劉 瑩，王圓圓,賈文青，倪 然，張 輝，王 靜#，周 舫

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001

肺癌患者血清p16、FHIT、APC基因甲基化檢測(cè)*

劉 瑩1)，王圓圓1),賈文青1)，倪 然1)，張 輝1)，王 靜1)#，周 舫2)

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001

#通信作者，女，1958年11月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：肺癌發(fā)病機(jī)制和早期預(yù)警，E-mail:wangjing@zzu.edu.cn

肺腫瘤；p16；FHIT；APC；甲基化

目的：檢測(cè)肺癌患者血清中抑癌基因p16、FHIT、APC的甲基化，探討它們?cè)诜伟┌l(fā)生和診斷中的臨床價(jià)值。方法：收集120例原發(fā)性肺癌患者(肺癌組)、46例肺良性疾病患者(對(duì)照組)的血液標(biāo)本，采用甲基化PCR方法檢測(cè)2組患者血清p16、FHIT、APC基因甲基化。采用logistic回歸分析肺癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素,計(jì)算上述基因甲基化診斷肺癌的準(zhǔn)確率。結(jié)果：肺癌組血清中p16、FHIT、APC的甲基化率分別為37.5%、34.2%、31.7%，對(duì)照組中分別為6.5%、13.0%、10.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。Logistic回歸分析提示p16、FHIT基因甲基化均為肺癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,OR(95%CI)分別為7.509(2.160～26.099)、2.927(1.096～7.814)(P均<0.05)。p16、FHIT、APC基因甲基化單項(xiàng)診斷肺癌的準(zhǔn)確率分別為53%、49%、47%，3種基因甲基化聯(lián)合診斷肺癌的準(zhǔn)確率為87%，優(yōu)于單項(xiàng)指標(biāo)。結(jié)論：p16、FHIT基因甲基化均為肺癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素;聯(lián)合檢測(cè)p16、FHIT、APC甲基化可提高肺癌診斷的準(zhǔn)確性。

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康。近年來(lái)肺癌的發(fā)生率有逐漸升高的趨勢(shì)，在我國(guó)肺癌已居城市人口惡性腫瘤死因第一位[1]。DNA甲基化是真核生物體內(nèi)的一種基因內(nèi)源性修飾，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，使胞嘧啶變成5-甲基胞嘧啶，進(jìn)而影響其基因的表達(dá)[2]。如果這種現(xiàn)象發(fā)生在抑癌基因，則造成抑癌基因功能缺失或下降[3]。作者對(duì)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2013年至2014年收治的120例肺癌及46例肺良性疾病患者血清中抑癌基因p16、脆性組氨酸三聯(lián)體基因(fragile histidine triad gene，F(xiàn)HIT)、APC的甲基化進(jìn)行了檢測(cè)，探討上述3種基因甲基化和肺癌發(fā)生的關(guān)系以及在肺癌診斷中的價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 肺癌組納入標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性肺癌，均有組織病理學(xué)診斷依據(jù)，按國(guó)際抗癌聯(lián)盟公布的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期；排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤，有手術(shù)或放、化療史。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)收集原發(fā)性肺癌患者120例，其中男67例，女53例；年齡36～71歲，中位年齡56歲；120例中肺鱗癌52例，肺腺癌36例，小細(xì)胞肺癌32例；根據(jù)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ、Ⅱ期53例，Ⅲ、Ⅳ期67例。對(duì)照組為肺良性疾病46例，男30例，女16例；年齡14～67歲，中位年齡47歲；肺膿腫14例，支氣管擴(kuò)張18例，肺結(jié)核14例。病例資料的收集均征得受試者知情同意。

1.2 主要試劑和儀器 血清基因組DNA提取試劑盒及引物(廣州生物工程公司)， GoTaq qPCR Mastermix(美國(guó)Promega公司)，PTC200型PCR擴(kuò)增儀(MJ Research公司)，MX3000P PCR儀(STARTAGENE公司)。

