賈亞玲，何前松，馮 泳，閆文娟，陳麗麗，羅俊剛

(1.貴州省銅仁市萬山區(qū)人民醫(yī)院中醫(yī)科 554200；2.貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴陽 550002；3.貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴陽 550002)

論著·基礎(chǔ)研究

小半夏加茯苓醇提物對(duì)HepG2、BGC823線粒體凋亡途徑的影響*

賈亞玲1，何前松2，馮 泳3△，閆文娟3，陳麗麗3，羅俊剛1

(1.貴州省銅仁市萬山區(qū)人民醫(yī)院中醫(yī)科 554200；2.貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴陽 550002；3.貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴陽 550002)

目的 探討小半夏加茯苓醇提物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2和人胃腺癌細(xì)胞BGC823增殖抑制作用及線粒體凋亡途徑的影響。方法 運(yùn)用CCK-8法檢測(cè)HepG2、BGC823的增殖抑制情況，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率及半數(shù)抑制濃度；運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HepG2、BGC823的線粒體跨膜電位和bax、cjun基因的表達(dá)情況。結(jié)果 小半夏加茯苓醇提物對(duì)HepG2、BGC823均有顯著的抑制作用(P<0.01)，其半數(shù)抑制濃度分別為(781.50±13.00)μg/mL和(560.05±10.06)μg/mL；與空白對(duì)照組比，試驗(yàn)組HepG2的熒光強(qiáng)度升高(P<0.05)，試驗(yàn)組BGC823的熒光強(qiáng)度顯著升高(P<0.01)；HepG2、BGC823試驗(yàn)組的bax、cjun基因的相對(duì)表達(dá)量與空白對(duì)照組比較，均顯著升高(P<0.01)。結(jié)論 小半夏加茯苓醇提物誘導(dǎo)HepG2、BGC823凋亡的機(jī)制可能與激活線粒體途徑有關(guān)。

半夏屬；茯苓；肝腫瘤；胃腫瘤；小半夏加茯苓醇提物；肝癌細(xì)胞HepG2；胃腺癌細(xì)胞BGC823；線粒體凋亡途徑

腫瘤是在多因素協(xié)同作用下發(fā)生的一種細(xì)胞分化異常，呈過度生長(zhǎng)，并以遺傳性方式產(chǎn)生子代細(xì)胞的新生物。雖然腫瘤的傳統(tǒng)治療手段具有一定的臨床療效，但是腫瘤的耐藥性和高復(fù)發(fā)率及放化療的不良反應(yīng)仍是攻克腫瘤的重要障礙。因此，有學(xué)者提出中西醫(yī)聯(lián)合的腫瘤綜合治療方案。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，痰濕是腫瘤的致病因素之一。痰濕凝聚不除，久之阻礙氣血運(yùn)行而凝聚成塊，形成腫瘤。因此，化痰祛濕法為腫瘤治療的一種有效治法。小半夏加茯苓湯為中醫(yī)經(jīng)典燥濕化痰、降逆止嘔的名方，本試驗(yàn)結(jié)合現(xiàn)代分子生物檢測(cè)技術(shù)，探討該復(fù)方誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的線粒體機(jī)制，為臨床應(yīng)用該復(fù)方提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品及試劑 小半夏加茯苓醇提物，50%乙醇，DMEM高糖培養(yǎng)基，胎牛血清，胰蛋白酶，雙抗，磷酸鹽緩沖液，CCK-8，羅丹明123，TRNzol總RNA提取試劑，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，SYBRTMPremix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)ROX plus，DL2000 DNA標(biāo)記物、引物。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 CO2培養(yǎng)箱(美國熱電公司，USA31311)，超凈工作臺(tái)(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備，SW-CJ-2FD)，離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，L600)，顯微鏡(Nicon，TS-100F)，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(上海拜力生物科技公司，BIO-RAD)，水浴鍋(常州普天儀器制造有限公司金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠，LKTC-B1)，冰箱(上海上菱百富勤，BCD-219)，超低溫冰箱(Haier，DW-86L386)，酶標(biāo)儀(BioTek，EIx808IU)，流式細(xì)胞儀(BD，F(xiàn)ACSAria)，渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司，QL-902)，分光光度計(jì)(Therno scientific，NANODROP 2000)，熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，ABI7500)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小半夏加茯苓醇提物的制備 參考前期試驗(yàn)提取流程，取生半夏18 g，茯苓9 g，另將生姜切碎，稱取15 g，置于500 mL圓底燒瓶中，加入8倍量的50%乙醇于85 ℃水浴鍋中提取，溶劑沸騰開始計(jì)時(shí)，提取2 h，過濾；殘?jiān)偌尤?倍量50%乙醇，同條件提取，過濾，合并兩次濾液，搖勻，干燥，備用[1]。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞(HepG2)購自上海細(xì)胞庫，人胃腺癌細(xì)胞(BGC823)購自協(xié)和細(xì)胞庫，采用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)貼壁培養(yǎng)HepG2、BGC823于含CO2、37 ℃飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.2.3 腫瘤細(xì)胞增殖抑制檢測(cè) 根據(jù)有效濃度范圍，設(shè)置HepG2的用藥濃度分別為900、800、700、600、500 μg/mL，BGC823的用藥濃度分別為800、700、600、500、400 μg/mL；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按照7×104/mL的密度接種于96孔板中；待細(xì)胞貼壁后，將不同濃度的醇提物加入96孔板，每組設(shè)至少3個(gè)平行孔；藥物干預(yù)24 h后，加入CCK-8；孵育1～4 h后，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度(A)值，計(jì)算抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)。IC50用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算公式：生長(zhǎng)抑制率=(1-A試驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%。

