陳青，劉文娥，張婉妮，周意

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院1.感染科，2.婦產(chǎn)科，湖南長沙410007；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410007）

論著

盆炎丸對解脲支原體感染小鼠血清IL-2、IL-4表達(dá)的影響

陳青1，劉文娥2，張婉妮3，周意3

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院1.感染科，2.婦產(chǎn)科，湖南長沙410007；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410007）

目的研究盆炎丸對解脲支原體（UU）感染小鼠血清白細(xì)胞介素2（IL-2）、白細(xì)胞介素4（IL-4）表達(dá)的影響，探討盆炎丸防治UU感染的部分免疫學(xué)機制。方法選取SPF級8周齡BALB/c雌性小鼠40只，隨機分為空白組（8只）和造模組（32只），造模組造模成功后隨機分為中藥組、西藥組和模型組，分別予以盆炎丸、克拉霉素和等量生理鹽水灌胃，14 d后取小鼠陰道分泌物行UU培養(yǎng)，觀察小鼠血清IL-2、IL-4表達(dá)水平。結(jié)果西藥組小鼠全部轉(zhuǎn)陰，清除率100％，中藥組小鼠UU清除率為78％。①IL-2含量：西藥組IL-2值最高，其次是中藥組，模型組IL-2值最低。兩兩比較：與空白組比較，模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），中藥組和西藥組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；中藥組與西藥組比較，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。②IL-4含量：中藥組IL-4值最低，其次是西藥組，模型組IL-4值最高。兩兩比較，與空白組比較，模型組、中藥組、西藥組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與西藥組比較，中藥組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論盆炎丸可促使UU感染小鼠陰道分泌物UU培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰，可通過升高IL-2水平、降低IL-4水平，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

盆炎丸;解脲支原體；BALB/c小鼠；白細(xì)胞介素2（IL-2）；白細(xì)胞介素4（IL-4）

盆炎丸為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院自制藥，多用于治療女性生殖道感染性疾病，已在臨床應(yīng)用30余年，臨床療效確切。為進(jìn)一步探討盆炎丸對解脲支原體感染的防治作用，本研究通過復(fù)制BALB/c小鼠解脲支原體（UU）生殖器感染模型，觀察盆炎丸對UU感染BALB/C小鼠血清白細(xì)胞介素2（Interleukin 2，IL-2）、白細(xì)胞介素4（Interleukin 4，IL-4）表達(dá)的影響?，F(xiàn)將實驗結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物BALB/c雌性小鼠40只，8周齡，體重（20±2）g，SPF級。購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，許可證編號：HNSLKJ20113382。陰道分泌物支原體培養(yǎng)陰性，排除既往感染。（根據(jù)預(yù)實驗在造模過程中小鼠死亡率約為20％，實驗多備小鼠8只）。

1.1.2 實驗藥物盆炎丸：120 g/瓶，丸劑，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供，批號：（湘）衛(wèi)藥劑（97）05第021號。苯甲酸雌二醇注射液：4mg/ml，蘇州市蘇牧動物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：（2012）100862511?？死顾啬z囊：規(guī)格0.25g×6粒，江蘇方強制藥廠有限公司生產(chǎn)，批號：國藥準(zhǔn)字H20083367。

1.1.3 UU3型菌株由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院微生物室提供。

1.1.4 主要試劑UU液體培養(yǎng)基：2 ml/支，由珠海銀科生物工程有限公司生產(chǎn)。小鼠IL-2、IL-4 ELISA試劑盒：由上海晶天生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.5 主要儀器37℃恒溫箱、HB-100煮鍋、超凈工作臺、低溫冰箱、石蠟包埋機、石蠟切片機、生物組織攤片機、全封閉自動脫水機、電子分析天平、臺式高速離心機、移液器、光學(xué)顯微鏡、高清晰度彩色病理分析系統(tǒng)、燒杯、量桶、眼科剪、鑷子、組織剪、組織鉗、止血鉗等。

1.2 方法

1.2.1 UU感染液的制備及濃度測定UU感染液的制備：取臨床分離的UU菌液0.2 ml，加入2 ml UU培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液顏色由黃色變?yōu)榧t色，且上清液無混濁，表明UU生長良好，經(jīng)轉(zhuǎn)種2、3次后，使其處于對數(shù)生長期階段，其生理特征最為典型。濃度測定：將培養(yǎng)基分裝于24孔酶標(biāo)板的小孔中，每孔0.9 ml，在第1管加入被檢菌液0.1 ml，混勻后從中吸取0.1 ml加至第2孔中，如此順序作10倍遞增稀釋。將酶標(biāo)板密封后置于37℃恒溫箱中，培養(yǎng)24 h左右，以培養(yǎng)基顏色不再繼續(xù)改變?yōu)樽詈笈凶x結(jié)果，即以出現(xiàn)顏色變化的最高稀釋度為顏色改變單位，并按UU結(jié)果將UU菌液稀釋為105CCU/ml。

