王興玲，賈 琪，劉艷麗，劉 景，郝大勇，申春艷，趙文杰

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖中心 鄭州 450052

兩種冷凍方法對(duì)牛卵巢組織竇前卵泡活性的影響*

王興玲△，賈 琪，劉艷麗，劉 景，郝大勇，申春艷，趙文杰

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖中心 鄭州 450052

△女，1962年2月生，博士研究生，主任醫(yī)師，研究方向：生殖醫(yī)學(xué)，E-mail:wangxl208@126.com

程序化冷凍；玻璃化冷凍；竇前卵泡；活性

目的：探討兩種冷凍方法對(duì)牛卵巢組織竇前卵泡活性的影響。方法：取新鮮的牛卵巢組織隨機(jī)分為新鮮對(duì)照組、程序化冷凍組和玻璃化冷凍組，分別加入Liberase DH酶消化，然后挑取竇前卵泡并分類計(jì)數(shù)，用calcein AM以及ethidium homodimer對(duì)竇前卵泡進(jìn)行熒光染色,鑒定竇前卵泡的活性。結(jié)果：3組各級(jí)卵泡的數(shù)量及分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.765)；與新鮮對(duì)照組(91%)相比，程序化冷凍組和玻璃化冷凍組竇前卵泡中未受損卵泡所占比例(80%和78%)略有降低(P=0.012)。3組中所占比例占優(yōu)勢的始基卵泡中未受損卵泡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.079);與新鮮對(duì)照組相比，兩冷凍組初級(jí)卵泡中未受損卵泡率有所降低(P<0.05),但兩冷凍組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：程序化冷凍法和玻璃化冷凍法均能較好地保存卵巢組織竇前卵泡的活性。

目前通過輔助生殖技術(shù)保存女性癌癥患者生育能力的方法主要有3種，即卵母細(xì)胞冷凍、胚胎冷凍和卵巢組織冷凍[1-2]。卵母細(xì)胞冷凍和胚胎冷凍往往需要患者通過超促排卵來獲取較多的卵母細(xì)胞，以提高其冷凍的效率。但超促排卵會(huì)引起患者體內(nèi)雌激素水平升高，可能加重其病情同時(shí)延遲癌癥的治療；且對(duì)月經(jīng)尚未來潮的青春期患者進(jìn)行超促排卵治療尚存在倫理方面的爭議。因此對(duì)于青春期前、激素依賴性腫瘤及化療不能延后的女性癌癥患者，卵巢組織冷凍復(fù)蘇移植是目前惟一可選擇的生育能力保存方式[3-4]。然而,有研究[5]表明卵巢組織移植有可能將原腫瘤灶重新植入體內(nèi)；而竇前卵泡周圍有基底膜包圍，因此移植竇前卵泡可能是一個(gè)更安全的選擇[6]。目前冷凍保存卵巢組織的方法有兩種：程序化冷凍法和玻璃化冷凍法。其中，程序化冷凍是冷凍卵巢組織的常規(guī)方法[7]，而玻璃化冷凍能較好地保存卵巢組織內(nèi)的卵泡以及其分泌功能[8]。Rahimi等[9]研究表明玻璃化冷凍并移植卵巢組織后細(xì)胞凋亡率高于程序化冷凍組，然而更多的研究者[10-11]就形態(tài)完整的卵泡和凋亡率之間比較并未發(fā)現(xiàn)二者之間的區(qū)別。該研究通過程序化冷凍法和玻璃化冷凍法冷凍牛卵巢組織，解凍后分離竇前卵泡，用熒光染色評(píng)估其活性，并與新鮮對(duì)照組比較，以探討兩種冷凍方法對(duì)卵巢組織竇前卵泡活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 二甲基亞砜(Sigma公司)，PBS、不含鈣鎂的PBS(DPBS)(Gibco公司)，細(xì)胞活性/細(xì)胞毒性試劑盒(Molecular Probes公司)，Liberase DH(Roche公司)，人血清白蛋白(HSA)、取卵-胚胎處理液(G-MOPS)(Vitrolife公司)，終止液(DPBS+體積分?jǐn)?shù)10%HSA)，冷凍液(0.4 mL HSA+1.0 mL DMSO+8.6 mL G-MOPS)，玻璃化冷凍液及解凍液試劑盒(KITAZATO公司)。

1.2 標(biāo)本收集與處理 牛剖腹后，立即無菌取卵巢，用生理鹽水沖洗3遍后放入生理鹽水中，于冰盒中、4 h內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