1.2.4 腫瘤細(xì)胞線粒體跨膜電位檢測(cè) 將細(xì)胞分為空白對(duì)照組和試驗(yàn)組，根據(jù)IC50值設(shè)試驗(yàn)組為終濃度800 μg/mL的醇提物溶液，空白對(duì)照組加入與試驗(yàn)組等量的50%乙醇；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中；待細(xì)胞貼壁后，分別加入空白對(duì)照組和試驗(yàn)組的藥液；藥物干預(yù)24 h后，加入羅丹明123進(jìn)行染色，孵育10～30 min后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每份樣品檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量1×104,測(cè)定門控內(nèi)相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.2.5 腫瘤細(xì)胞bax、cjun基因表達(dá)檢測(cè) 將細(xì)胞分為空白對(duì)照組和試驗(yàn)組，根據(jù)IC50值設(shè)試驗(yàn)組為終濃度800 μg/mL的醇提物溶液，空白對(duì)照組加入與試驗(yàn)組等量的50%乙醇；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中；待細(xì)胞貼壁后，分別加入空白對(duì)照組和試驗(yàn)組的藥液；藥物干預(yù)48 h后，參照TRNzol總RNA提取試劑盒說明書和PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書提取腫瘤細(xì)胞RNA，并將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；參照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus),ROX plus說明書，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，45個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。

2 結(jié) 果

2.1 小半夏加茯苓醇提物對(duì)腫瘤細(xì)胞形態(tài)的影響 倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)飽滿，邊界清晰，細(xì)胞質(zhì)豐富，胞核呈圓形或橢圓形；小半夏加茯苓醇提物干預(yù)細(xì)胞后，形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞外形不規(guī)則，邊界模糊，并出現(xiàn)很多懸浮的圓形透亮細(xì)胞，見圖1、2。

表1 引物序列

A:空白對(duì)照組；B：試驗(yàn)組。

圖1 兩組人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞形態(tài)(×400)

A:空白對(duì)照組；B：試驗(yàn)組。

圖2 兩組人胃腺癌細(xì)胞BGC823細(xì)胞形態(tài)(×400)

2.2 小半夏加茯苓醇提物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率和IC50值 試驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的小半夏加茯苓醇提物對(duì)HepG2、BGC823均有顯著的抑制作用(P<0.01)；隨著醇提物濃度的減小，抑制率逐次降低(P<0.01)。小半夏加茯苓醇提物作用于HepG2、BGC823的IC50分別為(781.50±13.00)μg/mL和(560.05±10.06)μg/mL，兩種細(xì)胞的IC50差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2、圖3。

圖3 小半夏加茯苓醇提物對(duì)HepG2、BGC823的抑制作用表2 小半夏加茯苓醇提物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用±s)

醇提物濃度(μg/mL)抑制率(%)HepG2BGC823IC50(μg/mL)HepG2BGC82390068．79±3．09a781．50±13．00a560．05±10．0680050．78±0．33a71．86±0．9170032．54±0．72a57．66±1．2860025．42±1．10a50．81±0．9550017．31±0．91a44．12±0．4340035．31±0．93b

a：P<0.01，與BGC823比較。

表3 小半夏加茯苓醇提物對(duì)腫瘤細(xì)胞熒光強(qiáng)度、bax、cjun的影響±s)

a：P<0.05，與空白對(duì)照組比較。

2.3 小半夏加茯苓醇提物對(duì)腫瘤細(xì)胞線粒體跨膜電位的影響 結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，試驗(yàn)組HepG2的熒光強(qiáng)度升高(P<0.05)，試驗(yàn)組BGC823的熒光強(qiáng)度顯著升高(P<0.01),見表3。