1.2.2 造模方法參考TAYLO和楊洪雁等[1-2]造模方法進(jìn)行造模。40只SPF級BALB/c小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，按隨機數(shù)字表法隨機分為兩組：空白組8只，UU感染組32只。UU感染組皮下注射0.5 mg雌二醇，1次/周，共4次。第2次皮下注射雌激素后2 d開始陰道接種UU菌液。采用移液器和一次性槍頭，暴露小鼠陰道，伸入小鼠陰道約0.5 cm，將50μl UU菌液注入陰道，1次/d，連續(xù)3 d，第7天加強接種1次；空白組接種UU液體無菌培養(yǎng)基。倒置小鼠5 min，待菌液被完全吸收后，放回籠內(nèi)，分籠喂養(yǎng)。

1.2.3 造模確認(rèn)在造模第21天通過一般情況觀察、陰道分泌物UU培養(yǎng)、生殖器肉眼及鏡下觀確定造模是否成功，以喜蜷臥、食量少、毛發(fā)黃、豎毛、外陰紅腫、潰爛、陰道分泌物增多，陰道分泌物UU培養(yǎng)陽性，肉眼見宮頸肥大、陰道子宮充血水腫、輸卵管積水等，鏡下炎癥細(xì)胞浸潤、間質(zhì)疏松水腫、膿性滲出等為造模成功標(biāo)志。造模過程中2只小鼠死亡，根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)分析為UU急性感染所致。

1.2.4 分組與給藥造模成功后將UU感染組剩余小鼠隨機分成3組：中藥組、西藥組和模型組，每組9只。藥物組成按照當(dāng)歸、赤芍、丹參、三棱、莪術(shù)、桃仁、黨參、黃芪等藥按照一定比例制成。滅菌，裝無菌瓶中備用，每瓶100 g。將10 g盆炎丸研磨充分溶解于20 ml蒸餾水內(nèi)（2∶1），用三角杯裝好，置電爐上加熱至溶液煮沸滅菌，沸騰即可，塞上橡皮塞，置離心機中，以2 000 r/min的速度充分?jǐn)嚢?，去其雜質(zhì)。實驗前放入培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)溫，實驗后置冰箱保存。制備成混懸液，相當(dāng)于含生藥濃度為0.5 g/ml，根據(jù)需要再用蒸餾水稀釋或濃縮。參考黃繼漢等[3]文獻(xiàn)計算小鼠藥量，盆炎丸一般成人60 kg用量為3次/d，10 g/次，即人的用量為0.5 g/（kg·d），查換算系數(shù)為12.33，計算小鼠常用量為6.17 g/（kg·d），即0.12 g/（只·d），將藥物濃度配制成0.3 g/ml，每次灌胃0.2 ml?？死顾啬z囊一般成人60 kg用量為0.25 g/次，1次/12 h，人用量為8.33 mg/（kg·d），計算小鼠常用量為102.7 mg/（kg·d），即2 mg/（只·d），將藥物濃度配制成5 mg/ml，每次灌胃0.2 ml。空白組及模型組以無菌生理鹽水0.2 ml灌胃。于造模第22天開始給藥，每天分2次灌胃給藥，連續(xù)2周。

1.2.5 指標(biāo)檢測陰道分泌物UU培養(yǎng)：于造模第21和36天取小鼠陰道分泌物行UU培養(yǎng)。采用靜置移液槍槍頭于小鼠陰道內(nèi)1 min，輕輕旋轉(zhuǎn)蘸取陰道分泌物，然后將帶有分泌物的槍頭置于5 ml無菌試管的0.9 ml液體培養(yǎng)基中，充分混勻，蓋好橡皮塞，置于37℃恒溫箱中24～48 h，觀察顏色變化，培養(yǎng)基由黃色變?yōu)榧t色，表示有UU生長。測定小鼠IL-2、IL-4含量：取小鼠心臟血液、陰道分泌物1～2 ml，室溫下靜置20 min，以3 000 r/min的速度4℃離心20min，將上清液轉(zhuǎn)移至無菌試管中4℃冰箱內(nèi)保存待測。在檢測之前將樣品、所有試劑放至常溫，采用ELISA法測定小鼠IL-2、IL-4含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，當(dāng)資料滿足正態(tài)性和方差齊性時，多組組間比較用單因素方差分析（ANOVA），多重比較用LSD、Dunnett比較，組內(nèi)自身前后比較用配對t檢驗；滿足正態(tài)性但不滿足方差齊性時，采用Tamhane-ST法；當(dāng)資料不滿足正態(tài)性和方差齊性時，采用非參數(shù)檢驗Wilcoxon秩和檢驗。計數(shù)資料用χ2檢驗。當(dāng)P＜0.05時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 陰道UU轉(zhuǎn)陰率

