劉 鑫，王化麗，王悅陽，姜 盟

(1.遼寧省鞍山市婦兒醫(yī)院，遼寧 鞍山 114000；2.遼寧省大連市婦幼保健院，遼寧 大連 116000)

雌激素對子宮內膜異位癥患者在位子宮內膜間質細胞合成NGF及COX-2的影響及傳導通路研究

劉 鑫1，王化麗2，王悅陽2，姜 盟2

(1.遼寧省鞍山市婦兒醫(yī)院，遼寧 鞍山 114000；2.遼寧省大連市婦幼保健院，遼寧 大連 116000)

目的 觀察雌激素(E2)對子宮內膜異位癥(EMs)患者在位子宮內膜間質細胞(ESC)合成神經生長因子(NGF)及環(huán)氧化酶-2(COX-2)的影響，以及阻斷核因子-κB(NF-κB)信號通路后ESC合成NGF及COX-2的變化，探討雌激素導致EMs患者疼痛的可能信號傳導通路。方法 體外分離培養(yǎng)42例EMs患者在位ESC，用10-8mol/L E2(E2組)、25μmol/L NF-κB抑制劑 (PDTC)+10-8mol/L E2(E2+PDTC組)處理細胞24h后，采用Western blot及逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術分別檢測ESC合成NGF、COX-2蛋白及mRNA水平的變化。結果 E2組NGF、COX-2的蛋白及mRNA均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為4.745、6.317、3.465、5.443，均P<0.05)。E2+PDTC組 NGF、COX-2的蛋白及mRNA均低于E2組，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為3.675、5.319、7.132、8.514，均P<0.05)，但仍高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為3.526、4.733、4.261、5.513，均P<0.05)。結論 在體外，雌激素可促進EMs患者在位ESC中NGF、COX-2表達，PDTC可部分抑制這種作用，說明NF-κB通路參與了雌激素調節(jié)EMs在位ESC中NGF、COX-2表達調控，阻斷和調控NF-κB信號通路的活性可能為治療EMs提供新策略。

子宮內膜異位癥；17β-雌二醇；神經生長因子；環(huán)氧化酶-2；NF-κB信號通路

子宮內膜異位癥(endometriosis，EMs)是一種雌激素依賴性疾病，雌激素可以直接刺激異位內膜細胞增殖、促進新生的血管內皮細胞增生遷移及刺激多種細胞因子產生，共同參與EMs的發(fā)病過程。疼痛是EMs患者的主要臨床表現，神經支配、炎癥反應是EMs患者疼痛的可能機制[1]。EMs子宮內膜神經生長因子(nerve growth factor，NGF)及環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)的表達與神經纖維分布和疼痛的嚴重程度相關[2-3]。為進一步了解雌激素對EMs疼痛產生的作用，本研究通過體外實驗的方法，觀察雌激素對EMs患者在位子宮內膜間質細胞(endometrial stromal cells，ESC)合成NGF、COX-2的影響，以及阻斷核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路后ESC合成NGF、COX-2的變化，探討雌激素作用導致EMs疼痛的可能信號傳導通路，為EMs疼痛的治療提供新思路、新方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞來源

選取42例于2012年7月至2013年2月就診于大連市婦幼保健院因EMs行全子宮切除術患者為研究對象。該研究經倫理委員會通過，患者亦知情同意?；颊咂骄挲g為33.20±3.61歲。所有患者均于子宮內膜增殖期(月經7～14天)入院行開腹或腹腔鏡手術，排除子宮腺肌癥、盆腔炎、子宮肌瘤，術前3個月內未服用過激素類藥物。術中子宮離體后，立即留取部分子宮在位內膜組織，進行細胞培養(yǎng)，各例內膜細胞分別行分離培養(yǎng)。另取內膜組織送病理學檢查，排除內膜病變。收集4代以內的在位內膜間質細胞。