1.3 甲基化PCR檢測(cè) 2組均采集5 mL清晨空腹靜脈血，-80 ℃保存。使用時(shí)嚴(yán)格按血清基因組DNA提取試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行。參照文獻(xiàn)[1-2]設(shè)計(jì)p16、FHIT、APC基因甲基化特異性序列(M)和非甲基化特異性序列(U)。引物合成由廣州生物工程公司完成。見表1。甲基化PCR：①DNA的亞硫酸氫鹽的處理。DNA加入NaOH，水浴30 min充分變性后，加入氫醌和pH為5的亞硫酸氫鈉溶液。通過(guò)以上處理，已被甲基化的胞嘧啶不會(huì)發(fā)生改變，而未甲基化的胞嘧啶則會(huì)變?yōu)槟蜞奏?。修飾后的DNA可用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增。②PCR擴(kuò)增。對(duì)甲基化及非甲基化的p16、FHIT、APC基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下：2×SYBY qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，分別將4 μL亞硫酸氫鹽處理后的DNA模板加入反應(yīng)體系中，并加水至20 μL；甲基化的陽(yáng)性對(duì)照為經(jīng)過(guò)甲基轉(zhuǎn)移酶和亞硫酸氫鹽處理的胎盤DNA，陰性對(duì)照為正常外周血淋巴細(xì)胞DNA，空白對(duì)照為H2O。

表1 p16、FHIT、APC基因的甲基化引物

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 17.0分析數(shù)據(jù)。將單因素分析中有意義的變量納入多因素非條件logistic回歸模型，篩選影響肺癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素；應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)公式計(jì)算3種基因甲基化單獨(dú)或聯(lián)合(串聯(lián))檢測(cè)肺癌的敏感度、特異度、準(zhǔn)確率。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 DNA甲基化的分析 結(jié)果見圖1。

2.2 單因素分析設(shè)定變量與肺癌發(fā)生的關(guān)系 結(jié)果見表2。由表2可知,肺癌組血清中p16、FHIT、APC的甲基化率分別為37.5%、34.2%、31.7%，對(duì)照組中分別為6.5%、13.0%、10.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 Logistic回歸分析 設(shè)定是否患肺癌為因變量，將單因素分析中有意義的因素納入logistic回歸分析，采用逐步回歸法(納入標(biāo)準(zhǔn)為0.05，排除標(biāo)準(zhǔn)為0.10)建立模型，變量賦值如下：肺良性疾病=0，肺癌=1；p16、FHIT和APC基因未甲基化=0，甲基化=1。結(jié)果(表3)顯示，p16、FHIT基因甲基化均為肺癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

2.4 3種基因甲基化診斷肺癌的臨床評(píng)價(jià)結(jié)果 見表4。

1：DNA Marker；U：無(wú)甲基化的基因；M：甲基化的基因；NL：正常外周血淋巴細(xì)胞DNA；IVD：陽(yáng)性對(duì)照；H2O：空白對(duì)照。圖1 FHIT(A)、p16(B)及APC(C)甲基化檢測(cè)結(jié)果

表3 Logistic回歸分析

表4 3種基因甲基化診斷肺癌的臨床評(píng)價(jià) %

3 討論

FHIT含編碼組氨酸三聯(lián)體蛋白的功能區(qū)，位于染色體3p14．2區(qū)，且易斷裂。FHIT是許多類型腫瘤的抑癌基因[4]。Wu等[5]進(jìn)行了一項(xiàng)薈萃分析顯示：在高加索人群和亞洲人群中，非小細(xì)胞肺癌組織中FHIT基因甲基化水平明顯高于非腫瘤組織；FHIT基因甲基化也與吸煙史、病理類型、生存率相關(guān)。該研究中肺癌患者血清中FHIT基因甲基化率高于肺良性疾病患者，且FHIT基因甲基化是肺癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素，提示FHIT基因甲基化可能參與了肺癌的發(fā)病機(jī)制。