空白組實驗前后UU陽性率均為0％，表明實驗室質(zhì)控條件良好，可排除實驗組間干擾。模型組、中藥組和西藥組3組轉(zhuǎn)陰率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000），說明3組的轉(zhuǎn)陰率不同。兩兩間進(jìn)行比較：與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P中藥組= 0.003，P西藥組=0.000），說明中藥組、西藥組與模型組轉(zhuǎn)陰率均升高；中藥組與西藥組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.471），說明兩組在轉(zhuǎn)陰率上無明顯差異。見表1。

2.2 小鼠血清IL-2含量及分析結(jié)果

各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗，空白組、模型組、中藥組和西藥組的P值分別是0.984、0.358、0.127和0.272，均服從正態(tài)分布。各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗，Levene統(tǒng)計量=1.199，P=0.328，滿足方差齊性。采用單因素方差分析，認(rèn)為4組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.170，P=0.328）。兩兩比較中空白組與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.645），中藥組與西藥組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而中藥組與西藥組小鼠的血清IL-2值均高于空白組；與模型組比較，中藥組和西藥組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003）；中藥組與西藥組比較，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.961）。見表2。

2.3 小鼠血清IL-4含量及分析結(jié)果

表1 各組UU轉(zhuǎn)陰率比較

表2 BALB/c小鼠血清IL-2含量（±s）

表2 BALB/c小鼠血清IL-2含量（±s）

IL-2含量空白組（n=8）30.54±2.88模型組（n=7）29.61±2.05中藥組（n=9）35.85±5.01西藥組（n=8）35.94±4.21組別

各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗，空白組、模型組、中藥組、西藥組的P值分別是0.112、0.443、0.334和0.258，均服從正態(tài)分布。各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗，Levene統(tǒng)計量=1.055，P=0.384，滿足方差齊性。采用單因素方差分析，認(rèn)為4組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.970，P=0.018）。兩兩比較中空白組比較，模型組、中藥組和西藥組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P= 0.053、0.179和0.762）；與模型組比較，中藥組和西藥組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002和0.028）；與西藥組比較，中藥組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.297）。見表3。

表3 BALB/c小鼠血IL-4含量（±s）

表3 BALB/c小鼠血IL-4含量（±s）

組別IL-4含量空白組167.75±54.67模型組221.56±51.23中藥組133.35±42.18西藥組159.89±57.28

3 討論

UU歸屬柔膜體綱支原體，是一類沒有細(xì)胞壁，大小介于細(xì)菌和病毒之間的原核細(xì)胞微生物，是泌尿生殖道常見的條件致病菌。UU能緊緊黏附于易感宿主細(xì)胞膜表面受體上，該黏附細(xì)胞的特性成為支原體的致病性條件。當(dāng)機體免疫力低下或黏膜受損時，支原體通過黏附于泌尿生殖道上皮細(xì)胞表面的受體上，引起細(xì)胞損傷，并出現(xiàn)上行性感染，導(dǎo)致非淋菌性尿路感染、尿路結(jié)石、前列腺炎、陰道宮頸感染及盆腔炎等多種疾病的產(chǎn)生，并與女性不孕、習(xí)慣性流產(chǎn)及胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩等有關(guān)[4-5]。隨著臨床上抗生素濫用及耐藥株的產(chǎn)生，其治療難度越來越大，而中醫(yī)藥治療不僅可提高臨床療效、縮短療程，還具有毒副反應(yīng)少、使用安全的特點，如何采取中醫(yī)藥診治UU感染并探討中醫(yī)藥治療機制已經(jīng)變得刻不容緩。

盆炎丸為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院自制藥，多用于治療女性生殖道感染性疾病，已在臨床應(yīng)用30余年，主要由黃芪、白術(shù)、紅藤、丹參及莪術(shù)組成。其中以黃芪為君，有益氣固表、利水消腫、托毒排膿的作用，現(xiàn)代研究表明黃芪能增強機體免疫功能，且有抗炎和較廣泛的抗菌作用[6]。白術(shù)為臣，能健脾益氣、燥濕利水，現(xiàn)代研究表明白術(shù)能增強機體免疫功能，有抗應(yīng)激、增強造血功能等作用[7]。丹參活血調(diào)經(jīng)，祛瘀止痛，涼血消癰，能擴張血管，改善微循環(huán)，促進(jìn)組織的修復(fù)與再生，對體外的多種細(xì)菌有抑制作用[8]；紅藤清熱解毒、活血通絡(luò)；莪術(shù)破血祛瘀，行氣止痛，共為佐藥，共奏行氣益氣、活血化瘀，清熱解毒之效。全方扶正祛邪，攻補兼施從而達(dá)到使機體氣血調(diào)暢，局部經(jīng)絡(luò)通順，邪去病愈的目的。在導(dǎo)師前期研究[9]中，盆炎丸治療支原體感染氣虛血瘀證在綜合療效總有效率方面盆炎丸與阿奇霉素相當(dāng)，但在中醫(yī)證候改善方面，盆炎丸療效明顯優(yōu)于阿奇霉素。談?wù)滂さ萚10]研究表明，盆炎丸治療耐阿奇霉素支原體感染總有效率與克拉霉素組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，認(rèn)為盆炎丸治療支原體感染的療效優(yōu)于克拉霉素，且盆炎丸不良反應(yīng)少，安全可靠，在臨床應(yīng)用方面有較大優(yōu)勢。盆炎丸作為該院內(nèi)部自制藥，對于治療解脲支原體感染療效可靠，值得臨床推廣應(yīng)用。