用生理鹽水再次沖洗牛卵巢組織2次，除去卵巢周圍組織以及血管和髓質(zhì)，將處理好的卵巢皮質(zhì)剪成0.5 cm×0.8 cm×0.3 cm的組織塊，并隨機(jī)分為新鮮對(duì)照組、程序化冷凍組和玻璃化冷凍組，每組5塊。將新鮮對(duì)照組的組織塊加入Liberase DH酶消化，然后挑出竇前卵泡計(jì)數(shù)并行熒光染色，將程序化冷凍組和玻璃化冷凍組組織塊分別冷凍，14 d后復(fù)蘇，同法消化和進(jìn)行熒光染色并分級(jí)計(jì)數(shù)。卵泡分級(jí)參照文獻(xiàn)[12]：始基卵泡為卵母細(xì)胞周圍包繞一層扁平的前顆粒細(xì)胞;初級(jí)卵泡為卵母細(xì)胞周圍包繞一層立方形的顆粒細(xì)胞;次級(jí)卵泡為卵母細(xì)胞周圍包繞兩層或兩層以上立方形的顆粒細(xì)胞;竇狀卵泡為卵母細(xì)胞周圍包繞兩層以上的顆粒細(xì)胞,卵泡內(nèi)有竇腔形成。將挑出的竇前卵泡培養(yǎng)于100 μL的DPBS(含2 μL的calcein AM和5 μL的ethidium homodimer)中，在37 ℃黑暗環(huán)境中放置45 min,然后在熒光顯微鏡下觀察卵泡的活性并分為4類。未受損卵泡：卵子和顆粒細(xì)胞均存活；輕微受損卵泡：死亡顆粒細(xì)胞的比例<10%；中度受損卵泡：顆粒細(xì)胞有10%～50%受損；死亡卵泡：卵子或是>50%的顆粒細(xì)胞死亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù),計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組竇前卵泡的分布情況 3組共隨機(jī)挑出竇前卵泡484個(gè)，其外觀呈圓形或卵圓形，卵泡外膜完整；其中始基卵泡263個(gè)(54%)，初級(jí)卵泡177個(gè)(37%)，次級(jí)卵泡44個(gè)(9%)，未見竇狀卵泡。3組竇前卵泡分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 3組竇前卵泡的分類 個(gè)(%)

χ2=1.839，P=0.765。

2.2 3組竇前卵泡的活性情況 竇前卵泡的活性分類見圖1。新鮮對(duì)照組未見中度受損卵泡，程序化冷凍組和玻璃化冷凍組僅見少量中度受損卵泡。與新鮮對(duì)照組相比，程序化冷凍組和玻璃化冷凍組未受損卵泡所占比例有所降低，輕微受損卵泡和死亡卵泡所占比例升高，結(jié)果見表2。3組未受損卵泡的分類比較見表3。由表3可知，3組中所占比例占優(yōu)勢的始基卵泡中未受損卵泡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與新鮮對(duì)照組相比，兩冷凍組初級(jí)卵泡中未受損卵泡率有所降低，但兩冷凍組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

V1：未受損卵泡；V2：輕微受損卵泡；V3：中度受損卵泡；V4：死亡卵泡。圖1 熒光染色后熒光顯微鏡下竇前卵泡的活性分類(×400)

χ2=12.901，P=0.012。

表3 3組竇前卵泡分類中未受損卵泡所占比例的比較 個(gè)(%)

*：與新鮮對(duì)照組相比，P<0.05；△：次級(jí)卵泡在竇前卵泡中所占比例低，未行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 討論

卵巢組織的冷凍方法包括程序化冷凍法和玻璃化冷凍法。程序化冷凍法使用低濃度冷凍保護(hù)劑，在程序冷凍儀的控制下緩慢降溫脫水，避免細(xì)胞內(nèi)冰晶形成。玻璃化冷凍法是近年來新興的冷凍方法，該方法應(yīng)用高濃度冷凍保護(hù)劑，使其充分滲透到細(xì)胞內(nèi)，提高胞漿黏稠度，并快速降溫，使細(xì)胞玻璃化，減少甚至避免細(xì)胞內(nèi)外冰晶形成。但目前兩種冷凍方法的優(yōu)劣仍然還有爭議。