抑癌基因APC位于人類染色體5q21，含21個(gè)外顯子,長(zhǎng)度為8 535 bp，是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路中的重要基因。該抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)過(guò)度甲基化使基因表達(dá)缺失或活性下降，導(dǎo)致Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路異常。Schneikert等[6]研究表明APC基因啟動(dòng)子高甲基化可見于結(jié)直腸癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤。Feng等[7]的研究表明，APC基因啟動(dòng)子甲基化與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、吸煙有關(guān)，與年齡無(wú)關(guān)；APC基因在肺癌組織中的甲基化率為22.0%，在非腫瘤組織中為14.6%。Ding等[8]研究認(rèn)為空氣中的有害物質(zhì)PM10、PM2.5和NO2濃度增高，APC基因甲基化率增加。Huang等[9]對(duì)151項(xiàng)研究進(jìn)行的薈萃分析提示，在鑒別肺鱗癌和腺癌中，APC的特異性和敏感性均高于CDKN2A、MGMT和RUNX3基因。該研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清中APC基因甲基化率高于肺良性疾病患者，但并非肺癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素。

p16在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4的抑制劑。p16基因的甲基化是腫瘤發(fā)生發(fā)展中常見的改變。研究[10]表明，p16基因甲基化率在肺癌患者中明顯增高，與TNM分期無(wú)關(guān)，p16啟動(dòng)子甲基化率在腺癌患者高于鱗癌患者，在吸煙患者高于不吸煙者。該研究結(jié)果顯示p16基因甲基化是肺癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素，提示p16基因甲基化亦參與了肺癌的發(fā)病機(jī)制。

另外，該研究結(jié)果還顯示，p16、FHIT、APC基因甲基化單項(xiàng)檢測(cè)肺癌的準(zhǔn)確率分別為53%、49%、47%，3種基因甲基化聯(lián)合診斷肺癌的準(zhǔn)確率為87%，優(yōu)于單項(xiàng)檢測(cè)。

綜上所述，p16、FHIT基因甲基化均為肺癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素;聯(lián)合檢測(cè)p16、FHIT、APC甲基化可提高肺癌診斷的準(zhǔn)確性，從而為肺癌的診斷及評(píng)估提供參考。

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[2]王威,馮曉蕾,段曉冉,等.基于3種基因啟動(dòng)子甲基化聯(lián)合端粒長(zhǎng)度構(gòu)建肺癌診斷支持向量機(jī)模型[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2015,50(4):462

[3]王威,段曉冉,譚善娟,等.基于3種基因啟動(dòng)子甲基化聯(lián)合端粒長(zhǎng)度構(gòu)建肺癌篩查神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2014,49(2):176

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(2016-05-30收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Determination of p16, FHIT and APC gene methylation in serum from patients with lung cancer

LIUYing1),WANGYuanyuan1),JIAWenqing1),NIRan1),ZHANGHui1),WANGJing1),ZHOUFang2)

1)DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofOccupationalHealth,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

lung neoplasm;p16;FHIT;APC;gene methylation

Aim: To study the roles of p16, FHIT and APC methylation in carcinogenesis and diagnosis of lung cancer.Methods: Methylation PCR was used to detect the methylation of p16,FHIT,and APC genes in 120 cases of lung cancer(lung cancer group) and 46 cases of benign lung disease(control group). The risk factors for lung cancer were researched by logistic multivariate analysis, and the accuracy of gene methylation in the diagnosis of lung cancer was assessed.Results: The rates of p16, FHIT, and APC gene methylation in lung cancer group were 37.5%,34.2% and 31.7%, those in control group were 6.5%,13.0%, and 10.9%, and the differences were significant(P<0.05). Logistic multivariate analysis suggested that p16 and FHIT gene methylation was risk factor for lung cancer(P<0.05)[OR(95%CI)=7.509(2.160-26.099),2.927(1.096-7.814)].The accuracy of p16,FHIT,APC gene methylation single use for diagnosis of lung cancer was 53%,49%,47%, while the accuracy of the 3 gene combined detection was 87%, better than single detection.Conclusion: The methylation of p16 and FHIT gene may be related to the carcinogenesis of lung cancer,and the com bined detection may improve the accuracy of diagnosis of lung cancer.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.014

*河南省教育廳科技攻關(guān)項(xiàng)目 12A320020；河南省科技廳創(chuàng)新人才項(xiàng)目 154200510015

R735.2