正常情況下，輔助性T淋巴細(xì)胞亞群Th1-Th2處于平衡狀態(tài)，Th1-Th2平衡失調(diào)并向Th1或Th2狀態(tài)轉(zhuǎn)化稱為Th1-Th2的漂移[11]。IL-2是Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，主要由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，能增強自然殺傷細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞的殺傷作用，其水平高低反映細(xì)胞免疫功能。IL-4是Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，主要由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生，能下調(diào)促炎因子的分泌，誘導(dǎo)人B細(xì)胞增殖、分化，促進(jìn)B細(xì)胞合成并分泌免疫蛋白介導(dǎo)體液免疫。

盆炎丸重在益氣化瘀，能夠提升人體正氣，增強機體免疫功能，本研究以盆炎丸為干預(yù)藥物，通過觀察盆炎丸對血清IL-2、IL-4表達(dá)水平的影響，探討盆炎丸治療UU感染的部分免疫機制。由于實驗樣本量有限，實驗過程中部分小鼠死亡，對實驗結(jié)果有一定影響。解脲支原體生存周期短，臨床分離菌株轉(zhuǎn)接時可能存在菌株部分死亡的現(xiàn)象，對實驗的進(jìn)展可能造成了一定的影響。本研究僅從IL-2、IL-4的關(guān)系出發(fā)，分析盆炎丸對Th1/Th2細(xì)胞平衡狀態(tài)的影響，對于其具體機制的闡明過于單薄，可以此為基礎(chǔ)，擴大樣本量及觀察指標(biāo)，進(jìn)一步從多個角度，多個環(huán)節(jié)進(jìn)行深入探討。

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（張西倩 編輯）

Effects of Penyan pills on expressions of serum IL-2 and IL-4 in mice infected byUreaplasma urealyticum

Qing Chen1,Wen-e Liu2,Wan-ni Zhang3,Yi Zhou3
(1.Department of Nosocomial Infection,2.Department of Gynaecology and Obstetrics,the First Affiliated Hospital,Hunan University of Traditional Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007, China;3.Hunan University of Traditional Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China)

ObjectiveTo observe the effect of Penyan pills on the expressions of IL-2 and IL-4 in mice infected byUreaplasma urealyticum(UU),and to discuss the immune mechanism of Penyan pills.MethodsForty 8-week old female BALB/c mice in SPF level were selected,and randomly divided into two groups:the blank group with 8 mice and the model-making group with 32 mice.The model-making group was subdivided into three groups randomly: the model group,the TCM group and the Western medicine group,which were perfused respectively with saline, Penyan pills and Clarithromycin.Mouse vaginal secretions were cultured for UU after 14 days,and the expression levels of IL-2 and IL-4 were observed.ResultsThe clearance rate of the Western medicine group was 100％,while the clearance rate of the TCM group was 78％.The content of IL-2 was the highest in the Western medicine group,then the TCM group,the lowest in the model group.The IL-2 content in the Western medicine group and the TCM group was significantly different from that in the blank group and the model group(P＜0.01),while there was no significant difference in the IL-2 content between the blank group and the model group or between the Western medicine group and the TCM group(P＞0.05).The content of IL-4 was the lowest in the TCM group,then the Western medicine group,the highest in the model group.The IL-4 content in the blank group was not significantly different from that in the model group,the Western medicine group or the TCM group(P＞0.05).The IL-4 content in the model group was significantly different from that in the TCM group(P＜0.01)and the Western medicine group (P＜0.05).But there was no significant difference in the IL-4 content between the Western medicine group and the TCM group(P＞0.05).ConclusionsPenyan pills could enhance the clearance of UU and play a role in immune regulation by increasing serum IL-2 level and decreasing IL-4 level in mice.

Penyan pill;Ureaplasma urealytium;BALB/c mouse;IL-2;IL-4

R-332

：A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.02.004

1005-8982（2017）02-0026-05

2016-03-23

劉文娥，E-mail：liuwene@163.com；Tel：13517872658