1.1.2主要試劑

17β-雌二醇、兔抗人NGF單克隆抗體和鼠抗人COX-2單克隆抗體(Abcam，英國)，NF-κB抑制劑(Ammonium pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)(Sigma，美國)，培養(yǎng)基RPMI-1640、胎牛血清、Ⅰ型膠原酶和胰蛋白酶(Gibco，美國)；人B-波形蛋白單克隆抗體(person B vimentin monoclonal antibodies，DAKO，丹麥)；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠、兔抗體(福建邁新公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒和ECL發(fā)光試劑盒(pierce chemieal，美國)；NGF、COX-2、GAPDH引物和RT-PCR技術檢測試劑盒(大連寶生物公司)。

1.2方法

1.2.1子宮內膜間質細胞的分離與純化

參照Osteen等和Mylonas等方法加以改良：去除血凝塊，將內膜剪碎至0.5～1mm3大小，D-Hanks液反復沖洗以去除紅細胞。加入0.1%Ⅱ型膠原酶，于37℃水浴箱中振搖15min，10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，分別經200目及400目的細胞篩網依次過濾，以1 000r/min離心5min，D-Hanks液沖洗2次，1 000r/min離心5min，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，制成間質細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液。

1.2.2子宮內膜間質細胞純度鑒定

分離、純化的子宮內膜間質細胞培養(yǎng)24h后，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌；4%多聚甲醛固定15min，PBS洗滌；加入封閉液，37℃ 20 min，加入鼠抗人波形蛋白抗體，37℃孵育2h；PBS洗滌；S-P法染色，用PBS代替第一抗體作陰性對照。

1.2.3子宮內膜間質細胞的傳代培養(yǎng)

待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%以上倒掉培養(yǎng)液，PBS清洗，加入0.1%Ⅱ型膠原酶，于37℃溫箱中消化，待基質細胞收縮變圓時，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，1 000r/min離心5min，棄上清，以含10%胎牛血清的培養(yǎng)液懸浮，按1:2或1:3的比例傳代。

1.2.4子宮內膜間質細胞體外處理

ESC培養(yǎng)體系建立后收集4代以內的細胞以5×105/mL的細胞密度接種于12孔培養(yǎng)板行體外藥物處理。生長狀態(tài)良好的細胞，將培養(yǎng)液更換為無血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h后，以減少血清對實驗的干擾，分組后進行藥物處理。對照組：無血清培養(yǎng)液；E2組：10-8mol/L E2+培養(yǎng)液；E2+PDTC組：細胞首先進行1h的25μmol/L PDTC預培養(yǎng)，然后再加入終濃度為10-8mol/L的E2。培養(yǎng)24h后收集細胞。每組設10個平行孔。

1.2.5 Western blot檢測

用PBS清洗培養(yǎng)的ESC后刮取收集的細胞，離心后，沉淀加入100μL 4℃預冷的細胞裂解液(10% 10×PBS、1% Triton X-100、5g/L脫氧膽酸鈉、1g/L SDS、0.5g/L aprotinin、1mmol/L苯磺酰氟、1mmol/L EDTA)，將細胞裂解 13 000r/min離心20min。取上清液由蛋白濃度檢測法(bicinchoninic acid，BCA)檢測蛋白濃度。取50μg蛋白樣品進行電泳、轉膜、封閉，加入兔抗人NGF(濃度1:100)和兔抗人COX-2(濃度1:100)單克隆抗體4℃過夜，洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，37℃孵育1 h，顯色，計算機掃描，應用圖像分析軟件檢測各條帶吸光度值。