目前國內(nèi)研究大多是通過組織學(xué)檢測評(píng)估不同冷凍方法對(duì)竇前卵泡形態(tài)的影響。該研究通過程序化冷凍法或玻璃化冷凍法冷凍牛卵巢組織后，用酶解法消化卵巢組織，分離出竇前卵泡，用熒光探針calcein AM和ethidium homodimer進(jìn)行活力染色，從而觀察程序化冷凍法和玻璃化冷凍法對(duì)竇前卵泡活性的影響。研究結(jié)果顯示，新鮮對(duì)照組、程序化冷凍組和玻璃化冷凍組隨機(jī)挑出的竇前卵泡的數(shù)量和分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；熒光染色后可見，新鮮對(duì)照組未受損卵泡所占比例稍高于兩冷凍組，輕微受損卵泡和死亡卵泡也較兩冷凍組少，說明冷凍解凍過程中，卵巢組織受到一定的損傷。由表1知竇前卵泡中始基卵泡所占比例最高，3組均在50%以上。結(jié)合表3結(jié)果可知，3組始基卵泡中未受損卵泡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明冷凍對(duì)始基卵泡活性的影響較小，這與Fabbri等[13]研究的冷凍對(duì)顆粒細(xì)胞的影響較大，體積小、代謝率低、顆粒細(xì)胞少的始基卵泡冷凍效果較好一致。此外，研究結(jié)果還顯示，新鮮對(duì)照組初級(jí)卵泡中未受損卵泡率較兩冷凍組高，分析原因?yàn)槌跫?jí)卵泡和次級(jí)卵泡的體積較始基卵泡大，顆粒細(xì)胞多，所以在冷凍時(shí)更易發(fā)生損傷。由于卵巢皮質(zhì)內(nèi)含有大量的始基卵泡，同時(shí)始基卵泡比其他卵泡更能耐受冷凍過程，冷凍后存活率高，所以今后對(duì)始基卵泡的生長發(fā)育進(jìn)行研究將有廣闊的前景。

此外，程序化冷凍組和玻璃化冷凍組始基卵泡和初級(jí)卵泡中未受損卵泡率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明兩種冷凍方法均能較好地保存卵巢皮質(zhì)中竇前卵泡的活性，這與Sanfilippo等[10]研究的兩種冷凍方法對(duì)卵巢組織內(nèi)竇前卵泡形態(tài)以及凋亡的影響的結(jié)果一致。

但是該研究僅限于觀察冷凍復(fù)蘇后竇前卵泡的存活情況，未對(duì)竇前卵泡進(jìn)行體外培養(yǎng)，在今后的研究中，作者擬將竇前卵泡移入由藻酸鹽基質(zhì)凝膠構(gòu)成的三維培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)，進(jìn)一步觀察程序化冷凍和玻璃化冷凍對(duì)竇前卵泡生長發(fā)育的影響，從而進(jìn)一步地評(píng)估兩種冷凍方法對(duì)竇前卵泡發(fā)育潛能的影響。

綜上所述，程序化冷凍和玻璃化冷凍卵巢組織后分離出的竇前卵泡的活性雖稍低于新鮮對(duì)照組，但均能較好地保存卵巢組織內(nèi)竇前卵泡的活性。

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(2016-04-18收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Influence of 2 freezing methods on preantral follicular viability of bovine ovarian tissue

WANGXingling,JIAQi,LIUYanli,LIUJing,HAODayong,SHENChunyan,ZHAOWenjie

ReproductiveCenter,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

program freezing;vitrification freezing;preantral follicle;viability

Aim: To investigate the influence of 2 freezing methods on the preantral follicular viability of bovine ovarian tissue. Methods: Pieces of fresh bovine ovarian tissue were randomly allocated into fresh control group, program freezing group and vitrification freezing group; ovarian tissue was digested by Liberase DH, then randomly picked preantral follicles and counted.Follicular viability was assessed by double fluorescent labelling with calcein AM and ethidium homodimer staining.Results: There were no significant differences in the number or distribution of preantral follicles among the 3 groups(P=0.765).Compared with the fresh control group(91%), the percentage of undamaged follicles in the preantral follicles was slightly lower in the program freezing group(80%) and vitrification freezing group(78%)(P=0.012). There were no significant differences in the rate of undamaged follicles in primordial follicles which were superior in the number(P=0.079); the rate of undamaged follicles in primary follicles in the 2 freezing groups was slightly lower than that in the fresh control group(P<0.05), but the differences between the 2 freezing groups were not significant(P>0.05) .Conclusion: The 2 freezing methods both can better maintain the viability of preantral follicles.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.018

*河南省國際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目 152102410060

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