD3+和CD56+的表達(dá)

臍血CIK活細(xì)胞數(shù)(109)CD3+CD56+CD3-CD56+效應(yīng)細(xì)胞數(shù)(109)N121.4019.80.94.43N218.7413.70.62.68H120.0314.73.43.63H217.3910.03.52.35M120.2515.60.33.22M219.988.70.31.80

N1、H1、M1和N2、H2、M2分別表示H3和T551培養(yǎng)基培養(yǎng)誘導(dǎo)第14天獲得的臍帶血CIK細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表2 兩種培養(yǎng)基誘導(dǎo)第14天獲得的自體CIK細(xì)胞表型

5a、6a、7a和5b、6b、7b分別表示H3和T551培養(yǎng)基培養(yǎng)誘導(dǎo)第14天獲得的自體CIK細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表3 CIK對(duì)K562的殺傷效率,%，n=3)

a:P<0.05，與H3+T551培養(yǎng)基培養(yǎng)。

3 討 論

免疫細(xì)胞過(guò)繼療法已成為放化療后腫瘤患者輔助治療的重要手段之一。CIK細(xì)胞是由人體血液中酶單個(gè)核細(xì)胞在體外條件下經(jīng)過(guò)多種細(xì)胞因子共同刺激誘導(dǎo)而成的[13-14]，是一類非主要組織相容性復(fù)合物和非T細(xì)胞受體限制性的免疫活性細(xì)胞，其主要效應(yīng)細(xì)胞為CD3+CD56+雙陽(yáng)性細(xì)胞[15]。

本研究顯示隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，H3和H3+T551培養(yǎng)基培養(yǎng)的CIK細(xì)胞的數(shù)量及CD3+CD56+雙陽(yáng)性細(xì)胞的比例均升高。H3培養(yǎng)基體外培養(yǎng)14 d的臍帶血和自體CIK細(xì)胞其細(xì)胞數(shù)量增加76.9倍，同時(shí)表達(dá)CD3+CD56+雙陽(yáng)性細(xì)胞的比例也達(dá)到較高水平，分別約為(16.70±2.72)%和(11.23±6.64)%；同時(shí)，H3+T551培養(yǎng)基體外培養(yǎng)14 d的CIK細(xì)胞其細(xì)胞數(shù)量增加62.3倍，同時(shí)表達(dá)CD3+CD56+雙陽(yáng)性細(xì)胞的比例也達(dá)到較高水平。

本研究對(duì)比了相同效靶比及相同培養(yǎng)方式下同種來(lái)源兩的CIK細(xì)胞對(duì)K562的殺傷效率。相同效靶比的來(lái)源于臍帶血或自體CIK細(xì)胞，H3培養(yǎng)條件下對(duì)K562的殺傷效率高于H3+T551培養(yǎng)條件下對(duì)K562的殺傷效率，顯示CIK細(xì)胞能有效地殺傷K562細(xì)胞。尤其，當(dāng)效靶比為5∶1時(shí)，H3培養(yǎng)基培養(yǎng)的臍帶血和自體CIK細(xì)胞殺瘤率分別是(33.50±9.99)%和(59.67±27.59)%，T551培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d的臍帶血和自體CIK細(xì)胞殺瘤率分別是(20.30±6.76)%和(42.13±19.47)%，但個(gè)體差異較大。來(lái)源臍帶血CIK細(xì)胞對(duì)K562具有較穩(wěn)定的殺傷作用，但來(lái)源自體的CIK細(xì)胞對(duì)K562具有較高的殺瘤率。結(jié)合圖2流式細(xì)胞分析可推測(cè)，H3和T551培養(yǎng)條件下，自體CIK在殺傷K562時(shí)伴隨NK細(xì)胞的殺傷作用，推測(cè)可能是H3和T551培養(yǎng)條件產(chǎn)生CIK細(xì)胞的同時(shí)，伴隨NK細(xì)胞產(chǎn)生，從而產(chǎn)生較高的殺瘤率。因此，臨床輸入CIK細(xì)胞治療腫瘤應(yīng)達(dá)到一定的數(shù)量并維持一定時(shí)間，根據(jù)患者個(gè)體差異，若瘤體內(nèi)CIK細(xì)胞數(shù)量與腫瘤細(xì)胞數(shù)量之比能維持在5∶1水平以上，有望達(dá)到較好的治療效果。故而H3培養(yǎng)的臍帶血和自體CIK細(xì)胞具有較強(qiáng)的體外抗白血病癌細(xì)胞活性，可應(yīng)用于臨床上白血病的過(guò)繼性免疫治療，并為臨床治療惡性腫瘤提供理論依據(jù)。

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Effects of two different cell culture medium on proliferative and functional activities of cytokine-induced killer cells

SongWenling1,HanRong1,ZhangMan1,ZhangQuan2,YaoWeiqi2,3,WuDongcheng2,4

(1.ThirdDepartmentofOncology,HuangpiDistrictPeople′sHospital/ThirdAffiliatedHospital,JianghanUniversity,Wuhan,Hubei430060,China;2.DepartmentofResearchandDevelopment,WuhanHamiltonBiotechnologyCo.,Ltd,Wuhan,Hubei430075,China;3.TumoprCenter,FirstClinicalCollegeofWuhanUniversity,WuhanUniversity,Wuhan,Hubei430060,China;4.SchoolofBasicMedicineSciences,WuhanUniversity,Wuhan,Hubei430072,China)

Objective To observe the proliferation ability of cytokine-induced killer(CIK) cells and to detect surface molecule phenotype of CIK cells and in vitro killing effect to leukemia K562 cells.Methods The cord blood lymphocytes and peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) from patients were cultured by the H3 medium and added with human recombinant interferon(IFN)-γ and CD3 monoclonal antibodies(mAb) for inducing CIK cells in vitro.The H3 medium and T551 medium were respectively added on 7 d of culture.The induction and culture were continued until 14 d.The CIK cells proliferation ability was observed by cell count and the expressions of CD3 and CD56 were detected by flow cytometry.The killing effect of CIK cells on leukemia cells was tested by CCK8 assays.Results The dynamic counting and phenotype analysis results revealed that the CIK cells amplification times(including cord blood CIK total cells and autologous CIK total cells) cultured by H3 and H3+T551 reached 76.9 times and 62.3 times on 14 d respectively;the CD3+CD56+double positive cells contents of cord blood CIK cells under the two kinds of culture condition were(16.7±2.7)% and(10.8±2.6)% respectively,while which of autologous CIK cells were(11.2±6.6)% and(10.7±6.4)% respectively;the in vitro killing-tumor test revealed that when the effector to-target ratio was 5:1,the cell cytotoxic activity of cord blood CIK cells cultured by H3 reached(33.50±9.99)%,which was significantly higher than(20.3±6.76)% of cord CIK cells cultured by H3+T551(P=0.011),while which of autologous CIK cells cultured by H3+T551 were(59.67±27.59)% and(42.13±19.47)% respectively,but the difference was not significant(P=0.080).Conclusion Cord blood and autologous CIK cells incubated by H3 have stronger in vitro anti-leukemia cells activity and can be used in the adoptive immunotherapy of leukemia in clinic.

leukemia,erythroblastic,acute;cytokine-induced killer cells;K562;H3 medium;T551 medium;inhibitory rates

宋文玲(1972)-，主治醫(yī)師，本科，主要從事惡性腫瘤的診斷與治療方面研究。

?術(shù)與方法·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.021

R733.7

A

1671-8348(2017)02-0215-03

2016-07-24

2016-09-29)