1.2.6 RT-PCR檢測

Trizol試劑盒一步法提取ESC的總RNA，逆轉錄擴增cDNA。NGF上游引物：5′- CTTCAGCATTCCCTTGACACT - 3′，下游引物：5′-GCTCCTGTGAGTCCTGTTGAA- 3′，擴增片段240bp。COX- 2上游引物：5′- ACTCACTCAGTTTGT￣TGAGTCATTC-3′，下游引物：5′-TTTGATTAGTACTGT￣AGGGTTAATG -3′，擴增片段583bp。內參GAPDH上游引物：5′- AGAAGGCTGGGGCTCATTTG- 3′，下游引物5′-AGGG￣GCCATCCACAGTCTTC- 3′，擴增片段258bp。引物反應體系：RNase Free dH2O 28.75μL，5×PCR Buffer10μL。TaKaRa Ex Taq HS 0.25μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL。反應條件：94℃，預變性2min，94℃變性30s，57℃，退火30s，72℃，延伸30s，循環(huán)35次，72 ℃，最終延伸2min。擴增產物在瓊脂糖凝膠中電泳20～30min，用凝膠圖像分析儀攝片，并進行吸光度定量分析。

1.3統(tǒng)計學方法

2結果

2.1子宮內膜間質細胞培養(yǎng)及鑒定結果

倒置顯微鏡下觀察，新分離的ESC多成圓形，接種24h后大部分可貼壁，細胞呈多邊形或梭形，外形輪廓清楚，折光性強，細胞質薄，細胞核不明顯，細胞之間平行排列或放射狀排列，細胞之間較獨立。原代培養(yǎng)的ESC特異性標記分子骨架蛋白波形蛋白染色陽性，計數細胞波形蛋白染色陽性細胞數，細胞純度均可達90%～95%，見圖1。

圖1 ESC波形蛋白免疫組化法鑒定(×100)

Fig.1 ESC vimentin identified by immunohistochemistry (×100)

2.2各組子宮內膜間質細胞中NGF和COX-2 mRNA的表達

ESC在無血清培養(yǎng)的基礎狀態(tài)下，有NGF mRNA和COX-2 mRNA的表達；E2組ESC中NGF mRNA和COX-2mRNA的表達較對照組顯著增加(t值分別為3.465、5.443，均P<0.05)；加入NF-κB的抑制劑PDTC后，NGFmRNA和COX-2mRNA的表達較E2組明顯減少(t值分別為7.132、8.514，均P<0.05)，但仍高于對照組(t值分別為4.261、5.513，均P<0.05)，見表1和圖2。

組別 NGF COX?2 mRNA蛋白mRNA蛋白對照組1．01±0．112．01±0．121．64±0．250．98±0．13E2組2．36±0．306．41±0．363．98±0．123．80±0．21E2+PDTC組1．68±0．255．18±0．202．73±0．192．76±0．25t3．465?4．745?5．443?6．317?P0．006 0．005 0．005 0．003 t7．132??3．675??8．514??5．319??P0．001 0．002 0．004 0．002

注：*E2組與對照組比較；**E2+PDTC組與E2組比較。

M 1 2 3 4

M 1 2 3 4

圖2 RT-PCR測定ESC中NGF和COX-2mRNA的表達情況

Fig.2 Expressions of NGF and COX-2mRNA in ESC determined by RT-PCR

2.3各組子宮內膜間質細胞中NGF和COX-2蛋白的表達

ESC在無血清培養(yǎng)的基礎狀態(tài)下，有NGF和COX-2蛋白的表達；E2組ESC中NGF和COX-2蛋白的表達較對照組顯著增加(t值分別為4.745、6.317，均P<0.05)；加入NF-κB的抑制劑PDTC后，NGF和COX-2蛋白的表達較E2組明顯減少(t值分別為3.675、5.319，均P<0.05)，但仍高于對照組(t值分別為3.526、4.733，均P<0.05)，見表1和圖3。

圖3 Western blot測定ESC中NGF和COX-2蛋白的表達情況

Fig.3 Expressions of NGF and COX-2 in ESC determined by Western blot

3討論

3.1子宮內膜異位癥的概述

EMs是育齡期婦女常見的雌激素依賴性的慢性炎癥性疾病，疼痛是主要表現之一，嚴重影響患者的生活和工作質量。EMs患者和非EMs患者在位子宮內膜的分子及生物學特性存在差異，EMs發(fā)病取決于患者在位子宮內膜的特性，經血逆流只是實現這一由潛在到發(fā)病的橋梁，據此提出“在位內膜決定論”的新觀點。故本研究選擇EMs患者的在位子宮內膜為研究對象。