2.4 小半夏加茯苓醇提物對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的影響 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，HepG2、BGC823試驗(yàn)組bax、cjun基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(P<0.01)，見表3。

3 討 論

目前大多數(shù)人認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生是細(xì)胞增殖失控和(或)凋亡受阻的結(jié)果。細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞程序性死亡，是指機(jī)體為了維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，而由基因控制的一種細(xì)胞自主性死亡。它既是機(jī)體組織和器官發(fā)育的維護(hù)者，又是機(jī)體防御致病因素危害作用的監(jiān)護(hù)者。近年來，隨著細(xì)胞和分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，人們?nèi)找嬲J(rèn)識(shí)到程序性細(xì)胞死亡可直接影響到腫瘤治療的有效性。線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑是細(xì)胞凋亡的主要途徑之一。凋亡信號(hào)可通過激活多條上游通路而作用于線粒體，線粒體將凋亡信息整合后，發(fā)生形態(tài)或功能的改變，導(dǎo)致線粒體膜間隙的促凋亡因子釋放，活化半胱天冬酶(Caspase)家族，促使細(xì)胞進(jìn)入不可逆的凋亡程序之中。

本試驗(yàn)檢測(cè)的指標(biāo)包括線粒體跨膜電位(MMP)、bax和cjun基因。MMP是由線粒體的內(nèi)膜與外膜的特點(diǎn)決定，低通透性的內(nèi)膜依靠質(zhì)子泵將基質(zhì)中的質(zhì)子泵入外室，導(dǎo)致線粒體膜間隙呈現(xiàn)正電荷，基質(zhì)為負(fù)電荷，從而形成外正內(nèi)負(fù)的MMP；MMP降低甚至消失，引起線粒體的呼吸鏈發(fā)生斷裂，膜間隙的促凋亡因子釋放，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡過程?？梢哉f，MMP的降低是細(xì)胞凋亡的早期反應(yīng)。bax是Bcl-2基因家族中的促凋亡成員，它從線粒體中釋放后，會(huì)與高同源性的bak發(fā)生寡聚化而插入線粒體外膜，引起MMP降低，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡過程；bax/bak還可通過開放線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔使小分子物質(zhì)大量涌入線粒體內(nèi)，引起線粒體形態(tài)膨脹，甚至撐破外膜，導(dǎo)致促凋亡因子進(jìn)一步釋放[2-4]；同時(shí)bax還可以與Bcl-2結(jié)合，形成異源二聚體，抑制Bcl-2的抗凋亡作用[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)，凋亡早期存在線粒體從網(wǎng)管狀向點(diǎn)狀表型的轉(zhuǎn)換，并且bax基因的高表達(dá)可以加速這種轉(zhuǎn)換[6]。cjun屬于即早反應(yīng)基因，它能夠?qū)?xì)胞內(nèi)外的各種刺激和DNA損傷做出反應(yīng),且參與調(diào)控胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的生物作用[7]；cjun與cfos可形成異源二聚體jun-fos，又稱AP-1，AP-1作為轉(zhuǎn)錄激活因子，可以通過調(diào)控bax而引起線粒體膜通透性的改變，釋放線粒體膜間隙促凋亡因子，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]。

小半夏加茯苓湯源自《金匱要略痰飲咳嗽病脈證并治十二》，是一首化痰降逆、和胃止嘔的名方。該方以“病痰飲者，當(dāng)以溫藥和之”為制方原則，選用辛溫性燥之半夏為君，燥濕化痰，和胃降逆；配以辛溫之生姜為臣，既增強(qiáng)半夏之功，又制半夏之毒；茯苓淡滲利濕，寧心健脾，使水去脾健則痰飲無以由生，為佐使。三藥相合，標(biāo)本兼顧，燥濕降逆祛已生之痰，健脾祛濕杜生痰之源[9]?，F(xiàn)代研究表明，小半夏加茯苓湯及組成該復(fù)方的各單味藥均有抑制腫瘤增殖的作用[10-12]。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小半夏加茯苓醇提物有抑制HepG2、BGC823增殖，并激活線粒體凋亡途徑的作用，其機(jī)制可能為小半夏加茯苓醇提物增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞中cjun和bax基因的表達(dá)，使bax與bak發(fā)生寡聚化，導(dǎo)致MMP降低，激活線粒體途徑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。通過對(duì)比分析兩種腫瘤細(xì)胞的數(shù)據(jù)，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小半夏加茯苓醇提物對(duì)BGC823的抑制效應(yīng)高于HepG2，與該復(fù)方長(zhǎng)于調(diào)節(jié)胃腑升降功能相一致，其作用于BGC823的抑瘤機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1]葉俊,楊占南,何前松,等.HPLC法測(cè)定中藥復(fù)方小半夏加茯苓湯中的8種藥效成分[J].遼寧中醫(yī)雜志,2012,3(8):1595-1598.