疼痛是傷害性刺激作用于機體引起的一種復雜的心理和生理過程，傷害性刺激、神經纖維末梢和神經介質是疼痛產生的必備條件。EMs的疼痛涉及神經系統(tǒng)、免疫細胞、炎癥反應及激素作用，是一種包含神經源性疼痛、炎癥性疼痛、內臟-內臟痛覺過敏的混雜性疼痛，并且受激素水平的調節(jié)。

3.2神經生長因子與子宮內膜異位癥

NGF是一種具有神經元營養(yǎng)和促神經突起生長雙重生物學功能的神經細胞生長調節(jié)因子，對中樞及周圍神經元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達均具有重要的調控作用。有研究證實EMs患者在位子宮內膜存在NGF和神經纖維的異常高表達，且與疼痛的嚴重程度有關[2]。本研究證明，體外培養(yǎng)EMs患者在位子宮內膜間質細胞有NGFmRNA及其蛋白的表達。NGF可以使異位病灶周圍正常組織的神經纖維向異位病灶內生長，誘導P物質(SP)、降鈣素基因相關肽(CGRP)、神經肽等致痛物質的生成，刺激末梢神經纖維，產生疼痛。本研究也表明，雌激素能夠刺激EMs患者ESC的 NGFmRNA及其蛋白的分泌。EMs患者在位子宮內膜的神經纖維的產生受性激素特別是雌激素的調控，雌激素可刺激NGF及其受體的表達，改變NGF及TrkA的分布格局[3]，進而誘導神經纖維的萌生，導致持續(xù)性疼痛的產生。應用拮抗雌激素的口服避孕藥治療EMs后，子宮內膜及肌層的NGF表達均明顯下降，神經纖維也顯著減少，從而緩解了痛經癥狀，說明雌激素可通過調節(jié)NGF的表達介導疼痛的產生。

3.3環(huán)氧化酶-2與子宮內膜異位癥

COX-2是花生四烯酸(AA)代謝過程中調節(jié)前列腺素(PGs)合成的一種重要的限速酶，主要參與炎癥反應、疼痛信號的傳遞及腫瘤的發(fā)生發(fā)展。EMs患者子宮內膜COX-2的表達與疼痛相關[4]。本研究證明，體外培養(yǎng)EMs患者子宮內膜間質細胞有COX-2 mRNA和蛋白的表達，并且雌激素能夠促進COX-2的分泌。COX-2水平的升高促進前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)的產生增加，而PGE2既是重要的炎癥介質又是重要的致痛因子，它能增強血管通透性，增加血流，能激活神經元增加神經末梢的痛覺敏感性，它還是芳香化酶的重要激活蛋白，這便形成了一個持續(xù)產生E2和COX-2-PGE2的正反饋循環(huán)，從而引起EMs疼痛[5]。而特異性的COX-2抑制劑可明顯減輕EMs的疼痛[6]。

3.4 阻斷核因子-κB與子宮內膜異位癥

NF-κB作為信號轉導途徑中的樞紐，在機體的免疫反應和炎癥反應，以及細胞的生長調控等方面調節(jié)基因的轉錄。在細胞靜息狀態(tài)時，NF-κB與它的抑制因子I-κB結合，以無活性形式存在于細胞質中，當受到外界刺激時I-κB解離，NF-κB活化進入細胞核內，啟動靶基因的表達。PDTC可以抑制NF-κB的活化和向細胞內轉移，阻斷NF-κB傳導途徑的信號傳導。

NF-κB可通過調節(jié)多種靶基因的表達，參與免疫和炎癥反應、增殖和抗凋亡反應、黏附和侵襲反應等，從而促進EMs的發(fā)生、發(fā)展[7]。有研究表明，在健康婦女的子宮內膜組織中，NF-κB處于低激活狀態(tài)，而在EMs病灶中，NF-κB的活性明顯增加，阻斷NF-κB信號通路可以有效地抑制EMs的發(fā)展，一些抑制NF-κB通路的藥物已被證明可以有效地減少EMs相關的癥狀[7]。本研究表明，應用PDTC可以使雌激素誘導的NGF、COX-2 mRNA和蛋白生成減少，說明雌激素通過NF-κB途徑誘導NGF和COX-2的生成，NGF和COX-2基因啟動子上存在NF-κB結合位點，活化的NF-κB入核后啟動相應基因的轉錄和翻譯，刺激神經纖維和炎癥反應，導致EMs疼痛。但抑制NF-κB信號通路后，并沒有完全阻斷雌激素的促進作用，表明除了NF-κB信號通路外可能還有其他的信號通路參與此過程。

EMs是癥狀依賴性疾病，其治療應以減輕癥狀為主，在藥物及手術治療均不理想的今天，采取新的治療方法顯得格外重要。對EMs相關疼痛的產生機制及其治療方法仍需不斷進行研究。需要注意的是，完全、持續(xù)阻斷NF-κB信號通路又將導致免疫缺陷和健康細胞的凋亡[1]。盡管如此，抑制NF-κB信號通路的激活在治療EMs中仍有著其良好的應用前景，可能成為EMs疼痛治療的新策略。

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[專業(yè)責任編輯：呂淑蘭]

Effect of estrogen on the synthesis of NGF and COX-2 and corresponding signal transduction pathway in eutopic endometrial stromal cells of patients with endometriosis

LIU Xin1, WANG Hua-li2, WANG Yue-yang2, JIANG Meng2

(1.WomanandChildren’sHospitalofAnshanCity,LiaoningAnshan114000,China;2.DalianMaternalandChildHealthCareHospital,LiaoningDalian116000,China)

Objective To observe the effect of estrogen (E2) on synthesis of nerve growth factor (NGF) and cycloxygenase-2 (COX-2) in eutopic endometrial stromal cells (ESC) of patients with endometriosis (EMs) and the variation of NGF and COX-2 synthesis in ESC after blocking NF-κB signaling pathway and to investigate the possible signal transduction pathway of estrogen in EMs patients. Methods The eutopic ESC of EMs patients were separated and cultured in vitro. After processed with 10-8mol/L E2(E2group) or 25μmol/L PDTC+10-8mol/L E2(E2+PDTC group) for 24 hours, the synthesis of NGF and COX-2 protein as well as mRNA levels variation in eutopic ESC were detected by Western blot and reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) technology.Results The expression of NGF, COX-2 protein and mRNA in E2group were higher than those in the control group, and the differences were statistically significant (tvalue was 4.745, 6.317, 3.465 and 5.443, respectively, allP<0.05). The expression of NGF, COX-2 protein and mRNA in E2+PDTC group were lower than those in E2group, and the differences were statistically significant (tvalue was 3.675, 5.319, 7.132 and 8.514, respectively, allP<0.05), but they were higher than those in the control group with statistical significance (tvalue was 3.526, 4.733, 4.261 and 5.513, respectively, allP<0.05). Conclusion In vitro, E2can promote the expressions of NGF and COX-2 protein in eutopic ESC of EMs patients. PDTC can partially inhibit this effect. It indicates that NF-κB signal transduction pathway is involved in regulation of E2on NGF and COX-2 in eutopic ESC of EMs patients. Blocking and regulating the activity of NF-κB signal transduction pathway may provide new strategies for the treatment of EMs.

endometriosis (EMs); 17β-estradiol (E2); nerve growth factor (NGF); cyclooxygenase-2 (COX-2); NF-κB signal transduction pathway

2015-07-06

大連市科技計劃資助項目(編號：20110659)

劉 鑫(1986-)，女，醫(yī)師，碩士，主要從事婦科臨床工作。

王化麗，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.01.018

R711.7

A

1673-5293(2017)01-0051-03