[2]葉喬峰,朱金墻,王丹丹,等.中藥干預(yù)細(xì)胞凋亡線粒體通路研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2013,20(8):100-102.

[3]劉曉婷,王延讓,張明.線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J].環(huán)境與健康雜志,2013,30(2):182-185.

[4]金姝,王穎,張勇,等.腫瘤抗原-線粒體蛋白12對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].現(xiàn)代免疫學(xué),2011,31(4):268-274.

[5]Song W,Yang HB,Chen P,et al.Apoptosis of human gastric carcinoma SGC-7901 induce by deoxycholic acid via the mitochondrial-dependent pathway[J].Appl Biochem Biotechnol,2013,171(4):1061-1071.

[6]Frank S，Gaume B，Bergmann-Leitner ES，et al．The role of Dynamin-related protein 1,a mediator of mitochondrial fission,in apoptosis[J].Dev Cell,2001(1):515-525．

[7]姚明忠,趙偉康.Aβ誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡的機(jī)制及補(bǔ)腎方的調(diào)控作用[J].中國老年學(xué)雜志,2011,21(6):450-452.

[8]陳偉,陳寧.淺析c-JNK在細(xì)胞凋亡線粒體途徑中的作用機(jī)制及其運(yùn)動(dòng)性干預(yù)[J].南京體育學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2015,14(6):20-24.

[9]馮泳,何前松,時(shí)京珍,等.小半夏加茯苓湯的研究概況[J].江蘇中醫(yī)藥，2008,40(2):84-86.

[10]楊長(zhǎng)福,馮泳,何前松．小半夏加茯苓方含藥血清抑制HepG2細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡[J]．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(8):168-171．

[11]楊林森,何光志,何前松,等．小半夏加茯苓湯及其組分對(duì)H22荷瘤小鼠的抑瘤作用和脾臟caspase-3基因表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2014,29(3):868-871.

[12]韋佳,楊長(zhǎng)福,陳倩,等.小半夏加茯苓湯對(duì)H22荷瘤小鼠瘤體中顆粒酶B和穿孔素表達(dá)的影響[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2015,26(9):2086-2089.

Impacts of small Banxia plus fuling ethanol extract on mitochondrial apoptotic pathway of HepG2 and BGC823*

JiaYaling1,HeQiansong2,FengYong3△,YanWenjuan3,ChenLili3,LuoJungang1

(1.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,WanshanDistrictPeople′sHospital,Tongren,Guizhou554200,China;2.DepartmentofNeurology,SecondAffiliatedHospitalofGuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang,Guizhou550002,China;3.CollegeofPharmacy,GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang,Guizhou550002,China)

Objective To investigate the inhibition effect of small Banxia plus Fuling ethanol extract on proliferation of human liver cancer cells HepG2 and human gastric cancer cells BGC823 and its influence on mitochondrial apoptotic pathway.Methods CCK-8 was used to test the growth inhibition of HepG2 and BGC823.The growth inhibition rate and the half inhibitory concentration(IC50) of HepG2 and BGC823 were calculated;the flow cytometry and real-time fluorescence quantitative PCR were adopted to detect the mitochondrial transmembrane potential and the expression of cjun and bax genes of HepG2 and BGC823.Results HepG2 and BGC823 are significantly inhibited by small Banxia plus fuling ethanol extract (P<0.01),IC50was (781.50±13.00)μg/mL and (560.05±10.06)μg/mL respectively.Compared with the blank control group,the fluorescence intensity of HepG2 in the experimental group was increased (P<0.05),and which of BGC823 was increased more obviously(P<0.01)；compared with those of the blank control group,the bax and cjun genes relative expressions in experimental group of HepG2 and BGC823 were significantly increased (P<0.01).Conclusion The mechanism of small Banxia plus Fuling ethanol extract inducing HepG2 and BGC823 apoptosis may be related to activate the mitochondrial pathway.

pinellia;poria cocos;liver neoplasms;stomach neoplasms;small banxia plus fuling ethanol extract;human hepatocellular carcinoma cell HepG2;human gastric cancer cell BGC823;mitochondrial apoptosis pathway

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.03.003

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81160425/H2705)；貴陽中醫(yī)學(xué)院研究生教育創(chuàng)新項(xiàng)目(ZYY14034)。 作者簡(jiǎn)介：賈亞玲(1988-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事方劑配伍規(guī)律與作用機(jī)制方面研究。△

R289.5

A

1671-8348(2017)03-0296-03

2016-07-11

2016-09-26)